Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Alla Gagarinova; Mohan Babu; Jack Greenblatt; Andrew Emili

doi:10.3791/4056

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

Özet
Özet
Protokol
Sonuçlar
Tartışmalar
Açıklamalar
Teşekkürler
Malzemeler
Referanslar
Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Sistematik, büyük ölçekli sentetik gen (bir gen ya da gen-epistasis) etkileşim ekranlar genetik ve fazlalık yolu çapraz konuşma keşfetmek için kullanılabilir. Burada, yüksek-throughput kantitatif sentetik genetik dizi tarama teknolojisi tarif eSGA biz epistatik ilişkileri durulaştırmada ve genetik etkileşim ağları keşfetmek için geliştirilen denir Escherichia coli.

Özet

Fenotipleri fiziksel (protein-protein gibi) ve fonksiyonel (örneğin, gen-geni ya da gen) etkileşimleri (GI) ¹ karmaşık bir dizi ile belirlenmiştir. Fiziksel etkileşim bakteriyel protein kompleksleri olarak ilişkili oldukları işaret olsa da, onlar mutlaka yolunun düzey fonksiyonel relationships1 açıklamayız. İki silinmiş veya inaktif genleri taşıyan çift mutantların büyüme ölçülür ve karşılık gelen tek mutantlar ile karşılaştırıldığında hangi GI ekranlar, lokusları arasında epistatik bağımlılıkları aydınlatmak ve dolayısıyla yeni fonksiyonel ilişkiler ² sorgulamak ve keşfetmek için bir araç sağlayabilir. Büyük ölçekli GI haritaları maya ^3-7 gibi ökaryotik organizmalar için bildirilen, ancak GI bilgi bakteriyel genomlar işlevsel açıklama engellemektedir prokaryotlar ⁸ için seyrek kalır edilmiştir. Bu amaçla, ve diğerleri, yüksek verim kantitatif bakteri GI tarama ^{yöntemleri, 9, 10} geliştirdik Burada, kantitatif E. gerçekleştirmek için gereken önemli adımları sunmak sistemik oluşturmak ve bir koloni dizisi biçiminde çift mutantlar çok sayıda spor ölçmek için doğal bakteriyel konjugasyon ve homolog rekombinasyon kullanarak coli bir genom-ölçekli ⁹ Sentetik Genetik Array (eSGA) tarama prosedürü,. Kısaca, bir robot aktarmak için kullanılır , konjugasyon yoluyla, kloramfenikol (Cm) - İşaretli F-alıcı suşlar - mühendislik Hfr gelen mutant alleli (rekombinasyon Yüksek frekans) kanamisin sıralı bir dizi (Kan) içine 'donör suşları' olarak işaretlenmiş. Genellikle, biz kayıp fonksiyon-gerekli olmayan gen delesyonlar taşıyan tek mutantlar ('Keio' koleksiyonu ¹¹ gibi) ve temel gen mutasyonları hypomorphic (azaltılmış protein ekspresyonu, istikrar, ya da etkinlik ^{9, 12, 13} görüşmekte yani allelleri) kullanın non-esansiyel ve esansiyel genler, res fonksiyonel dernekleri sorgulamakpectively. Homolog yeniden birleşme ve bunu takip eden genetik değiş tokuş aracılı sonra, elde edilen çift mutant hem de antibiyotik içeren katı ortam üzerinde seçilir. Akıbet sonra, plakaları dijital görüntülü ve koloni boyutları nicel bir in-house otomatik görüntü işleme sistemi ¹⁴ kullanılarak puanlanır. Yaktığımız bir çift mutant büyüme oranı beklenen ⁹ daha da belirgin olarak daha iyi veya daha kötü olduğu zaman ortaya çıkar. Ağırlaştırıcı (veya negatif) yaktığımız çoğu aynı temel süreç ² çarpacak telafi yollarının gelen genlerin çiftleri kaybı fonksiyon-mutasyonlar arasındaki sonuçlanabilir. Burada, tek bir gen kaybı ya da tek bir mutasyona uğramış uygun bir şekilde, arabelleğe. Ancak, her iki yollarının kaybı zararlı olduğunu ve sentetik öldürücülüğü veya hastalık (yani yavaş büyüme) ile sonuçlanır. Tersine, hafifletilmesi (veya pozitif) etkileşimleri aynı yolu ya da karmaşık protein ² genleri arasında meydana gelebilecektek başına ya da gen silinmesi sık sık yoldan veya daha fazla ilave pertürbasyonlar, böylece büyüme aktivitesini azaltır, ve olmayan bu tür karmaşık ve normal fonksiyonunu karıştırmayı için yeterlidir. Genel olarak, sistematik olarak tanımlanması ve GI ağları analiz diğer yaklaşımlar tarafından cevapsız yolağı düzeyde bilgi ⁹ varılabilir hangi genlerin, çok sayıda arasındaki fonksiyonel ilişkilerin tarafsız, global haritalar sağlayabilir.

Protokol

1. Recombineering ^{15, 16} tarafından Hfr Cavalli Donör Mutant soylar oluşturma

ESGA verici lekeler oluşturmak için adımlar aşağıda tarif edilmektedir. Kısaca, biz hedef λ kullanın - Kırmızı elzem olmayan gen delesyon mutantlar (bölüm 1.1) veya daha sonra olarak kullanılan elzem geni hypomorphic mutant suşlar donör (bölüm 1.2) oluşturmak için PCR tarafından oluşturulan amplifiye seçilebilir DNA işaretleyicisi kaset homolog rekombinasyon ¹⁶ parçaladı aracılı GI ağları tanımlamak için 'sorgular'.

Not: teknoloji geliştirme sürecinde, iyi tanımlanmış bir Hfr donör suşu (Hfr Cavalli, Hfr Hayes ve Hfr 3000) kullanılarak mutasyon birleştirerek Hfr-aracılı konjugatif transferini kullanıyorum etkinliği değerlendirildi. (I) etkili bir şekilde Yu et al öncülük Recombineering yöntemini kullanarak verici mutantlar yapabilme yeteneği incelenmiştir. (2000) ^16, (ii) göreli etkinliklerikonjugatif DNA'nın farklı kromozomal belirteçler transferi, ve (iii) sorgusu genin konumu ve Hfr transferi odağı, Orit göre kromozomal yönelim etkileri. of Biz λ bulundu - Kırmızı-aracılı homolog rekombinasyon verimliliği Hfr Hayes veya Hfr3000 daha Hfr Cavalli fazla idi. Eğer gerekirse, P1 transdüksiyonu ya da bir pseudo Hfr suşu ^17, mutant donör oluşturmak için de kullanılabilir. Biz başarıyla donörlerin çok sayıda yapmak ve eleme için tüm bu yöntemlerin adapte var. Bizim deneme çekimi deneylerde, transfer ve eski conjugants sayısının genel verimliliğini Hfr Cavalli anlamlı fazlaydı gözlenen bu yana, bu türün arka donör inşaat ve büyük ölçekli eSGA için seçildi. Hfr Cavalli donör kullanılarak eSGA ekranlar için tüm işlemler tarif edilmektedir.

Zaruri olmayan bir gen silme sonraki Recombineering için DNA fragmanı amplifying
İki adımlı nested PCR ampli İstihdam^15:;: Arındırmaya (Şekil 1) pKD3 plasmidin Cm bir direnç işaretleyicisi ile hedef açık okuma çerçevesi değiştirilmesi için bir gen etme kasetinin (id AAL02033.1 protein 15554330 GI) oluşturmak için kullanılır. Işaretleyici deneyler takibinde direnç geninin kaldırılması, gerekirse, bu sayede ÖN-siteleri ¹¹ arasında yer alır.
Not: bakteri hücreleri dönüştürmek için daha sonra kullanılan amplifiye edilmiş ürün olan plazmid çıkarmak için iki aşamalı bir PCR iç içe yoktur. Çıkarma plazmid (ilk PCR) ve ardından, ikinci PCR içinde gen nakavt kaseti yaratmak bir plasmid ile dönüşüm çok daha fazla verimli Recombineering daha küçük olduğu için gerekli olan ve hedef elde etmek için - mümkün olduğu kadar - olan tek suşu başarıyla seçilebilir işaretleyici ile hedeflenen genomik DNA değiştirilir. İç içe PCR için alternatif bir ikinci PCR amplifiye bölge plazmid dışında bir kısıtlama digest tabi tutulmasıdıradım. Daha sonra, kısıtlama digest bir ürün saflaştırılmış ve iç içe PCR aşama (1.1.2) içinde bir şablon olarak kullanılır. Bu seçenek aynı zamanda basit, ama zaman kadar daha fazla çalışma gerektirir.
1. 1,070 bp büyüklüğünde bir ürün üretmek için F1 ileri ve geri primerler ile PCR R1 bir şablon olarak pKD3 yaklaşık 45 ng kullanın. Qiagen PCR saflaştırma protokolü kullanılarak PCR parçası arındırmak ve 5 ng / ml 'den konsantrasyon için steril damıtık su içinde ürün seyreltin.
2. Izin vermek için, 5'-ucunda gene özel homoloji bölgelerin: (i) 45 nt olan gen-spesifik (örneğin, nakavt) iç içe primerleri, F2 ve R2 birlikte ikinci bir PCR kurmak, bir şablon olarak arıtılmış PCR ürünleri kullanmak homolog rekombinasyon için hemen üst ve alt Cm işaretleyici sentezini hazırlamak için 3'-ucunda Cm direnç işaretçisi ve (ii) 20 nt ile değiştirmek için, hedef genin. Üretilen fragmanın büyüklüğü 1,123 bp olup. Gene özel homoloji bölgeleri hedef op çıkarmak için tasarlanmışherhangi bir bitişik veya kısmen örtüşen kodlama bölümleri sağlam kalırken çerçeve okuma tr. Bu amplifikasyon sonra 1.3 adıma geçin.
Bir elzem genin mutasyon hypomorphic oluşturmak için bir etiketleme kaset amplifying
1. Hypomorphic donör mutant suşlar oluşturmak için, genellikle biraz istikrarsızlaştırıcı transkript bolluğu (yani protein kopya sayısı) veya protein katlama / faaliyete göre gerekli protein fonksiyonu etkiler bir C-terminal peptid sıralı afinite (SPA) füzyon etiketi ekleyin. Bu amaçla, içinde pJL148 Kan işaretleyici komşu özdeş nükleotit sekansları ve pKD3 ¹⁵ Cm işaretleyici arasında Recombineering kullanılarak Cm için pJL148 ^18. Kan direnç işaretçisi dönüştürülmesi sureti ile seçilebilir bir SPA-tag (SPA-Cm) DNA şablon oluşturmak. Çıkan şablon Cm direnç işaretleyici ardından çerçeve içinde SPA-etiketi, ve PCR, Recombineering ve sonraki eSGA ¹² için uygundur.
  Not: </ Strong> Temel genler, potansiyel olarak gen fonksiyon çalışmaları için en ilginç olan. Bu genlerin silinemez, çünkü Ancak, yenilikçi yöntemler elzem genlerine işlevsel ilişkiler araştırmak için geliştirilmiş gerekiyordu. Birkaç uygun oldukça başarılı yaklaşımlar maya başlangıçta geliştirilmiştir. Örneğin, Davierwala ve ark. (2005) ¹⁹ gerçekleştirilebilir GI ekranları 575 ısıya duyarlı elzem genin mutant panelini kullanarak ve elzem genlerin gereksiz genler olarak yaktığımız beş kat sayısı konusunda gösterdiği bulundu. Benzer şekilde, Breslow ve ark. (2008) ²⁰ (nemli) yollar ve kompleksleri incelemek için gerekli maya genlerin ~% 82 kapsayan hypomorphic allellerin bir kütüphane oluşturmak için bir yaklaşım 'mRNA pertürbasyon azalarak bolluk' a geliştirdi. Nemli bir yaklaşım olasılıkla nedeniyle destabilizasyonu mRNA'ya hedef gen ^6, seviyesini azaltmak, daha sonra ifade edilmiş mRNA 3'end değiştirir. Nemli yaklaşım ^6, Bizim strateg benzery temel proteinin ifade mRNA'nın 3 'ucuna rahatsızlık vermesini ve ince etkilerini kullanmak olmuştur.
  Aşağıda tarif gibi, kendisi tarafından etiketi olasılıkla protein katlanması veya fonksiyon etkilemez, ancak çevresel stres veya diğer mutasyonlar ile kombine edildiğinde etiketi ile mRNA ince pertürbasyon, yeterli, işlevsel bilgilendirici gen-çevre ¹³ ve gen ortaya -gen ^{9, 12} etkileşimleri.
  Öncelikle, bugüne kadar, biz gerekli proteinlerin SPA-etiketli suşları ⁸ arasında temsil edilen 307 E. coli% 80'den fazlası, ~ 3.000 esansiyel ve non-esansiyel E. coli protein ^21-23 arındırmak için SPA-etiketler kullanılabilir. Etiketi başarıyla karşılıklı valide edildi bilinen protein kompleksleri, (aynı kompleks etiketleme ile izole edilebilir yani ve aynı kompleks içinde farklı proteinler arındırıcı) izole etmek için kullanılan Çünkü; ve biz nedenle izole kompleksleri, biyolojik alakalı olduğunu, etiketler dogenellikle protein katlanması veya işlev ¹² etkilemez. Benzer şekilde, bizim yayınlanmamış gözlemler kendisi tarafından etiketi genellikle zorlanma büyümesini etkilemez ortaya koymuştur. Ancak, nemli suşları ⁶ bildirildi gibi, etiket ve işaretleyici kaset entegre ederek 3'-UTR değiştiren RNA düzeyinde belirli transkript istikrarsızlaştırmak ya da nadir durumlarda, düzgün bir katlama veya fonksiyon engel olabilir gerekçeli füzyon proteinleri. Bu nedenle, bu tür birleştirerek gerçekten ^{9, 12} gözlendi bilgilendirici yaktığımız, neden olacaktır başka genomu diğer işlevsel ilgili mutasyonları olan elzem genlerin allelleri tedirgin öngördü. Elzem genlerine Ayrıca, SPA-etiketli allelleri Nichols ve ark fenotipik profil çalışmalarına göre gen-çevre etkileşimleri (örneğin ilaç hipersensitivite) sergilendi. Büyüme koşulları çeşitli SPA-etiketli esansiyel suşları bir alt kümesine tabi (2011) ^13,. Aynı çalışmada confirmed o SPA-etiketli (58 test 54 üzerinden) en önemli suşları SPA-etiketi genom için yararlıdır elzem genler hafif hypomorphic allel sıklıkla oluşturduğu görüşünü desteklemektedir bir veya daha fazla kültür koşullarında ¹³ bozulmaktadır spor gösterdi eSGA dahil GI ekranı uygulamaları.
2. Homolog (ii) ve ardından, 5 'ucunda Recombineering için S1 ve S2, gen spesifik primerler, her içeren, (i) bir 45 nt gene özel bölge ile SPA-Cm şablon arasından etiketleme kaset yükseltin bir 27 bp SPA- 3 'ucundan Cm spesifik sekans.
Teyit ve PCR ürünü temizleme
1. Etiketleme kasetinin doğru agaroz jel elektroforezi için PCR ürününün 2-5 ul tabi ve üreticinin standart PCR saflaştırma protokolü (Qiagen) takiben kalan DNA arındırmak tarafından güçlendirilmiş olduğunu onaylayın. Steril damıtılmış su içinde 30 ul PCR ürünü elute ve ~ 50 ng / ml 'den konsantrasyon ile seyreltilir. Purified ürünü kullanımı kadar 6 ay için dönüşüm hemen kullanılmalıdır (adım 1.5) veya -20 ° C'de saklanabilir.
Donör inşaat Hfr Cavalli yetenekli hücrelerin hazırlanması
1. Bir 250 mL şişe içinde 50 ug / ml ampisilin ve 35 ul taze Luria-Bertani (LB) ortamı 70 ml içine bir Hfr Cavalli soyunun gecelik kültürü doymuş bir ml inoküle. (~ 2 saat) elde edilen bir optik yoğunluk (OD) 220 rpm'de kadar ~ 0.5-0.6 600 nm sallama ile 32 ° C 'de kültür inkübe edin.
2. 42'de λ _kırmızı rekombinasyon sistemi ^16, ısı indüksiyonu için bir su banyosu ° 160 rpm'de sallama ile 15 dakika için C kültür aktarın. 160 rpm'de 10-20 dakika süreyle soğuk buz bulamaç su banyosuna kültürü aktararak indüksiyon durdurun. Kullanmadan önce kullanım tüpleri ve en az 15 dakika süreyle buz üzerinde soğutulmuş oylandı küvetler; dönüşüm sonrasına kadar bu noktadan hücreleri soğuk tutmak için emin olun.
3. C Böleşit 2 Önceden soğutulmuş 50 ml polipropilen tüpler (tüp başına ~ 35 ml kültür) ve 4, 6 dakika boyunca 4.400 xg'de santrifüj ° C içine ulture
4. Süpernatant Sil ve yumuşak inversiyon ile yeniden askıya hücre peleti ~ buz-soğuk steril damıtık su ve 50 ml. 4 ° C'de 6 dakika boyunca 4,400 x g'de yeniden santrifüjleyin hücrelerin Süpernatant atılır ve yeniden askıya her bir hücre peleti buz gibi soğuk steril% 10 gliserol, 20 ml ve yukarıda tarif edildiği gibi tekrar santrifüjlenir.
5. Süpernatant Durusu ve buz gibi soğuk% 10 gliserol 500 ul hücre pelletini yeniden askıya. Hemen dönüşüm için ayrı, önceden soğutulmuş 1.5 mL mikro santrifüj tüpleri içine 50 ul hacim içinde tablet hazırlanan yeterli hücrelerini. 3 aya kadar için hücreler kuru buz üzerinde ya da sıvı nitrojen içinde dondurulur ve -80 ° C'de muhafaza edilebilir. Ancak, dönüşüm verimliliği taze hazırlanmış yetkin hücreleri ile en yüksek düzeydedir.
Dönüşüm
1. Saflaştırılmış PCR ürünü 100 ng ekleyetkili hücrelere 1.3.1 adım. Tüp Flick ve 5 dakika buz üzerinde oturmak için süspansiyon sağlar.
2. Önceden soğutulmuş bir elektroporasyon küvetine buz-soğuk yetenekli hücrelerin DNA ve süspansiyon aktarın. 2 mm boşluk küvetini ayarını 2,5 kV, 25 μF, 200 ohm ile hücre karışımı elektroporasyonu (yani farklı bir küvet kullanıyorsanız, elektroporasyon ayarları için üreticinin talimatlarına bakınız), ve hemen oda sıcaklığında SOC orta 1 ml ekleyin. Orbital 220 rpm'de çalkalanarak 1 saat boyunca 32 ° C sıcaklıkta 15 ml kültür tüpü ve inkübe içine SOC ortamında electroporated hücre transfer edin.
3. İnkübasyondan sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 4,400 x g de santrifüj hücreleri. Üstte kalan sıvı kısmın yaklaşık olarak 850 ul çıkarın ve geri kalan sıvı, hücre pelet yeniden askıya.
4. 32 ° C gece boyunca 17 ug / ml Cm ve inkübe ihtiva eden ön-ısıtılmış LB plakaları üzerine, hücreler yayılır. LB üzerinde iki ayrı transformant kolonileri ve çizgi seçin-Cm mutant onay plakaları. Biz nadir supresör mutasyonlarla suşların toplama olasılığını azaltmak için büyük transformant koloniler kaçınarak öneririz. Ayrıca çizgi LB-Kan aynı transformantlar suşların Kan dayanıklı olmadığını onaylamak için.
  Not: Cm direniş işareti donör suşları yapmak için kullanılan bu yana, biz donör mutantlar Kan dayanıklı olması için beklemeyin. LB-Kan ve LB-Cm plakaları hem üzerine transformantlar sürerek, biz donör mutasyonu kendisini nedense Kan direncine neden vermedi emin olun. Bu adımı gerçekleştirdikten ve hedef mutasyonlar Kan hayatta kalmak için suşunun yeteneğini etkileyecek değildi olsaydı, çift mutasyonlu donör suşlarının hepsi seçim adımları hayatta zira etkili eSGA kullanılarak yapılmış olmaz. Bu sadece beklenmedik fenotipleri veya eSGA ekranlarının tamamlanması engel olabilecek diğer sorunları yakalamak için bir ihtiyati mantıklı bir adım. Bu adımda atlandı ise, diğer kontroller woulHala başarısız ekranlar tespit ediyorum. Ancak, Kan dirençli bir donör önceki bir algılama verimsiz ve gereksiz bir dizi adım ortadan kaldıracaktır. Kan üzerinde büyümek için bir gerginlik, örneğin içerebilir Diğer sebepler yanlış PCR ürün veya dönüşüm için bir suşunun kullanımı antibiyotik gibi doldu. Bütün bu sorunlar tespit ve gerekli değildir bu denetim, yardımıyla prosedürde erken ele, ama eSGA için tavsiye edilebilir.
Gerekli olmayan gen delesyonu (adım 1.6.1) veya temel gen hypomorphic mutasyonu (bölüm 1.6.2) Onaylayan
Not: PCR ile gen silme teyit, bir yabani tip soyla genomik DNA, bir kontrol olarak kullanılır.
1. Zorunlu olmayan gen delesyonu Onaylayan
  1. PCR ile gen silme işlemini onaylamak için, Manufact takiben, sıvı LB-Cm ortamda yetiştirilen dönüştürülmüş, varsayılan nakavt suşları genomik DNA izoleÜrer talimatları (Promega).
  2. Başarılı Recombineering onaylamak için, nakavt onay primerlerin üç farklı setleri ile her transformant DNA yükseltmek. Genomik DNA şablonu, ~ 150 ng reaksiyonları gerçekleştirmek, ve bir agaroz jeli üzerinde PCR ile sentezlenmiş ürünleri kullanan tarafından doğru parçası boyutları doğrulamaktadır.
  3. Birinci primer kümesi Cm kaset sekansına tamamlayıcı olan bir 20 nt komşu hedef bölgenin (KOCO-F) arasında 200 bp yukan yer alan astar, ve Cm-R astar oluşmaktadır. Bu amplifikasyon mutant bir 445 nt amplikon üretmek için değil, yabani tip soyla (Şekil 1) de beklenmektedir.
  4. İkinci set nin 3 'ucundan yaklaşık 200 bp aşağı sertleştirmek için tasarlanmış Cm kaset sekansı için tavlama bir ileri primer (Cm-F), ve teyit primer komşu bir 20 nt geri (KOCO-R) içerir, gen silindi. Bu amplifikasyon reaksiyonu mutant bir 309 nt Amplikon üretmesi bekleniyor, ama hayır ediliryabani tip soyla t, (Şekil 1).
  5. Üçüncü PCR KOCO-F ve KOCO-R primerleri içerir. Bu reaksiyon, bir gen yerinin kaset ile değiştirilir ve başka çoğaltılmış ancak başka türlü vahşi-tip genin kopya hala mevcut edilmiş olan ile seçilmiş suşu, bir merodiploid olmadığını teyit etmek için gereklidir. Doğru bir iptal mutantının dan Bu amplifikasyon bir 1.4 kb ürün (Şekil 1) üretimi için tahmin edilmektedir.
    Not: hedef gen gen delesyonu kaset olarak baz çifti aynı uzunluğu hakkında varsa, bir kaset almıştır odağı değil, olan bir odağı arasında bir fark olmaz. Böyle durumlarda kesin teyidi için, biz özellikle silinen gen içinde bir DNA parçası yükseltmek için ek primerler kullanmanızı öneririz. Gen silinmiş, bu durumda, bir amplifikasyon ürünü sadece yabani tip kontrol suşu ile değil, mutant görülecektir. Bu primerlermanuel olarak ya da hesaplama açısından özellikle silinmiş bölge içinde bir DNA segmenti yükseltmek için tasarlanmış olabilir. Biz genellikle 140 bp bölgelerinin yükseltmek.
2. Elzem genin mutasyonu hypomorphic teyit
  1. PCR ile hypomorphic mutasyon onaylamak için, gene özel 20-nt ileri (KOCO-F) ve SPA-tag ekleme site sırasıyla 200 bp memba ve mansap bulunan ters primerler (KOCO-R), (Şekil 2) kullanabilirsiniz.
    Not: Bu amplifikasyon adım hedef elzem genin bir kopyasının etiketsiz yokluğunda sağlamak için bir kontrol olarak kullanılır. Ancak etiketli bir versiyon mevcut olduğunda, SPA-Cm amplikon daha büyük tek bir bant 310 bp görülmektedir. Bir 400 bp ürünü genin etiketsiz versiyon varlığına işaret eden olacaktır.
  2. PCR onay paralel olarak, SP BAYRAK-epitoplar özgü bir anti-BAYRAK M2 antikoru kullanılarak Batı SPA-etiketinin içinde çerçeve ekleme doğrulamak için blotting kullanınA-etiketi ^21.
Teyit donör zorlanma saklanması
1. , Etiketli kriyotüplerin için teyit rekombinant donör mutant gecede kültürü aktarın% 15 final konsantrasyonuna gliserol ile takviyesi ve iyice karıştırın. Uzun süreli depolama için, -80 kriyotüplerin tutmak ° C

2. E. Arraying eSGA Ekranlar için coli F-Alıcı Mutantlar

Replica-pin E. Mori ve diğerleri tarafından oluşturulan coli Keio tek olmayan bir elzem genin iptal mutantı toplanması. kuyu başına sıvı LB ortamı 80 ul ihtiva eden yirmi dört 384-kuyucuklu mikroplaklar için robotik (3.968 suş ^11;, F-BW25113 Açık Biosystems dan temin edilebilir) , 50 ug / ml ile takviye Kan
Not: sistematik elzem genler ile CBS değerlendirmek için, alıcı Keio toplama ¹¹ F-Kan-işaretli elzem genin hypomorph ile desteklenebilirC-terminal SPA etiketleri ²² ile ic mutant ^{suşlar, 23.}
Pozitif kontrol olarak görev yapacak sınır kontrol suşu, yer açmak için, hem de otomatik kolonisi quantizations gibi içinde ve plaka Normalizasyon arasında yardım, yukarıda adım ve transferi her plaka dıştaki kuyulardan inoküle ortamı çıkarın yeni plakalar, tekrar dıştaki kuyular boş bırakarak.
Not: Keio koleksiyonu ¹¹ sınır kontrol suşu JW5028 ve bizim bütün-genom ekranlar, herhangi bir bağış ile yaktığımız sergilemek değil olmamalıdır küçük sözde gen için silinir. Bu nedenle, bu konjugasyon, çivileme, veya seçimler başarısız olduğunda eksik veya sporadik sınırında gerginlik büyüme sonuçlanan nadir örnekleri belirlemek için iyi bir pozitif kontrol suşudur. Sınır kontrol koloniler çift mutant seçimden sonra büyümeye yoksa Örneğin, sorgu zorlanma konjugasyon yeteneğine sahip olmayabilir konjugasyon i teşebbüs olabiliryeri (bir antibiyotik içeren plaka gibi), ya da yanlış bir antibiyotik alarak onu engelledi na koşulu seçimi plaka eklenmiş olabilir. Çok az, dağınık koloniler sınırına dahil tüm plaka üzerinde gözlenir Benzer şekilde, konjugasyon veya bağlama başarısız olabilir ve ekran tekrarlanması gerekir. Bu sporadik sınır büyüme tekrarlanabilir ise, sürekli olarak kötü bir donör konjugasyon gösterebilir ve böylece çift mutantlar dikkat edilmediği durumlarda muhtemelen konjugasyon yetersizliği, doğru değil yaktığımız kaynaklanmaktadır. Bu tip ayırıcıların daha ileri analiz atılması gerekir. Ayrıca, tüm plakaları üzerinde mevcut olan tarafından, sınır kontrol suşu koloni nicemleme yazılım otomatik çift mutant plakaları ve böylece koloni pozisyonları elle demarkasyon edilir gerekmez koloni pozisyonlarını belirlemek için izin verir. Son olarak, sınır kontrol suşu içinde koloni boyutlarda normalleşme yardımcıları (bir tabak içinde örneğin farklı satırlar) ve between (örneğin farklı alıcı plakaları farklı zamanlarda aynı donör ile tutturulmuş) plakaları.
Aynı şekilde, her plaka içinde farklı bir konuma (değil sınır) herhangi iki suş kaldırarak negatif kontrol noktaları oluşturmak ve yeni bir plaka suşların aktarın. 17 mikrogram / Cm ml içeren LB medya ile bu boş kuyular doldurun. Bu negatif kontrol noktalar alıcı ve bu nedenle çift mutant plakaları boş olması ve görüntüleme, numaralandırma veya plakaları bağlantılarını yaparken hiçbir işlem veya plaka işleme hataları olduğunu sağlamak için bekleniyor.
Not: Bunlar boş noktalar negatif kontrolleri gereklidir. Negatif kontrol suşlarının seçimi sırasında büyüyünce - Negatif kontroller seçimi başarısız olduğunda örnekleri belirlemenize yardımcı olur. Bu alıcı plakaların her biri için tek negatif kontrol noktaları seçmek için değil, fakat, aynı zamanda, levhanın aynı kadran içinde negatif kontrol lekeleri (örneğin, alt sağda) seçmek için göstermektedir. Bu şekilde, kalıpNegatif kontrol noktalar olası plaka ilgilenmedikleri hataları (örneğin levhalar etiketlendirilmemiş olan veya sol üst koloni sağ alt konumda tutturulmuş olduğu, baş aşağı sabitleniyor) tanımlayacaktır.
50 ug / bizim tam genom eSGA ekranlar sonucu Kan ml içeren 200 ml LB ile 500 ml bir balon içine, bir sözde silme ile, Keio gerilme JW5028 ¹¹ inoküle, bu özel mutant büyüme vahşi en yakın olan tip BW25113 ve böylece bir sınır kontrolü olarak kullanılmaktadır.
600 nm'de 0,6-32 gece boyunca dizilmiş suşlar olarak JW5028 kültür ° C ile 190 rpm orbital ~ 0.4 bir OD sallama büyütün. Gecede büyümenin ardından, JW5028 gecede kültürünün yaklaşık 80 ul ile sınır kuyuları doldurun.
Monte edilmiş plakalar Adım 3.2 kullanılabilir. Alternatif olarak, uzun süreli depolama için,% 15 gliserol ile alıcı plakaları her sıra ek medya ve gliserol karıştırın ve plakaları tutmak-80 ° C

3. E. Üretme Yüksek dansiteli Gerinim Çiftleşme Prosedürü coli Çift Mutantlar

32 gecede Cm, ° C zengin LB-Cm sıvı besiyerinde (17 mikrogram / Cm ml) 220 rpm'de sallayarak ile işaretlenmiş sorgu mutasyonu taşıyan Hfr donör zorlanma, büyütün.
Buna paralel olarak 50 mikrogram / Kan ml ile desteklenmiş sağlam LB plakalar üzerine 384-koloni yoğunluk sipariş alıcı mutant koleksiyonu Pin, 17 mikrogram ile desteklenmiş, LB plakaları aynı sayıda üzerine 384-koloni yoğunluğu donör sorgu mutant suşu pin Cm / ml. 32 ° C'de gece boyunca inkübe plakaları
Not: çivileme için kullanılan alıcı plakalar sonraki adımlar için yeterince büyük koloniler elde etmek için 36 saat kadar sürebilir. Ortalama sınır koloni çapı 2 mm (veya daha büyük) ile ilgili olduğunda, plakaları sokulamayacak hazırız.
Suşları eşlenik için bir 384-koloni gecede donör plaka donör pinKatı LB plaka. Akabinde konjugasyon plaka üzerinde taze tutturulmuş donör üzerinde tek bir 384-koloni alıcı plaka pin. Tüm donör-alıcı plakaların katı LB konjugasyon plakalar üzerine iğneleyerek konjuge olmuştur kadar sabitlemeye devam edin. 16 ila 24 saat süre ile 32 ° C 'de tutturulmuş konjugasyon plakaları inkübe edin.
Not: Bireysel tek mutant suşlar donör çünkü konjugasyon üzerindeki mutasyonlar, DNA transferi verimliliği, ister fitness potansiyel etkilerinin çiftleşme verimliliği gen-için-gen değişkenlik gösterebilir. Büyüme 16 ve yeterince büyük koloniler sonraki iğneleyerek adımları için elde edilmiş 24 saat, arasında herhangi bir zamanda durdurulabilir. 24 saat 16 süren Çekimleri hatta biraz daha düşük fitness geç transfer genleri veya mutantlar mutantlar için tekrarlanabilir eSGA sonuçları için ex-conjugants yeterli sayıda üretmek.
Tek bir katı LB plakası içeren Cm (17 mg / ml) ve Kan (50 üzerine her 384 dansiteli konjugasyon plaka PinTüm konjugasyon plakaları kadar ug / ml) tutturulmuş edilmiştir. 32 ° C'de 16-36 saat boyunca taze tutturulmuş birinci seçme plakaları inkübe
Not: Seçimi adımlara gelince, zamanın farklı miktarlarda farklı donör ekranlar için gerekli olabilir. Verili bir ekran tüm çift mutantlar aynı donör mutasyon olduğu için, ortalama bir yavaş büyüyen bir donör mutant yavaş büyüyen çift mutasyonlu yolaçmaktadır. Bu nedenle, verici uygunluk bağlı olarak, seçme adımlar 16 ila 36 saat arasında gerektirebilir. Çift mutant saniye sonra ilk seçim ya da görüntüleme sonra iğneleme ya da daha sonraki bir adım için yeterince büyük olduğunda çift mutant büyüme durdurulabilir. Bu genellikle en az 2 mm çapları ortalama kontrolü koloniler sınır çevirir.
1.536-koloni biçimi, ikinci bir çift ilaç (Cm ve Kan), seçimi plaka üzerine her birinci seçimi plaka Re-pin her ilk seçim kolonisi üzerinde dört koloniler tarafından temsil edilmektedir böyleİkinci seçimi plaka. 32 ° C'de 16-36 saat boyunca inkübe plakaları Kantitatif mutant büyüme uygunluk ölçmek için ve gen çiftleri arasındaki etkileşimler (Şekil 3) analiz etmek için nihai çift mutant seçme plakaları fotoğraflarım.
Not: merodiploidy (kısmi kromozom duplikasyonlar) sıklığı yaklaşık 1/1, 000 hücreleri ²⁴ düşük olmasına rağmen, merodiploidy GI maskeleyebilir. Dolayısıyla, biyolojik tüm eSGA ekranlarında çoğaltır eklemenizi öneririz. Neyse ki, ticari tek kullanımlık tabaklar ve plastik iğneleme ped aşağıdaki gibi malzemeler sterilize edici ile üç kez kadar tekrar edilebilir: a göre plakalardan atılır ve Agar plakaları hem de pedler, ardından gece boyunca% 10 ağartıcı içinde ıslatarak ile sterilize edilir % 70 etanol ile yıkama ve ultraviyole ışık altında akış kaputu plasticware hava kurumalı, distile su ile durulayın. Steril pedler ve plakalar kullanılana kadar kapalı steril plastik torbalar içinde depolanır.

4. Veri İşleme ve GI Skorlar türetilmesi

Toplu modunda her plaka üzerinde koloniler ölçün veya ayrı ayrı özel bir koloni görüntüleme yazılımı ^{3, 9} kullanarak.
Not: Uygun bir Java tabanlı high-throughput kolonisi görüntüleme ve puanlama uygulaması şimdi kamu erişimi (serbestçe kullanılabilir http://srcollins77.users.sourceforge.net/ ). Yazılım farklı platformlarda (örneğin Mac veya PC) üzerinde çalışır ve bir yürütülebilir dosya olarak veya bir terminal penceresinden ya başlatılabilir.
Bu tür levha kenar efektleri, inter-plaka değişimi etkileri, düzensiz görüntü aydınlatma, agar yüzeyini fiziksel eğrilik nedeniyle eserler, komşu sömürgeler için rekabet etkileri ve olası bağlantılarını kusurları gibi plakalar içinde ve arasındaki sistematik önyargıları düzelterek ham koloni boyutu ölçümleri Normale , zaman içinde büyüme ve farklılıkları p> 9. Bunlar sistematik eserler çift mutant spor bağımsızdır ve onlar sahte büyüme spor tahminleri doğuran olarak düzeltilmelidir.
Kenar satır ve sütun koloniler plakasının merkezinde bulunan daha düşük bir besin için rekabet nedeniyle daha büyük olma eğilimindedir. Bu nedenle, bu etki için düzeltmek için, kenar kolonilerin boyutları bu satır ve sütun içinde medyan boyutuna plakasının merkezinde kolonilerin medyan boyutuna eşit olacak şekilde ayarlanabilir şekilde büyütülebilir.
Dikkate çoğaltmak koloni ölçümlerinin ortanca boyutlardan tekrarlanabilirlik ve standart varyans almaya istatistiksel sonuçları analiz edin. En az üç bağımsız biyolojik çoğaltmak deneyler deneysel tekrarlanabilirlik değerlendirmek için gereklidir.
Son olarak, aşağıdaki formül kullanarak her gen çifti için bir GI skoru (S) oluşturmak için normalleştirilmiş ortalama koloni gelişimini spor boyutlarını kullanın:

n 1 "src =" / files/ftp_upload/4056/4056eq1.jpg "/>
Yerlerde, S _var = (var _Exp x (n _Exp -1) + değişken _Katkı x (n _Katkı -1)) / (n _Exp + n _Katkı -2); var _Exp = normalize edilmiş koloni boyutları en fazla için varyans çift mutant; referans kümesinden normalize çift mutant kolonisi boyutlarda varyans var _Cont = ortanca; n _Uzm çift mutant koloni boyutlarda ölçümlerin = sayı; n _Cont = deneysel ortanca tüm deneyler üzerinde çoğaltır; μ _Uzm = medyanı normalleştirilmiş çift mutant koloni boyutları ve μ _Cont = tek donör mutant soy kaynaklanan bütün çift mutantlar için normalize koloni boyutları medyan. S-skor bir varsayılan digenic etkileşim istatistiksel güven hem de biyolojik etkileşim gücü yansıtmaktadır. Güçlü pozitif S-skorları hafifletilmesi etkileri, s belirtinizS-skorları negatif önemli sentetik hastalık ya da genellikle paralel yedekli yollar ⁹ üyelik düşündürür öldürücülük, yansıtıyor etkileşen genler, aynı yolun ⁹ katılmasını uggesting. Yolağı düzey fonksiyonel ilişkileri saptamak için, test genlerin her çifti için bir tek S-skoru son veri kümesi elde edilir.
Not: Daha önceki çalışmada ^9, biz rekombinasyon birbirlerinin 30 kbp içinde genler arasında daha az sıklıkla meydana eğilimindedir bulundu. Bu nedenle, mansap analizi, normalizasyon ve skor üretimi takiben, birbirimize 30 kbp içindeki genler arasındaki etkileşimler çıkarın. CBS kendileri yanı sıra, gen çiftleri arasındaki fonksiyonel ilişkiler iki genin GI profilleri ne kadar benzer bakarak incelenebilir. Bir genin GI profilinin dışında genomun içinde tüm diğer genler ile bu genin her etkileşimleri dizisidirgenin bağlantı alanı. Işlevsel olarak benzer genler genetik etkileşim profilleri ^{12, 25} arasında daha yüksek korelasyon sahip olma eğilimindedir. Böylece, deneysel veri kümesi içindeki tüm genler için korelasyon katsayıları hesaplanarak biri bile kromozom üzerinde birbirine yakın yalan genler arasındaki işlevsel ilişkilerin araştırılması için eSGA kullanabilirsiniz.