Prenatal Fareler gelen Hipokampal Nöronlar izolasyonu ve Kültürü

Özet

Bu yüksek bir besleyici hücre glial tabakanın kullanımı olmaksızın prenatal fare beyinlerinden hipokampal nöronlar saflaştırılmış kültürü için bir protokolü sağlar.

Özet

Sıçan ve fare hipokampal nöronların primer kültürlerinde yaygın nörobiyoloji hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmak için kullanılır. Bireysel nöronlar yalıtma ve büyüyerek, araştırmacılar hücresel kaçakçılığı, hücresel yapı ve biyokimyasal çeşitli teknikler kullanarak bireysel protein lokalizasyonu ile ilgili özelliklerini analiz edebiliyoruz. Bu tür deneylerin sonuçları, hafıza ve öğrenme nöral temelini ele teorileri test etmek için önemlidir. Ancak, deney Bu formlardan kesin sonuçlar diğer beyin hücre türlerine göre asgari kirlenme ile nöronal kültürlerin büyümeye yeteneği esas alınır. Bu protokol, biz kirletici hücre tipleri (yani astrositler) en aza indirerek sağlıklı nöronların büyüme optimize etmek embriyonik hipokampus doku nöron büyüme ve dikkatli diseksiyon için özel olarak tasarlanmış ortamları kullanın. Embriyonik fare hipokampus doku di için örnek boyutu nedeniyle benzer bir kemirgen doku daha izole etmek daha zor olabilirssection. Biz embriyonik günde 19 (E19) fare yavrularının gelen hipokampus ayrıntılı diseksiyon teknikleri gösteriyor. Bireysel hücre en az zarar sağlarken bir kez hipokampal doku izole edilir, nöronal hücre nazik ayrışma tripsin ve birleştirici dokudan ayrı hücreleri için tasarlanmış mekanik bir bozulma seyreltik konsantrasyonu ile elde edilir. Kesinti kullanılmak üzere pipet nasıl hazırlanacağını ayrıntılı bir açıklaması dahildir. Optimal kaplama yoğunlukları başarılı hücre kültürü üst düzeye çıkarmak için immuno-floresans protokoller için verilmektedir. Protokol fare hipokampal dokudan nöronal hücre kültürü için hızlı bir (yaklaşık 2 saat) ve verimli bir yöntem sağlar.

Protokol

1. Harvest Set-up önce

1. Nöron hasat için prenatal yavrular üretmek için, 19 gün önce nöron izolasyon gün yetişkin farelerin arasında üreme planlayın. (C57BL / 6 farelerde yaşları 2-8 ay bu protokolü geliştirmek amacıyla çiftleşmelerin kullanılmıştır). Başarılı çiftleşme gebelik kadın, çarpıntı veya görsel onay vajinal fiş algılama tarafından teyit edilebilir.
2. Önce nöron izolasyon gün:
   1. Için immünfloresan uygulamaları, 3:1 Kollajen 1, Rat Kuyruk hafif bir kaplama ile 24-iyi plakasını kat cam lamelleri: poli-D-Lizin çözüm.
   2. Hücre kültürü uygulamaları için, 3:1 Kollajen 1, Rat Kuyruk hafif bir kaplama ile kaplamak uygun büyüklükte doku kültürü plastik eşya: poli-D-Lizin çözüm.
3. Gecede bir UV ışık altında bir doku kültürü kaputu ortaya çıkarılan plakalar dinlendirin.
4. Öncesinde steril Hank Dengesi Tuz Çözeltisi (HBSS) ile plakaları yıkayınkullanımı. Kaplı plakalar HBSS dolu ve karanlıkta 4 ° C'de bir haftaya kadar saklanabilir.

2. Doku Hasat

1. Primer hücre kültürleri büyüyen ve gibi, büyük dikkat en steril ortamda mümkün sağlamak için olunmalıdır zaman Sterilite her zaman bir faktördür. Steril teknik dikkat ile, bu protokol için nöral dokunun ilk diseksiyonu ve hasat kontaminasyon riskini en aza ile bir laminer akış kaput dışında tamamlanabilir. İlk hasattan sonra, sonraki tüm adımları hücre kültürü için nominal bir kaput içinde maksimum steril koşullar altında yürütülmelidir.
2. Dekapitasyon yoluyla yaklaşık 19 gün sonrası fertilizasyon bir hamile fare Euthanize. Anestezi (Stratmann, ve ark., 2010) beyin hücre ölümüne neden olduğu bilinmektedir olarak hamile kadın euthanize anestezi kullanılması tavsiye edilmez. Steril diseksiyon makas ve forseps kullanarak, orta-ventral tarafta bir açılış oluşturmakFare tamamen vücut boşluğu ortaya çıkarmak için. Araçlar alkol ve açık alev kullanarak sterilize edilebilir.
3. Prenatal yavru farenin vücut boşluğunda gerisinde yer alacak ve rahim içinde kolayca görünür olmalıdır. Otoklavlanmış steril forseps ile rahim açın ve yavrular çıkarın. Bir mikroskop altında steril gazlı bez üzerinde taze steril makas ve yer kaldırıldı kafa ile yavrular başını kesmek. Steril, otoklavlanmış araçlar alev alkol ve önce bir açık alev kullanılarak temizlenmeli ve kullanım sırasında olabilir.
4. Steril makas veya burun boynun arkasından yavru bir neşter, açık kafatası kullanma. Bu işlem normal vertebra forameni makas bir ucu ekleme ve daha sonra öne doğru ilerleyerek tamamlanabilir. Dikkatle forseps ile tüm beyin kaldırın. Steril gazlı bez beyin yerleştirin. Steril bir bistüri kullanarak, beyincik kaldırmak ve iki hemisfer (Şekil 1) içine ayırmak için beynin orta hat aşağı kesilirken .
5. Steril forseps ile hipokampus çevreleyen meninksler küçük bir bölümünü tutun ve yavaşça uzağa çekin. Bu hipokampus izole edilmeden önce meninksler kaldırmak için çok gerekli olmamasına rağmen, menenjlerin varlığında membran tokluk nedeniyle daha zor hipokampüsün Diseksiyon yapabilir. Her iki durumda da, hipokampus meninksler temizlendikten sonra daha açık bir şekilde görülecektir. Hipokampus yarımkürede ve ventral bükülür (Şekil 2) distal kısmında başlar kavisli bir yapıdır. Iç, içbükey, yan (kaudal) bir ventrikül karşı karşıya olduğu gibi, zaten ücretsizdir. Bu nedenle, hipokampus izole etmek için, tek bir dışbükey dış tarafı boyunca kesilmesi gerekmektedir. Diseksiyon sonra, yavaşça bir hücre kültürü başlık altında ısınmış (37 ° C) HBSS ile küçük bir doku kültürü çanak içine steril doku forseps ve transferi ile her hipokampi kaldırın. Beyin dokusu çok yavrular ile kombine edilebilir.

"> 3. Doku Ayrılma

1. 100 mm Doku Kültürü çanak steril HBSS 3 ml steril bir neşter, yavaşça kıyma beyin dokusu kullanma.
2. 15 ml konik tüp kıyılmış doku ve HBSS aktarın. HBSS 1.5 ml ve 5 mL total hacim% 0.25 tripsin çözeltisinin 0.5 ml ilave edilir.
3. Cap ve yavaşça tüp karıştırmak için 4-5 kez ters çevirin. Sindirilmiş dokusundan salınan DNA kabarcıklarına yapışmaz ve kıyılmış doku tüpün alt kısmında (Şekil 3) yerleşim yerine dalgalanmaya neden olacaktır kabarcıkları üreten kaçının.
4. Her 5 dakikada yukarıdaki gibi, 15 dakika 37 ° C'de tersini tüp hipokampus doku inkübe edin.
5. Doku tüpün dibe izin verir.
6. Dikkatle tüpün dibinde bozulmamış dokusu bırakarak, steril bir pipet kullanarak fazla çözüm kaldırın.
7. 5 dakika 37 ° C'de HBSS 5 ml doku pelet yıkayın. 3 kez toplam tekrarlanır. Doku tamamen yerleşmesine izinTüp sonraki yıkama adımı geçmeden önce her zaman alt.
8. Doku pelet gelen son yıkama çıkarın ve taze HBSS 2 ml ile değiştirin.

4. Nöron ufalama

1. Triturasyonun adımları başlamadan önce, ısı ile cilalanmış Pasteur pipetler hazırlamanız gerekir. Bir Bunson brülör kullanarak, pipet açıklığın çapı (Şekil 4b) hafifçe yuvarlatılmış olan boyutu ve pipet açılış kenarları yaklaşık 0.5 mm kadar alev içinde steril 9 inç Pasteur pipet ucu (Şekil 4a) tutun. Öğütme işlemine başlamadan önce tamamen soğumasını pipet izin verin.
2. Normal bir steril 9 inç Pasteur pipeti kullanarak, hafifçe dokunun 7 kez toplam öğütmek. Daha büyük doku parçaları, bu noktada, normal olarak ve önceden sonraki aşamaya hareketli tüpün dibe izin verilmelidir.
3. Taze bir steril 50 ml konik tüp süpernatant aktarın.
4. Kalan doku için, steril HBSS 2 ml ekleyin ve ısı ile cilalanmış Pasteur pipeti ile 5 kez toplam öğütmek.
5. Tüm kalan daha büyük bir doku parçaları tüpün dibe ve 4 ml ayrışmış nöronal hücrelerde toplam önceki süpernatanıyla süpernatan birleştirmek için olanak sağlar.

5.. Hücre Kaplama

1. Bir hemasitometre kullanarak dissosiye hücreleri hesaplama.
2. Genel bir kural olarak, bir kez hücre sayıları tespit edilmiştir, Kaplama sonrası oluşabilecek herhangi bir hücre ölümünü açıklamak için bu son sayısını% 20 çıkarmak.
3. Hücreler aşağıdaki önerileri kullanarak kaplama yapılabilir:
   Bir 24 kuyulu plakanın in lamelleri için - 6 x 10 ⁴ hücre / çukur 0.5 ml
   4 x 10 ⁵ hücre / 3 ml plaka - 60 mm Doku Kültürü plakalar için
   6 x 10 ⁶ hücre / 6 ml plaka - 100 mm Doku Kültürü plakalar için
4. Neurobasal Kaplama Medya belirtilen hacmi (Neurobasal uygun hücre sayıları karıştırınB27 Supplement içeren ortam [1 ml / 50 ml], 0.5 mM glutamin Çözelti, 25 uM Glutamat (Sn 147,13 g / mol), penisilin (10.000 ünite / ml) / streptomisin (10,000 ug / ml), [250 ul / ml 50] , 1mM HEPES (Bay 238,3 g / mol),% 10 Isı İnaktive Donör At serum) ve plakaları hücreleri ekleyin. Swirl plakaları hafifçe eşit hücreleri dağıtmak için. HI-Donör At Serum büyüme ilk 24 saat içinde hücreler zenginleştirmek için Kaplama Medya eklenir. Daha sonra hücreler serumdan sütten vardır ve her bir medya değiştirilmesini serum seri redüksiyon bir serumsuz ortamda döndürülür. Daha yüksek konsantrasyonlarda glutamat buraya eklenen daha düşük konsantrasyonlarda, nöronal hücre kültürü için toksik iken, non-nöronal hücrelerde ¹¹ arasında bağlanma inhibe olacağı da belirtmek gerekir. Ancak, sadece kültüründe ilk 24 saat için kaplama medya eklenmelidir ve daha sonra hücrelerin nörotoksisite önlemek için herhangi bir Besleme Medya dışında kaldı.
5. P_% 5 CO2 inkübatör bir gecede 37 ° C nöronlar, dantel.
6. Hücrelerinden ortam yarı hacme kaldırmak ve Neurobasal Besleme Ortam aynı hacimde (Neurobasal Media B27 Supplement içeren ile değiştirmek [1 ml / 50 ml], 0.5 mM glutamin Çözelti, penisilin (10.000 ünite / ml) / streptomisin (10,000 ug / ml) [250 ul / ml 50], 1 mM HEPES (Sn 238,3 g / mol.)
7. Nöronlar eski medya yarısı kaldırarak ve taze Neurobasal Besleme medya aynı hacmi ile değiştirerek her 4 günde bir beslenmelidir. Nöronal süreçleri Gün 1 (Şekil 5a) görünür olmasını ve 10. Gün (Şekil 5b) tarafından yaygın hale başlamalıdır.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Primer nöronal hücrelerin büyümesine ve kültürüne yeteneği nörobilim vazgeçilmez bir parçası haline gelmiştir. Primer kültürler, araştırmacı spesifik hücresel yollar analiz kimyasal modifikasyonu ve tedavi, hedef loc izinkontrollü bir ortamda alization ve büyüme modelleri. Bu işlemlerin çoğu hücre yanıtlarının belirli değişiklikleri görmenizi sofistike yöntem kullanmaktadır. Bu durumda, hipokampal nöronlar sağlam beyinde analiz etmek zor, imkansız değilse kanıtlayacak spesifik nöronal incelemek için kullanılır. Beynin belirli bölgelerinden nöronların yakın homojen nüfus hazırlanması beyin fonksiyonlarını incelemek için önemlidir. Bireysel nöronlar moleküler etkileri, bellek ya da öğrenme gibi yüksek mertebeden yolları ortaya koymaya vesile olabilir. Bu protokol glial hücre besleyici tabaka gerek kalmadan hipokampal nöronların nispeten saf kültürlerin, verir gibi, bu nöronların kolayca immunofloresan çalışmalar için kullanılmaktadır. Ancak, birden fazla organ hücre türleri içeren tüm primer kültürü ile olduğu gibi, daha az arzu edilen hücreler tarafından bazı kirlenme oluşabilir. Nöronal hücrelerin izolasyonu, glial hücreler tarafından kontaminasyon ortak bir sorun olabilir. Glial hücreler cbunların morfolojisi hedef nöronların (Şekil 6) önemli ölçüde farklıdır olarak kolayca kültür, mikroskopik üzerine tespit edilebilir. Glial hücre bulaşma etkisi kültürlerin planlanan kullanımına bağlıdır. Hücreler immün floresan inceleme için kullanılıyorsa bireysel nöronlar fotoğraflamak için çalışırken, glial kontaminasyon bir rahatsızlıktan başka bir şey olabilir. Nöronal kültürler biyokimyasal analiz için kullanılacak olan, ancak, gliyal hücreleri tarafından herhangi bir önemli kirlenme sonuçlar büyük değişiklikler neden olabilir. Glial hücre kontaminasyonu çözüm yolları Tartışma daha da özetlenmiştir.

Sonra nöronlar başarıyla izole ve kültür yetiştirilen edilmiş, tipik bir uygulama immüno-floresans teknikleri hücresel süreçleri incelemektir. Şekil 7 'de gösterildiği gibi, örneğin mitokondri olarak organellerinin, düzeltmek için önceden kültür ortamına ilave vital boyalar kullanılarak lekelenmektedir edilebiliration. Endojen hücresel proteinlerin standart immün floresans teknikleri (Şekil 8) kullanarak sabit hücrelerden görüntülenebilmekte. Bir kez nöronal hücrelerde sabittir, ilgi proteinler için özel antikorlar hücreye sokulabilir ve bu proteinlerin bir floresans mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir. Kültür nöronlar da nöronal işlevleri bireysel protein etkilerini incelemek için gerekli olan yolları araştırmacı sağlar. DNA Transfeksiyonlar, elektroporasyon veya viral transdüksiyon dahil olmak üzere çeşitli teknikler kullanılarak, proteinler nöronal hücrelerde (Şekil 9) aşırı eksprese edilebilir. Fazla dile getirdikleri proteinlerin etkilere tepki nasıl sinir hücreleri beynin yanıt verebilir nasıl doğrudan çıkarımlar var ve ilaç tedavileri için hücresel hedefler belirleme olanağı sunuyor olabilir. Deneyler bu tür ayrıntıları bu yazının kapsamı dışındadır giderler ama bu teknikle hazırlanan kültürleri aşağı-s geniş bir dizi için uygun olduğunu göstermektedir yoktream uygulamaları. Bununla birlikte, bu protokolünün genel basitlik yanı sıra, bu nöronal kültürler hazırlamak için gerekli olan kısa bir zaman periyodu, bu bugünün nörobilim laboratuar kullanım için ideal bir yöntem yapmaktadır.

Şekil 1. Prenatal fare beyin Diseksiyonu. İlk insizyon iki hemisfer ayrılarak beynin orta hat inmektedir.

Şekil 2. Prenatal fare beynindeki hippocampus yeri. Striatum, hipokampus görselleştirmek için kenara taşınır ve her yarımkürenin distal bölgede eğri "barbunya" tipi yapı tarafından not edilir.

Şekil 3. Tripsin çözüm hipokampal doku Ayrılma.

Şekil 4. Pasteur, iğne ucu hipokampal doku triturasyonun kullanılır. (A) Normal Pasteur, pipet. (B) Yangın cilalanmış Pasteur, pipet. Yuvarlatılmış kenarları not Pipet ve açılış boyutta yaklaşık% 50 azalma atın.

Şekil 5. Hipokampus nöron Bu prosedür ile NB Medya kaplama kullanılarak izole. (A) Hücre büyümesi 1 gün sonrası kaplama. Nöronal süreçleri Gün 1 sırasında görünür olmaya başlar. (B) Hücre büyümesi 10 gün sonrası kaplama, neurites dallı ve örtüşen.

Şekil 6. 7 gün boyunca yetiştirilen glial hücreleri ile kontamine ve organel işaretleyici MitoTracker Kırmızı CM-H2XRos (Invitrogen # M7515) ve transfe ile boyandı hipokampus nöronlipofektamin 2000 (Invitrogen # 11.668.019) kullanarak GFP-LC3 ile cted. Mitokondri bütün hücrelerdeki Bununla birlikte, sadece tek bir nöron başarılı bir flüoresan yapı ile transfekte edildi görülebilir. Glial hücreleri ile Kontaminasyon görselleştirmek zor nöronal süreçleri GFP-LC3 ifade analizini yapar.

Şekil 7. Hipokampus nöron 7 gün büyüdü ve organel işaretleyici MitoTracker Kırmızı CM-H ₂ XRos (Invitrogen # M7513) ile boyandı. Bu vital boyanın doku kültür hücre aktif mitokondri leke için kullanılır. Hücreler% 4 paraformaldehit / PBS içinde sabit ve floresan mikroskop görüntülendi. Mitokondride okside kadar boya kendisi olmayan floresan olduğunu. Aktif mitokondri nöronal süreci boyunca görülebilir.

Şekil 8. hipokampus nöron,% 4 paraformaldehit / PBS ve monoklonal anti-tubulin β antikor (Sigma # T0198) ile immün-boyandı ile sabitlenir. Primer antikor ardından, Oregon Green (Invitrogen # O11033) keçi-anti-fare sekonder antikoru etiketli eklendi ve floresan mikroskop ile görüntülendi.

Şekil 9. Hipokampus nöronal kültürler lipofektamin 2000 (Invitrogen # 11668019) kullanılarak inşa 5 gün süreyle yetiştirilir ve GFP-LC3β DNA ile transfekte edildi. Gün 7 anda, hücreler mikroskop kullanarak kendi dış membran dahil GFP tagged LC3β olarak görüntülenmiştir% 4 paraformaldehit / PBS ve aggresomes edildi kullanılarak tespit edildi. Aggresomes hücre gövdesi ve neurites çapında bulunmaktadır ve oklarla gösterilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Hipokampal kültürleri 20 yıldan fazla için moleküler biyolojide kullanılan edilmiştir. Prensip olarak ise, nöronal kültürler beyin herhangi bir kısmı ile yapılabilir, hipokampal kültürler hipokampus ^7'de sinir hücre nüfusun nispeten basit bir mimariye bağlı en popüler olduğu kanıtlanmıştır. Hipokampal kültürler genellikle geç dönem embriyonik dokudan yapılmıştır. Bu doku ayırmak kolaydır ve olgun beyin dokusu ¹ oranla daha az glial hücreler içerir. Embriyoni...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Satıcı	Katalog Numarası
Sıçan Kuyruk Kollajen 1	BD Biosciences	354236
Poli-D-lizin Çözelti	Chemicon	A-003-E
Hanks Balanced Salt Solüsyonu	Invitrogen	14175-095
Tripsin Çözüm (1X)% 0.25, sıvı	Invitrogen	15050-065
NeuroBasal Orta (1X) sıvı	Invitrogen	21103-049
B27 Supplement (50X) sıvı	Invitrogen	17504-044
Sıvı L-Glutamin 200 mM (100X)	Invitrogen	25030-149
Penisilin (10.000 ünite / ml) / streptomisin (10,000 ug / ml)	Invitrogen	15140-148
HI-Donör At Serum	Atlanta Biologicals	S12150H