JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Protokol
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Sepsis bir mikrobik enfeksiyon sonucu ortaya çıkan bir sistemik inflamatuvar yanıt sendromu ifade eder ve çekal ligasyon ve delme (CLP) diye adlandırdıkları bir cerrahi teknik ile simüle edilebilir. Burada tedavi ajanları için şifalı otlar taranması amacıyla CLP bağlı hayvan modelinde kullanılacak bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Sepsis bir mikrobik enfeksiyon sonucu ortaya çıkan bir sistemik inflamatuvar yanıt sendromu ifade eder. Bu eksojen bakteri toksini (endotoksemi) veya bakteriler (bakteriyemi) infüzyonu yanı sıra çekal ligasyon ve delme (CLP) 1-3 ile çekum cerrahi perforasyonu da dahil olmak üzere çeşitli teknikler, hayvanların rutin olarak simüle olmuştur. CLP perfore apandisit veya divertikülit insan klinik hastalığı taklit eden, bakteri dökülme ve periton boşluğu fekal kontaminasyon sağlar. Olarak nihai ölüm oranı tarafından yansıtılan sepsis şiddeti, çekal ponksiyonu 2 için kullanılan iğne boyutu değiştirilerek cerrahi olarak kontrol edilebilir. Insan sepsis 3 klinik seyri sırasında gözlemlediği gibi hayvanlar, CLP, kardiyovasküler metabolik ve immünolojik cevapta benzeri, bifazik hemodinamik indükler. Böylece, CLP modeli 1-3 Deneysel sepsis için klinik olarak en uygun modellerden biri olarak kabul edilir. </ P>

Çeşitli hayvan modellerinde deneysel sepsis patogenezine yatan karmaşık mekanizmaları aydınlatmak için kullanılmıştır. Sepsis öldürücü sonucu erken sitokinlerin aşırı birikimi 4-6 ve geç proinflammatuar mediatörleri (örn., HMGB1) 7 (örneğin, TNF, IL-1 ve IFN-γ gibi), kısmen ilişkindir. Erken proinflamatuar sitokinler ile karşılaştırıldığında, geç etkili mediatörler klinik uygulamalar için daha geniş bir terapötik pencereye sahiptir. Örneğin, CLP 24 saat sonra başlayan HMGB1-nötralize edici antikorlar gecikmeli yönetim, hala ölümcül sepsis geç bir arabulucu olarak HMGB1 kuran, öldürücülüğü 8,9 farelerin kurtardı. Geç etkili arabulucu olarak HMGB1 keşfi Geleneksel Çin Bitkisel Tıp kullanarak sepsis tedavilerin geliştirilmesi için soruşturma yeni bir alan başlattı. Bu yazıda, HM için bitkisel ilaç taranmasında CLP-indüklenen sepsis bir prosedür tarif ve kullanımTedaviler GB1 hedefleme.

Protokol

1. Sepsis Hayvan Modeli Kurulması

  1. Fareler ketamin (75 mg / kg, kas içi, im) ve Xylazine (10 mg / kg, im) ile anestezi uygulanmıştır, ve yatar konumda yerleştirilmiştir.
  2. Istikrarlı bir pozisyon sağlamak için bant ile fare ayakları Fix.
  3. Betadin veya diğer cilt dezenfektan ve alkol 3 alternatif scrubs ile karın temizleyin. Sonra, bir 15 mm ensizyon çekum maruz olun.
  4. Dışkı ekstrüzyon sağlamak için 22-gauge iğne ile bir kez bağlanan çekal güdük çekal ucundan yaklaşık 5.0 mm az bir 4-0 ipek sütür ile çekum Ligate ve sonra ponksiyon.
  5. Çekum hemen normal karın içi konumuna geri değiştirilir.
  6. İlk emilebilir dikişlerle karın kas kapatılması ve ardından yara klipleri veya emilemeyen sütürler ile cilt kapatılarak, iki kat kesi kapatın.
  7. 0.5 ml serum fizyolojik solüsyonu ile fare diriltmek ve tek yapmakhemen cerrahi prosedürün tamamlanmasından sonra imipenem se (subkutan olarak 0.5 mg / fare).
  8. Yiyecek ve su serbest erişim ile temiz bir kafes geri dönmek fare.
  9. Farklı zaman noktalarında yazılan CLP anda, bitki özü veya bileşen intraperitoneal edilir.
  10. Hayvan hayatta fazla iki hafta izlenir. Durmak zorluklar, agonal solunum, ciddi kas atrofi ve kontrolsüz kanama sergileyen Moribund hayvanların aşırı dozda karbon dioksit solunum yoluyla ötenazi edilmelidir.
  11. Bu sitokin düzeylerinin dolaşan bu çalışmalarda önemli parametreler olduğunu not etmek önemlidir. Çeşitli analjezikler sitokin salınımı ve faaliyetleri etkilediği görülmüştür ve bu nedenle kasıtlı postoperatif bakım kaçınılmıştır.

2. Bitkisel Extract hazırlanması

  1. 1-4 saat (yaprak için 1 saat, ve kökleri için 4 saat) için sıcak su (85 ° C) otlar ayıklayın.
  2. Su böylece santrifüjeluble fraksiyon (3.300 g, 20 dak, 4 ° C) çözünmeyen parçacıkların çıkarmak için kullanılır.
  3. Süzülen madde bir 0.2 um bir filtreden süpernatan fraksiyonu.
  4. Berrak suda eriyen süzüntü fraksiyonu sonra Centriprep YM-10 Santrifüj Filtresi (Katalog No. 4305, Millipore) kullanarak ultrafiltrasyon tarafından parçalandı olduğunu.
  5. (<10 kDa ve yüksek (10 kDa) düşük)> molekül ağırlıklı fraksiyonları (MWF) makrofaj kültürleri kullanarak HMGB1 önleyici faaliyetler için taranmaktadır sonuçlandı.
  6. 24 saat sonrası CLP az HMGB1 önleyici bitki özü veya bileşenleri intraperitoneal bunların tedavi etkinliğini değerlendirmektir.

3. Periton Makrofaj İzolasyon

  1. Thioglycollate çorbası (4,% 2.0 ml), normal farelere intraperitonal olarak uygulanır.
  2. İlköğretim peritoneal makrofajlar daha önce açıklandığı gibi 10 3 günde hasat edilir.
  3. Makrofajlar 1 ile desteklenmiş DMEM ortamı (Gibco BRL, Grand Island, NY) içinde ön-kültür analizi% 0 fetal bovin serumu (FBS), 2 mmol / L glutamin, ve% 1 penisilin.
  4. Yapışık makrofajlar hafifçe ile yıkanmış, ve kültür edilir, serumsuz iki saat bakteriyel endotoksin ile uyarılması daha önce OPTI-MEM I ortamı (lipopolisakkarid, LPS, E. coli 0111: B4, Sigma-Aldrich).
  5. LPS uyarıldıktan sonra 16 saat sonra, kültür ortamı içinde HMGB1 seviyeleri Western blot analizi 11 tarafından belirlenir.
  6. Göreceli bant yoğunluğu HMGB1 saflaştırılmış ile oluşturulan standart eğrileri referans HMGB1 düzeylerini belirlemek için NIH Image 1.59 yazılımı kullanılarak ölçüldü.

4. Temsilcisi Sonuçlar

1. CLP sistemik ve lokal inflamasyon neden olur.

CLP cerrahi bir kaç saat içinde, hayvanlar piloerection, letarji, huddling, gıda ve su alımında azalma, sepsis klinik belirtiler gösterirler. Ardışık sistemik ağır bir peritonit gelişen Hayvanlar96 saat - Enfeksiyon normal olarak 48 saat içinde ölür. Ancak, hatta yaş, cinsiyet ve genetik arka plan olarak eşleştirilmiş hayvanların deneysel sepsis sırasında ayırt edici bir şekilde ameliyat CLP yanıt verebilir. Bazı hayvanların can çekişen devlet (Şekil 1'de tanımlanan) yaklaştı olabilecekken Örneğin, 48 saat sonrası CLP de, diğerleri olmayan bir can çekişen devlet olarak kalabilir.

Dolaşımdaki sitokinlerin kapsamlı araştırmalar can çekişmekte olan ve olmayan can çekişmekte olan devletler (Şekil 1) 12 fareler arasında birçok sitokin düzeylerinde dramatik farklılıklar (örn., IL-6, KC, MIP-2 ve sTNFR1) saptandı. Bunların dolaşımdaki seviyeleri 12-14 deneysel veya klinik sepsis 15 ölümcül sonucu güvenilir yordayıcıları çünkü Özellikle, bu inflamatuar mediatörlerin sepsis taşıyıcı belirteç olarak sınıflandırılmıştır. Ayrıca, CLP ayrıca çeşitli pro-ve anti-inflamatuar sitokinler ve kemokinlerin yerel yayın bağlı. At, örneğin48 saat sonrası CLP, önemli bir sitokin miktarları (örn., IL-6) ve kemokin (KC ve MIP-2) hala ayrıca lokal olarak periton lavaj (Şekil 2), kan içinde sadece sistemik olarak ölçülen, fakat edilebilir.

2. HMGB1 önleyici bitki özü veya bileşenler için tarama.

Makrofaj kültürleri kullanarak, inhibe endotoksin bağımlı HMGB1 sürümde çeşitli bitki özü veya bileşenlerinin kapasiteleri (Şekil 3) değerlendirmeyi başardık. Inhibe HMGB1 sürümde kapasiteleri ışığında, başka hayvan modellerinde sepsis etkinliğini araştırdı. Bir zaman noktasında farelerde letarji, ishal ve piloerection dahil olmak üzere sepsis net işaretler geliştirdi - Deneysel sepsis 8 HMGB1 birikimi geç ve uzun süreli kinetiği göz önüne alındığında, HMGB1 inhibitörlerinin ilk doz sepsisin başlangıcından sonra 24 saat verildi. Gibi, Şekil 4'te gösterildiği geciktirilen ve büyük bir yeşil çay c tekrarlanan idaresiomponent, epigallocatechin-3-gallate (EGCG), sepsis başlamasından 24 saat sonra başlayan, önemli ölçüde ölümcül sepsis 12 fareleri kurtardı. Ağızdan verilen dahi, önemli ölçüde% 16 44% 16 hayvan sağkalım oranları artan ölümcül sepsis hala kurtarıldı farelerin EGCG. Birkaç bitkisel bileşenler ile kombinezonsal tedaviler sepsis hayvan modellerinde önemli bir iyi bir koruma elde edebiliriz olmadığını belirlemek için önemli olurdu. Birlikte ele alındığında, bu deneysel veriler CLP-indüklenen sepsis bir hayvan modeli kullanarak ekran terapötik ajanlar bizim yaklaşım geçerli.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

figure-protocol-6525
Şekil 1.. Göstergelerinin kandaki düzeylerinin can çekişen devlet yaklaşırken septik hayvanlarda önemli ölçüde yüksektir. Balb / C fareler CLP sepsis tabi ve hastalık belirtileri gelişimi açısından takip edildi. Bir andasepsis (52 saat sonrası CLP) ve geç evre, kan 3 normal farelerin (-CLP), can çekişen devlet yaklaşan 3 septik fareler ve olmayan can çekişen devlet 3 septik fareler toplanmıştır. Serum her gruptan toplanmış, ve antikor dizileri tarafından sitokin profil için tahlil edilmiştir. Farklı gruplar arasında çeşitli göstergelerinin göreli düzeylerinde dramatik farka dikkat edin. Yayıncının izni ile 10.1371/journal.pone.0001153.g006: DOI uyarlanmıştır.

figure-protocol-7308
Şekil 2. 48 saat sonrası CLP. Balb / C fareler yerel ve sistemik sitokin ve kemokinlerin Algılama CLP sepsis tabi tutuldu ve kan veya periton sıvısı 48 saat sonrası CLP hasat edildi. Çeşitli sitokinler ve toplanan serum veya peritoneal lavaj sıvısında kemokinlerin Bağıl sitokin düzeylerinin antikor dizileri ile ölçülen, ve keyfi birim (AU) olarak ifade edildi. Kontrolleri, kan ve periton sıvısı gibi samples laparotomisiz normal sağlıklı hayvanlar (-CLP) elde edilmiştir.

figure-protocol-7915
Şekil 3. Bitkisel bileşeni doza bağlı olarak primer kültürler olarak makrofaj endotoksin bağımlı HMGB1 yayın inhibe etti. Primer mürin periton makrofajlar yokluğunda LPS veya bitkisel bileşen mevcudiyetinde (örneğin, EGCG, 15 uM) ile stimüle edildi. LPS uyarıldıktan sonra 16 saat sonra, kültür ortamı içinde HMGB1 seviyeleri Western blot analizi ile tayin edildi. Yayıncının izni ile 10.1371/journal.pone.0001153.g006: DOI uyarlanmıştır.

figure-protocol-8469
Şekil 4. Bitkisel bileşeni Balb / C fareler CLP ölümcül sepsis tabi tutuldu. Ölümcül sepsis fareler kurtarıldı ve bitkisel bileşen (EGCG) +24 az intraperitoneal oldu, +48, 72 saat sepsis başlamadan gönderin. Birolmuş bölgeler hayatta iki haftaya kadar açısından gözlenmiştir. Kaplan-Meier yöntemi gruplar arasında ölüm oranları farklılıkları karşılaştırmak için kullanıldı. * P <0.05 karşı salin. Yayıncının izni ile 10.1371/journal.pone.0001153.g006: DOI uyarlanmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Laboratuvarda, sepsis çeşitli hayvan modellerinde olası yeni tedaviler geliştirmek için sepsisinde anlamak için istihdam edilmiştir. Onların klinik sepsis klinik uygulamalar içine hayvan çalışmaları başarılı bir çeviri daha önce tartışma konusu olmaya devam etmektedir. Erken sitokinlerin karşı nötralize edici antikorlar (örneğin, TNF) bakteriyemi / endotoksemi 17,18 hayvan modellerinde koruyucu olmasına rağmen, aslında sepsis 19 hayvan modelinde hayatta kötüleştirebil...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

AES ve HW sepsis için potansiyel bir terapötik ajan olarak HMGB1 inhibitörleri (tanshinones) ile ilgili patent başvuruları arasında co-mucitleri.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Genel Tıp Bilimi (R01GM063075) Enstitüsü ve Tamamlayıcı ve Alternatif Tıp Ulusal Merkezi (R01AT05076) hibe ile desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası
Betadine Purdue Ürünleri LP 25655-41-8
imipenem Merck & Co, Inc 9882821
Ketamin HCl Hospira A.Ş. RL-0065
Ksilazin Lloyd Laboratuvarları 4821
AutoCLIP Becton Dickinson 427631
4-0 ipek sütür Roboz SUT-15-2
Surflo IV Kateter Terumo SR * OX2419CA
RayBio fare sitokin antikor dizi RayBiotech, Inc AAM-CYT-3
Thioglycollate Becton Dickinson 211716

Referanslar

  1. Wichterman, K. A., Baue, A. E., Chaudry, I. H. Sepsis and septic shock--a review of laboratory models and a proposal. J. Surg. Res. 29, 189-201 (1980).
  2. Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
  3. Hubbard, W. J. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, Suppl . 1. 52-57 (2005).
  4. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat. Rev. Immunol. 4, 499-511 (2004).
  5. Baggiolini, M., Loetscher, P. Chemokines in inflammation and immunity. Immunol. Today. 21, 418-420 (2000).
  6. Balkwill, F. Cytokines--soluble factors in immune responses. Curr. Opin. Immunol. 1, 241-249 (1988).
  7. Wang, H. HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice. Science. 285, 248-251 (1999).
  8. Yang, H. Reversing established sepsis with antagonists of endogenous high-mobility group box 1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 296-301 (2004).
  9. Qin, S. Role of HMGB1 in apoptosis-mediated sepsis lethality. J. Exp. Med. 203, 1637-1642 (2006).
  10. Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. J. Vis. Exp. (35), e1488(2010).
  11. Rendon-Mitchell, B. IFN-gamma Induces High Mobility Group Box 1 Protein Release Partly Through a TNF-Dependent Mechanism. J. Immunol. 170, 3890-3897 (2003).
  12. Li, W. A Major Ingredient of Green Tea Rescues Mice from Lethal Sepsis Partly by Inhibiting HMGB1. PLoS ONE. 2, e1153(2007).
  13. Osuchowski, M. F., Welch, K., Siddiqui, J., Remick, D. G. Circulating cytokine/inhibitor profiles reshape the understanding of the SIRS/CARS continuum in sepsis and predict mortality. J. Immunol. 177, 1967-1974 (2006).
  14. Heuer, J. G. Evaluation of protein C and other biomarkers as predictors of mortality in a rat cecal ligation and puncture model of sepsis. Crit. Care. Med. 32, 1570-1578 (2004).
  15. Bozza, F. A. Cytokine profiles as markers of disease severity in sepsis: a multiplex analysis. Crit. Care. 11, R49(2007).
  16. Li, W. EGCG stimulates autophagy and reduces cytoplasmic HMGB1 levels in endotoxin-stimulated macrophages. Biochem. Pharmacol. 81, 1152-1163 (2011).
  17. Beutler, B., Milsark, I. W., Cerami, A. C. Passive immunization against cachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethal effect of endotoxin. Science. 229, 869-871 (1985).
  18. Tracey, K. J. Anti-cachectin/TNF monoclonal antibodies prevent septic shock during lethal bacteraemia. Nature. 330, 662-664 (1987).
  19. Eskandari, M. K. Anti-tumor necrosis factor antibody therapy fails to prevent lethality after cecal ligation and puncture or endotoxemia. J. Immunol. 148, 2724-2730 (1992).
  20. Ziegler, E. J. Treatment of gram-negative bacteremia and septic shock with HA-1A human monoclonal antibody against endotoxin. A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. The HA-1A Sepsis Study Group. N. Engl. J. Med. 324, 429-436 (1991).
  21. Ziegler, E. J. Treatment of gram-negative bacteremia and shock with human antiserum to a mutant Escherichia coli. N. Engl. J. Med. 307, 1225-1230 (1982).
  22. Abraham, E. Efficacy and safety of monoclonal antibody to human tumor necrosis factor alpha in patients with sepsis syndrome. A randomized, controlled, double-blind, multicenter clinical trial. TNF-alpha MAb Sepsis Study Group. JAMA. 273, 934-941 (1995).
  23. Cohen, J. Adjunctive therapy in sepsis: a critical analysis of the clinical trial programme. Br. Med. Bull. 55, 212-225 (1999).
  24. Dellinger, R. P. Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2008. Crit. Care Med. 36, 296-327 (2008).
  25. Wang, H., Zhu, S., Zhou, R., Li, W., Sama, A. E. Therapeutic potential of HMGB1-targeting agents in sepsis. Expert. Rev. Mol. Med. 10, e32(2008).
  26. Wang, H. The aqueous extract of a popular herbal nutrient supplement, Angelica sinensis, protects mice against lethal endotoxemia and sepsis. J. Nutr. 136, 360-365 (2006).
  27. Li, W. A cardiovascular drug rescues mice from lethal sepsis by selectively attenuating a late-acting proinflammatory mediator, high mobility group box 1. J. Immunol. 178, 3856-3864 (2007).
  28. Fukuyama, M. Mixed bacterial infection model of sepsis in rabbits and its application to evaluate superantigen-adsorbing device. Blood Purif. 23, 119-127 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 62Bitkisel tedavilerdo u tan gelen ba kl k h crelerisitokinlerHMGB1sepsis deneysel hayvan modeliekal ba lama ve delme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır