Rekombinant Adeno ilişkili Viral Vektörlerin Üretimi ve Titering

Özet

Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAVs) vektörleri için giderek daha değerli hale geliyor In vivo

Özet

Son yıllarda rekombinant adeno-ilişkili viral vektörler (AAV) hayvanlarda in vivo çalışmalar için giderek daha değerli hale gelmiştir ve insan klinik çalışmalarda da şu anda test edilmektedir. Wild-tip AAV bir patojen olmayan Parvoviridae aile üyesi ve doğal olarak çoğaltma eksikliği. Geniş transdüksiyon profili, düşük immün yanıtın yanı sıra, bu vektörler ile elde güçlü ve kalıcı transgen ekspresyonu in vitro ve in vivo gen teslimat için popüler ve çok yönlü bir araç yaptı. rAAVs kolay ve ucuza laboratuvarda üretilen ve onların uygun bir güvenlik profili dayalı olabilir, genellikle düşük bir güvenlik sınıflandırması verilmiştir. Burada, biz, hem de AAV1 ve AAV2 kapsid proteinleri içeren kimerik rAAVs üretim ve titering için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu sözde kimerik vektörlerin kullanımı gibi yüksek titreleri hisse senetleri (AAV1) ve saflaştırma olarak her iki ebeveyn serotiplerinin faydalarını bir araya getirenafinite kromatografisi (AAV2). Bu AAV serotipleri AAV serotipleri en iyi incelenen ve bireysel geniş bir infeksiyözitesi deseni var. Burada açıklanan kimerik vektörler AAV1 ve AAV2 bulaşıcı özelliklere sahip olmalı ve bu nöronlar, iskelet kası, pankreas, diğerlerinin yanı sıra böbrek de dahil olmak üzere geniş bir ürün yelpazesi, dokuların enfekte olması beklenebilir. Burada anlatılan yöntemi, heparin sütun arıtma kullanan, bir yöntem, sezyum klorür degrade yoluyla santrifüj gibi diğer arıtma yöntemleri, daha yüksek bir viral titresi ve temiz viral hazırlık vermek inanıyordu. Ayrıca, bu vektörlerin hızlı ve kolay bir şekilde üretilen bulaşıcı parçacıkların sayısını doğru okuma titre nasıl açıklanmaktadır.

Protokol

Aşağıdaki protokol özetleyen bir örnek için Şekil 1'e bakınız.

Emniyet Not: monte viral parçacıkların temas halinde olan tüm malzeme Virkon ® çözümü ya da diğer uygun bir dezenfektan ile dezenfekte edilmesi gerekir.

1. Plazmid DNA stoklarının hazırlanması (~ 2 gün)

1. Aşağıdaki plazmid ¹ gereklidir:
   • pRV1 - AAV2 Tecrübe ve kap dizileri İçeren
   • pH21 - AAV1 Tecrübe ve kap dizileri içeren
   • pFdelta6 - Adenovirüs yardımcı plazmid
   • AAV2 ambalaj sinyalleri (ters terminali tekrarlar, ITRs) ile çevrili rekombinant ifade kaset içeren plazmid AAV
2. PFdelta6 kısmi silinmesini önlemek için Stbl2 yetkili hücrelerde yetişen olmalıdır, pRV1 ve pH21 DH5alpha yetkili hücreleri yetiştirilebilir. AAV plazmid kısmi silmeler DH5alpha hücrelerinde meydana gelmesi halinde Stbl2 hücreleri yetiştirilebilir.
3. Plazmid DNA yüksek kaliteli ve RNA yabancı maddelerden arındırılmış olmalıdır. Plazmidler bütünlüğü için aşağıdaki digests kullanarak taranabilen:
   • pRV1 - Özet XbaI ile 7.5 kb ve 3.8 kb bantları vermek
   • pH21 - sindirmek EcoRI ile 4.5 kb bant, 2.8 kb ve 0.2 kb vermek
   • pFdelta6 - HindIII ile sindirimi 5.5 kb bant, 3 kb, 3 kb, 2.3 kb ve 1.5 kb vermek

2. (3 gün 2) transfeksiyon İnsan Embriyonik Böbrek 293 (Hek293) hücreleri hazırlanması

1. Tabak iki adet 80% konfluent 150 cm ² şişeler içine Hek293 hücreleri beş 15 cm çapında Nunc doku kültürü yemekleri. Hücreler 70 -% 80 (yaklaşık 48 saat sonra kaplama) transfeksiyon önce konfluent. % 10 fetal buzağı serumu ve 100 U / ml penisilin / 100 mikrogram / ml streptomisin içeren düşük glikoz ile standart Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM) Kültür hücreleri.
2. 3 saat önce transfeksiyon DMEM kaldırın ve Iscove değiştirin'Ler modifiye Dulbecco'nun orta (IMDM) fetal buzağı serumu,% 5 içeren.

3. Viral plazmid Transfeksiyon (transfeksiyon ~ 1 saat, 3 gün inkübasyon)

1. (5 x 15 cm doku kültürü plakaları) virüsü tek bir toplu iş için aşağıdaki hazırlayın:
   • Plazmid 62.5 mikrogram AAV
   • 125 mg pFdelta6
   • 31.25 mg pRV1
   • 31.25 mg pH21
   • 1650 ul 2.5 M CaCl ₂
   • 12 ml dH ₂ O
2. 50 ml'lik bir tüp içine sınıfı 2 doku kültürü kaput steril filtre transfeksiyon karışımı.
3. Çözüm vorteks olsa da, hızlı bir şekilde 13 ml 2 x Hepes tamponlu salin (pH 7.05). 50 ml tüp kapağını değiştirin ve 15 saniye boyunca girdap devam. 1 dakika 45 saniye bekletilir, ince beyaz bir çökelti oluşturması gerekir.
4. , Yavaşça, her biri 15 cm doku kültürü çanak transfeksiyon çözüm 5 ml ekleyin. Swirl plakaları karıştırın ve inkübatör dönmek.
5. 16 saat sonra transfeksiyon IMDM orta kaldırmak ve DMEM ile değiştirin.

4. (2 saat) hücreleri, Parçalama ve rAAVs hasadı

1. Transfeksiyon 72 saat sonra, hücre kültürü plakaları, ortamı çıkarın ve atın. Tüm atık Virkon ® çözümü ya da diğer uygun bir dezenfektan ile tedavi edilmelidir.
2. Hücreler yavaşça sıcak 1x fosfat yıkama tamponlu salin (PBS, pH 7.4).
3. Her plaka için 25 ml sıcak PBS ekleyin ve bir hücre kazıyıcı ile hücreler yavaşça çıkarın. 50 ml tüpler süspansiyon toplayın.
4. 10 dakika boyunca 800 xg'de Pelet hücreleri.
5. NaCl 150 mM, 20 mM Tris, pH 8.0 süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet atın, doku kültürü plaka başına 10 ml kullanın. Iki adet 50 ml tüpler böler.
6. DH ₂ O% 10 sodyum deoksikolatın taze bir çözüm hazırlayın Bu 1.25 ml,% 0.5 'lik son konsantrasyon için her tüp ekleyin. Ml başına 50 adet nihai konsantrasyonu Benzonase nükleaz ekleyin. Tüp iyice karıştırın.
37 ° ° C'de 1 saat süreyle.
7. 15 dakika boyunca 3000 xg santrifüj hücresel enkaz çıkarın. Taze 50 ml tüp geçiş, tüm hücre enkaz (Adım 5'e bakınız), heparin sütun engellenmesini önlemek için çıkarıldığından emin olun. Bu aşamada devam etmeden önce, numuneler -20 ° C'de saklanabilir. Biz enfektivite bir azalma olmadan örnekleri -20 ° C'de birkaç hafta boyunca saklanan var.

5. Heparin sütun rAAVs, arıtma (2 - 3 saat)

1. Çözümler akış, 5.2 - 5.4 için gerekli adımları dakikada 1 ml sütun ile peristaltik bir pompa kullanarak Kur HiTrap heparin sütun. Hiç hava kabarcığı heparin sütuna tanıtıldı sağlamak için önemlidir.
2. 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 ile sütun dengelenmesi.
3. 50 ml virüs çözümü için sütun uygulayın ve akmasına izin verin.
4. 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 ile sütun yıkayın.
5. 5 ml şırınga kullanarak sütun w yıkama devam1 ml 300 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 ile takip ITH 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0,. Flow-through atın.
6. Uygulayarak sütun 5 ml şırınga ve hafif basınç Zehir virüs kullanma:
   • 1.5 mL 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0
   • 3,0 ml 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0
   • 1.5 mL 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0
   • 15 ml santrifüj tüpüne bu toplayın.

6. Konsantrasyon ve rAAVs steril filtrasyonu (1 saat)

1. 100.000 molekül ağırlığı kesme Amicon ultra-4 santrifüj filtre üniteleri kullanarak vektör Konsantre. 2 dakika için 2000 xg (oda sıcaklığında) 4 ml sütun eluat konsantratör ve santrifüj içine yükleyin. Kalan virüs çözümü ve tekrar santrifüj flowthrough ve yeniden konsantratör atın. Konsantre hacmi yaklaşık 250 ul olmalıdır. Konsantre hacmi göre anlamlı derecede daha fazla ise, akış t iptalaşma ve bir dakikalık adımlarla hacmi yaklaşık 250 ul kadar santrifüj devam etmektedir.
2. PBS 250 ul 500 ul son bir hacim için virüs ve konsantratör kaldırmak.
3. 13 mm çapı 0,2 mikron şırınga filtresi süzülür vektör. Vektör ° C 'ye kadar gerekli -80 aliquoted ve saklanan olmalıdır.

7. Viral stoklarının Titering (3 gün)

Bu, bir muhabir gen ya da immunocytochemically saptanabilir bir gen ürünü sürüş Hek293 hücreleri aktif bir organizatörü gerektirir. Hek293 hücreleri diğer hücre hatları veya primer hücre kültürleri ile uyumlu değildir üreten bir vektör.

1. % 50 confluent - 40 böylece Hek293 hücrelerin ekim tarafından 18 poli-L-lisin kaplı cam lamelleri ya da 18 kuyu Nunc oda slaytlar hazırlayın. Kre-bağımlı rAAVs titrasyonu için, stabil bir şekilde ifade Cre recombinase ² Hek293 hücreleri kullanır.
2. Seri d her iyi enfekteAAV vektör (Şekil 2A) ilutions. Başına 3 kuyu seyreltme kullanın. Biz rutin olarak her bir kuyu için doğrudan virüs eklemek.
3. 72 saat on dakika oda sıcaklığında (son konsantrasyon% 2 PFA veren) orta,% 4 paraformaldehid bir eşit hacimde (PFA) ekleyerek Hek293 hücreleri düzelttikten sonra.
4. DH ₂ O ve kapak hücre PBS içinde üç kez yıkayın, durulayın.
5. Seyreltme faktörü yüksek olan üç kuyu, transduced hücrelerinin sayısını ancak hala enfekte olan hücreleri içeren bu ortalama ve mikrolitrelik başına enfeksiyöz birim (Şekil 2B) sayı vermek seyreltme faktörü ile çarpın.

8. Beklenen Sonuçlar

Hek293 hücreleri gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) Şekil 2B gösterilen bir virüs kodlama ile transduced. Biz genellikle mikro litre başına yaklaşık 6 x 10 ⁶ enfeksiyöz partiküller tutarlı titreleri elde. Biz rutin stereotaksik inje için bu vektörleryetişkin kemirgen beyin içine ction. Bu bölgeye özgü gen ekspresyonu ² için güçlü bir teknik sağlar. Kre-transgenik fareler ² hedef bölgeye Cre recombinase bağımlı rAAVs enjekte hücre tipi seçici gen ekspresyonu ile bu bölgede özgüllük birleştirmek için. Şekil 2C-E yetişkin parvalbumin-Cre transgenik farelerin ³ farklı beyin bölgeleri içine eGFP kodlama Cre bağımlı rAAVs stereotaksik enjeksiyonları örnekler gösterir.

Şekil 1 rAAV üretimi için protokol şematik gösterimi. 1) Hek293 hücre kaplama ve 70 büyüdü - 80% izdiham. 2.) AAV ve yardımcı plazmid hazırlanan ve Hek293 hücre içine transfekte. 3.) Orta transfeksiyon sonra DMEM 16 saat geri ve Hek293 hücreler 56 saat başka bir kültüre. 4.) Hek293 hücre hasat ve parçalanmış olan. c rAAV vektörlerin hücre enkaz ayrılırentrifugation. 5.) Viral partiküller konsantrasyon ve sterilizasyon önce heparin sütunları ile temizlenir. 6) Hek293 hücreleri 24 kuyucuğu büyüdü ve bulaşıcı birimlerinin sayısını belirlemek için AAV vektör seri dilüsyonları ile enfekte.

Şekil 2 Titering ve rAAV1 / 2 in vivo uygulama. Viral titresi ölçmek için Hek293 hücreleri (A) Kurulum. RAAVs seri dilüsyonları ile Hek293 hücreleri transduced. C, enfekte olmamış kontrolü; N, sulandırılmamış viral stokunun 1 ul. (B) Hek293 hücreleri eGFP ifade rAAVs etkilemiştir. (CE) Viral eGFP ifade sınırlıdır Cre ifade Cre-aktif rAAVs stereotaksik enjeksiyondan sonra parvalbumin-Cre transgenik farelerin farklı hedef bölgelerdeki nöronlar. Örnekler görüntüleri (C) retiküler talamus ve globus pallidus GFP immünoreaktivite, (D) dentat girus ve hipokampus (E) CA1 bölge. DG, DEntate girus, RT, retiküler talamik nükleus, GP, globus pallidus. Ölçek barlar: B, 500 mm; C, 100 mm; D, 100 mm; E, 500 mm.

Tartışmalar

rAAV vektörlerin in vivo hayvan çalışmaları için giderek daha değerli hale gelmektedir. Burada, yaygın uygulama bu yararlı vektör virüs üretimin yüksek maliyetli dış kaynak şirketleri kaçınarak kolaylaştırabilir, üretmek rAAVs için basit ve ucuz bir protokol tanımlanmıştır. Protokolü (referans 1) eşit oranları ⁴ her iki ebeveyn serotipleri kapsid proteinleri içeren kimerik rAAV1 / 2 vektörler üretimi açıklar. RAAV vektörlerin heparin sütunlar bağlanarak arıtma AAV2 kapsid proteinleri ifade dayanmaktadır, ancak, burada belirtilen AAV1 daha diğer serotipleri ile kombine edilebilir. Ayrıca, AAV6 azaltılmış bir yakınlığa sahip olmakla birlikte, heparin bağlamak için bildirilmiştir, ve potansiyel olarak bu ^prosedürü 5,6 kullanarak heparin sütunları ile temizlenmiş olabilir . Diğer serotipler heparin sütun elüsyon ^5,7 için farklı konsantrasyonlarda NaCl gerektirdiğini, ancak ^{unutulmamalıdır.}

Ambalaj rAAV genomların 5.2 kb ⁸ paketleme verimliliği keskin bir düşüş ile 4.1 ve 4.9 kb arasında en iyi olduğu gösterilmiştir. Transgen ekspresyonu hücre tipi özel düzenleme genellikle küçük AAV parçacıklar içinde yer öğeleri oyunculuk büyük cis ile elde edilir bu yana ambalaj sınırı, rAAV sisteminin en büyük dezavantajı olarak kabul edilebilir. Biz yerine PBS ekleyerek adım 6.3 'de belirtildiği gibi, bir 500 ul toplu, 250 ul kadar konsantre ayrı viral toplu birleştirerek AAV ambalaj sınırına yakın paket genler çalışmadan kaynaklanan gibi düşük titreye toplu üstesinden gelmek için. Güvenilir hücre türüne özgü transdüksiyon Cre sürücü fareler ve ambalaj sınırına uzanan önlemek için koşullu rAAV kaset (aşağıya bakınız) birleştirerek elde edilebilir.

Unutmayın ki, bu protokol yüksek t üretimi kolay takip talimatları vermek için çalışır ikeniter rAAV, heparin afinite kromatografisi ile saflaştırılması için AAV2 kapsid protein moieties varlığını gerektirir. Daha AAV2 diğer serotipleri alternatif prosedürleri kullanarak ⁹ arındırılmalıdır. Heparin sütun arınma bir avantajı sezyum klorür degrade ¹⁰ kullanılarak üretilen bu daha yüksek bulaşıcılık oranını AAV vektörler üretmek olduğuna inanılmaktadır. Ancak, bu yöntem bazı dezavantajları da vardır. Örneğin, heparin bağlayan diğer proteinleri de saflaştırılmış viral stokta mevcut olabilir. Heparin saflaştırılmış vektörlerin tropizm vektör titresi ^10, özellikle ²⁰ eksitatör veya inhibitör nöronlar (Şekil 2) ya hedef yaklaşımı etkilemiş olabilir AAV-aracılı transgen ifade Cre indüklenmiş aktivasyon istihdam ve titre-bağımsızdır. Heparin sütun arıtma için alternatif bir kullanımı daha yüksek bir viral titresi ve saf hazırlık üreten bir iodixanol yoğunluk gradiyenti kullanımı,¹⁰ sezyum klorür degrade. Bu yöntem ayrıca,% 99 oranında ^saf 11 daha büyük bir vektör üretmek için heparin sütun arıtma ile kombine edilebilir . Bu nedenle, dikkatli bir göz, kendi özel alt uygulama için en iyi olan viral arıtma yöntemi olarak bireysel gruplar tarafından alınması gerekir.

Bu protokol ile ilgili en sık karşılaşılan sorun, düşük viral titresi. Deneyimlerimize göre bu durum genellikle, düşük transfeksiyon verimlilik, virüs veya heparin sütunlarından elüsyon takip edilebilir. Tüm transfeksiyon malzemelerin transfeksiyon önce oda sıcaklığında olmalıdır ve her laboratuar için en uygun koşulları bulmak için testi transfections yapılmalıdır. Transfeksiyon diğer yöntemler gibi lipofectamine, son derece verimli, ancak çok pahalı olabilir. Ayrıca, heparin sütun elüsyon çözümleri konsantrasyonu ve pH, heparin sütun witho virionlar tam olarak yürütülmesi için kritik öneme sahiptirut zarar. Bir diğer önemli nokta, ambalaj hücreleri, doku kültürü yemekleri yüzey iyi davranmanız gerekir. Hücreler işlem sırasında bazı aşamada ayırmak deney ve defrost hücrelerin yeni bir flakon sonlandırmak için tavsiye edilir.

Kemirgenler transgen ekspresyonu uzay-zamansal kontrol doğru anatomik hedefleme ve hayvan gelişim aşamasında kolayca elde edilir. Verimli AAV-aracılı gen transferi, in ^utero 12,13 gösterilmiştir . Yetişkin beyin, stereotaksik enjeksiyondan sonra rAAV parçacıkları ile enfekte alanı sadece viral titresi değişiklikleri değil, aynı zamanda enjeksiyon parametrelerini değiştirerek çok daha geniş alanları çok küçük bir hedef bölgeler, ayarlanabilir. Bu hacim ve hız enjeksiyon ve virüs süspansiyonu ¹⁴ poliol mannitol dahil içerir. Mannitol ayrıca, çeşitli sistemik rAAV enjeksiyon ¹⁵ sonra dokuların bir enfeksiyon geliştirmek için kullanılabilir ^</> Destek.

RAAV (yaklaşık 4.7 kb) paketleme kapasitesi muhtemelen bu viral vektörlerin ifade edilebilir genler açısından en sınırlayıcı faktör. Ancak, son çalışmalar, bu kısmen ayrı rAAV vektörlerin büyük bölme genler veya ifade kasetleri üstesinden gelmek ve virionlar aynı ^hücrede 16 enfekte gen ekspresyonu başlatırken, bir köprü dizisi tanıtan olduğunu göstermiştir . RAAV vektörler tarafından taşınan genlerin ekspresyon düzeyleri de büyük ölçüde kendi kendine ücretsiz rAAV vektörler kullanarak ¹⁷ artabilir. RAAV vektörlerin Stereotaksik enjeksiyon, bölgeye özgü bir şekilde gen ekspresyonu inducing için hızlı, ucuz ve güçlü bir yöntem sağlar. ^2. nesil RNA girişim stratejileri ile kombinasyon halinde ¹⁸ rAAVs da bölgeye özgü gen vurmak için kullanılan olabilir. rAAVs devre ve hücre tipi ulaşmak için Cre-transgenik fareler ya da hücre tipi özel rehberleri ile kombine edilebilirÖrneğin tet sistemi ile montaj rAAVs virüs aracılı gen ekspresyonu ^22,23 üzerinden geçici denetimi ekler, yüksek uzaysal çözünürlüğü ^2,19-21 ile genetik manipülasyonlar izin özgü gen ekspresyonu Bu örnekler, bu vektörlerin Kombinatoryal muazzam potansiyeli göstermek ve rAAV tabanlı çalışmalar gelecek yıl içinde hızlı bir artış tahmin ediliyor.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Amicon ultra santrifüj filtreleri	Millipore	UFC810024	100.000 MWCO
Benzonase nükleaz	Sigma-Aldrich	E1014
Dulbeco modifiye Eagle ortamında (DMEM)	Invitrogen	10567014	% 10 FCS ve 10 ünite / ml penicillin/100 mcg / ml streptomisin ile Ek
Hek293 hücreleri	Amerikan tipi kültür toplama	CRL-1573	Geçit az 30
Hepes tamponlu salin	Sigma-Aldrich	51558
HiTrap Heparin kartuşu	Sigma-Aldrich	54836
Iscove modifiye Dulbecco'nun orta	Invitrogen	12440-053	% 5 FCS ile Ek
Sodyum deoksikolatın	Sigma-Aldrich	D5670	Her seri için taze solüsyon
15 cm Doku kültürü yemekleri	Fisher Scientific	157150
Stbl2 yetkili hücre	Invitrogen	10268-019
Virkon ® çözümü	Fisher Scientific	NC9821357	Atarak drenaj önce bir gecede dezenfekte bırakın