Nanoprecipitation Tekniği Diblock Polimerik Nanopartiküller formülasyonu

Özet

Bu makale diblock co-polimerler kullanarak polimer bazlı nanopartiküller sentezlemek için nanoprecipitation yöntem açıklanır. Biz diblock sentezi co-polimerler, nanoprecipitation tekniği ve potansiyel uygulamalar ele alınacaktır.

Özet

Nanoteknoloji harnessing ölçekte nanometre (nanopartiküller) parçacıkların eşsiz özelliklerini içerir nispeten yeni bir bilim dalıdır. Nanopartiküller boyutları, bileşimi ve yüzey kimyası dikkatli bir şekilde kontrol edilebilir kesin bir biçimde tasarlanmış olabilir. Bu onların kargo temel özellikleri, çözünürlük, yayınım, biodistribution, sürüm özellikleri ve immünojenite gibi bazı değiştirmek için benzeri görülmemiş bir özgürlük sağlar. , Kuruluşundan bu yana, nanoparçacıkların, ilaç dağıtım, görüntüleme ve hücre ^biyolojisi 1-4 da dahil olmak üzere birçok alanda, bilim ve tıp kullanılmıştır. Ancak, tam olarak algılanan teknik bir engel nedeniyle "nanoteknoloji laboratuvarları dışında kullanılmıştır değildir. Bu makalede, potansiyel uygulamaları çok geniş bir yelpazesi olan bir polimer esaslı nanoparçacık platformu sentezlemek için basit bir yöntem açıklanmaktadır.

Hidrofobik bir etki alanı ve hidrofilik etki alanı hem de bir diblock co-polimer sentezlemek için ilk adım. PLGA ve PEG model polimerler olarak kullanarak, EDC / NHS kimya ⁵ (Şekil 1) kullanarak bir konjugasyon tepki nitelendirdi. Ayrıca polimer arınma süreci tartışacağız. Sentezlenmiş diblock co-polimer hidrofilik-hidrofobik etkileşimler yoluyla nanoprecipitation sürecinde nanopartiküller içine kendi kendine bir araya getirebilirsiniz.

Açıklanan polimer nanoparçacık çok yönlü. Nanoparçacık hidrofobik çekirdek ilaç dağıtım experiments6 için az çözünen ilaç taşımak için kullanılabilir. Ayrıca, nanopartiküller, DMSO gibi bir çözücü gerektirir wortmannin az çözünür moleküler biyoloji reaktifleri, toksik solventlerin sorunun üstesinden gelebilir. Bununla birlikte, DMSO hücreleri için toksik ve deney ile müdahale edebilirsiniz. Bu kötü çözünen ilaçlar ve reaktifler etkili minimal toksisite ile polimer nanopartiküller kullanılarak teslim edilebilir. Polimer nanoparçacıkların da floresan boya ile yüklenir ve hücre içi ticareti çalışmaları için kullanılmaktadır. Son olarak, bu polimer nanopartiküller yüzey PEG yoluyla ligandlar hedefleyen konjuge olabilir. Bu hedef nanopartiküller ^7-10 veya hücreleri belirli epitoplar etiket kullanılabilir.

Protokol

1. PLGA-b-PEG polimerin sentezi

1. Terminali karboksilat grupları ile poli (D, L-lactide-co-glycolide) (PLGA) (PLGA-karboksilat) 5mM bir konsantrasyon PLGA (malzeme bölümünde belirtildiği gibi) için herhangi bir çözücü içinde çözülür. PLGA nazik karıştırma bu konsantrasyonda çözünmüş olabilir.
2. NHS (moleküler ağırlığı 115,09) ve EDC (molekül ağırlığı 191,7) 25mm bir konsantrasyon PLGA çözelti içinde çözülür. (EDC ve NHS PLGA kıyasla 5 kat aşan bir stokiyometrik eklenir). PLGA-karboksilat EDC ve NHS ekleyerek yaklaşık 1 saat için nazik karıştırma PLGA-karboksilat çözüm için PLGA-NHS dönüştürülür.
3. Reaksiyon ürünü PLGA-NHS yıkama solüsyonu metanol eklenerek çöktürülür. Metanol yaklaşık 10 kat fazla hacim çözüm eklenir. Çözüm çökelti PLGA-NHS ve supernatant atın (EDC ve NHS izlerini ortadan kaldırır. Metanol ile yıkama Bu işlem en az üç kez tekrarlanır xg 2000 santrifüj edilir.
4. PLGA-NHS pelet yıkama solüsyonu tüm izlerini silmek için 30 dakika süreyle vakum altında kurutulur.
5. PLGA-NHS pelet PLGA çözmek için başlangıçta kullanılan aynı konsantrasyonda aynı çözücü yeniden çözülür. Heterobifunctional PEG (amin-PEG-karboksilat) sonra 5mM bir konsantrasyon PLGA çözüm eklenir (1:1 stokiyometrik oranı). Karışımı bir çözüm sürekli karıştırarak 24 saat inkübe edilir.
6. 24 saat sonra, reaksiyon ürünü PLGA-b-PEG blok kopolimer aşırı yıkama solüsyonu metanol eklenerek çöktürülür. Üç kez Yukarıda da belirtildiği gibi yıkama ve santrifüj işlemi tekrarlayın. Bu, tüm aşırı girmemiş PEG kaldıracaktır.
7. PLGA-b-PEG blok kopolimer, vakum altında kurutulur.

2. PLGA-b-PEG nanoparçacık hazırlık

Yüzeyde PEG ile kaplı PLGA çekirdekli Nanopartiküller bu diblock kopolimerler hazırlanabilir. Bir dizi farklı hidrofobik ilaçlar gibi nanopartiküller kapsüllü olabilir. Floresan bileşikler nanopartiküller kapsüllü olabilir veya PLGA konjuge ve böylece bu nanopartiküller floresan görüntüleme için kullanılabilir olabilir.

Nanoprecipitation yöntem özellikle kapsüllü olması istenen kargo son derece doğal hidrofobik nanopartiküller yapmak için kullanılır.

1. PLGA-b-PEG blok kopolimeri ve uyuşturucu / kargo (kapsüllü) PLGA çözünür olan herhangi bir çözücü içinde çözülür. PLGA asetonitril, DKMP, tetrahidrofuran, aseton veya etil asetat da dahil olmak üzere pek çok ortak çözücüler tarafından çözülebilir. Nanoparçacık özelliklerini etkiler olarak solvent seçimi kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, uygun bir çözücü bu adımda kullanılmalıdır.
2. Polimer / ilaç karışımı daha sonra yaklaşık 3 mg / ml son bir polimer konsantrasyonu vererek su karıştırarak 3-5 birimlere damla damla eklenir. (Şekil 2)
3. Karıştırarak nanopartiküller self-assembly oluşturmak için izin ve organik çözücü izlerini kaldırmak için düşük basınç altında 2 saat boyunca devam eder.
4. Hasat ve saflaştırma: nanopartiküller sonra yıkanmış bir Amicon filtresi (MWCO 20KDa) kullanarak 10 dakika için 2.700 x g santrifüj konsantre ve PBS içinde sulandırılmış. Bu tüm un-sürüklenen bir ilaç / kargo kaldırır. Temel biyofiziksel boyut gibi nitelendirmeler, yüzey yükü ve ilaç yükleme verimliliğini nanoparçacıkların özelliklerini daha iyi anlamak için yapılabilir.

3. Depolama

Dondurma-kurutma nanopartiküller ¹¹ depolamak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Dondurma-kurutma, uzun vadeli istikrar ^için 12 nanopartiküller fiziksel ve kimyasal özellikleri koruyacaktır . Dondurarak kurutma işlemi parçacıklar üzerinde strese neden ve formülasyon istikrarsızlaştırmak, cryo-koruyucu (donma stresinden koruma) ve LYO-koruyucu (kurutma stres koruma) yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu koruyucu seçim saklama süresi ¹³ istenilen uzunluğa göre belirlenir.

1. Dondurarak kurutma, toplam katılaşma, Tg donma noktasının altına örnek vardır.
2. Kuruma adım, buz süblimasyonu kaldırılır. Sıcaklık ve basınç etkili bir dondurarak kurutma işlemi ulaşmak için optimize edilmelidir.

4. Temsilcisi sonuçları:

PLGA-b-PEG Di-blok kopolimeri Karakterizasyonu

Polimerlerin başarılı konjugasyon onaylamak için farklı teknikler kullanılabilir. PLGA-b-PEG kompozisyon, 400 MHz 1H nükleer manyetik rezonans (NMR) ile karakterize edilebilir. Jel geçirgenlik kromatografisi (GPC) oluşan ürün Moleküler ağırlığı (PLGA-b-PEG) tarafından kontrol edilebilir. PLGA-b-PEG molekül ağırlığı distribution eğrisi ve elüsyon zaman PLGA ve PEG tek başına farklı olmalıdır. Birlikte, bu tekniklerin oluşan ürün karakterize ve konjugasyon reaksiyon başarılı olup olmadığını belirlemek gerekir.

PLGA-b-PEG Karakterizasyonu nanopartiküller

Partikül boyut ve boyut dağılımı, dinamik ışık saçılması ile ölçülebilir. Nanoprecipitation süreç içinde farklı parametreler partiküllerin boyutunu etkileyebilir. Başlangıçta kullanılan polimerler (PLGA ve PEG) Moleküler ağırlıkları da tanecik boyut dağılımı etkisi. Geçiş elektron mikroskobu (TEM) de Şekil 3'te görüldüğü gibi nanopartiküllerin boyut dağılımı ve yapısını onaylamak için kullanılabilir. Partikül boyutu aralığı nm aralığında genellikle. Düzensiz boyut dağılımı ile büyük parçacık boyutları ya nanoprecipitation yöntemi ihtiyaçlarını optimizasyonu konjugasyon reaksiyon veya bir hata olduğu anlamına gelebilir. Buna ek olarak, yüzey zeta potansiyel ZetaPALS tarafından ölçülebilir.
Uyuşturucu / kargo yükleme verimliliği standart HPLC ile belirlenebilir.

Parçacıklar organik çözücü ve HPLC çözülür ilaç / kargo (Şekil 4) absorbansı ölçmek için yapılabilir. Nanopartiküller sabit miktarları 30 Slayt-A-Lyzer MINI Diyaliz üniteleri diyalize bilinen yerlerde ilaç salım kinetik çalışmada yapılabilir. Sabit zaman aralıklarında içerik, diyaliz ünitesinde toplanan ve eşit miktarda organik çözücü nanopartiküller çözmek için eklenir. HPLC, uyuşturucu / kargo içeriği ölçmek için bu numuneler üzerinde yapılır.

Şekil 1. EDC / NHS kimya

Şekil 2. Polimerik nanopartiküller hazırlamak için Nanoprecipitation yöntemi. PEG-PLGA diblock ve parçacık yüklü olması uyuşturucu ya da kargo içeren (acetonitrile veya DCM) bir çözücü organik çözelti 3-5 mL H ₂ O karıştırarak damla damla eklenir

Şekil 3. Nanopartices Transmisyon Elektron Mikroskobu PEG-PLGA TEM görüntü wortamin içeren nanopartiküller. Fosfotungstik asit, bir kontrast madde olarak kullanılmıştır.

Şekil 4. PBS içinde diyaliz sonra nanopartiküller Paklitakselin nanoparçacık ilaç kontrollü salım Release. Kaydetti zamanda parçacıklar diyaliz kaset çıkarıldı asetonitril'de solublized. Çözüm HPLC ile ölçüldü. İki ayrı nanoparçacıkların birçok karşılaştırıldı.

Tartışmalar

Diblock co-polimerler kullanarak nanoprecipitation yöntem polimer nanopartiküller mühendisi basit ve hızlı bir yöntem temsil eder. Nanopartiküller az çözünebilir bileşiklerin teslimat için kullanılabilir bir hidrofobik çekirdeğin oluşmaktadır. Bir hedefleme ligand potansiyeli daha fazla konjugasyon için benzer parçaları sağlarken hidrofilik yüzey tabakası mükemmel sulu çözünürlük sağlar.

Lipozomlar dahil olmak üzere birçok nanoparçacık platformları, polimer...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
EDC	Thermo Scientific	22980	Konjugasyon Reaktif
NHS	Thermo Scientific	24500	Konjugasyon Reaktif
amin-PEG-karboksilat	Laysan Bio Inc.	NH2-PEG-CM-5000	Polimer (herhangi bir PEG MW, 5000 kullanabilir miyim burada listelenir)
PLGA-carbxylate	Lactel	B6013-2	Polimer
Diklorometan (DKMP)	Sigma-Aldrich	34856	Çözücü
Asetonitril>% 99 saflıkta	Sigma-Aldrich	34851	Çözücü
Metanol>% 99 saflıkta	Sigma-Aldrich	34860	Yıkama