Elektrik Stimülasyonu murin myoblast Progenitör Hücreler ve Uygulama Mühendislik İskelet Kası Dokular

Özet

Üretimli kas dokusu hastalığı modeli olarak hem de eti için alternatif bir kaynak olarak, rejeneratif tıpta büyük bir potansiyele sahiptir. Burada fare miyoblast projenitör hücreleri ve elektrik sinyalleri tarafından uyarılması, bu durumda, bir kas yapısının mühendislik açıklanmaktadır.

Özet

Engineered kas dokularının ve rejeneratif ilaç için bir alternatif et ^1. basınç ülserleri çalışmak için in vitro olarak örneğin, bir hastalığın örnek olarak kullanım için dokuların üretimi, dahil çeşitli farklı amaçlar için kullanılabilir. İlk rapor 3D kas yapıları yıllar önce yapılan ve alanında öncü Vandenburgh ve arkadaşları ^2,3 olan oylandı. Kas doku mühendisliği alanındaki ilerlemeler biyokimyasal faktörler, kök hücre ve progenitör hücrelerin bilgisi engin kazanç gelen sonuç değil sadece, ama fiziksel faktörlerin hücre davranış kontrolünde önemli rol oynadığı araştırmacılar tarafından kazanılan öngörüleri özellikle tabanlı olan ve doku gelişimi. State-of-the-art mühendislik kas anda hücre nüfuslu hidrojel yapıları oluşur oluşturur. Bizim laboratuvarımızda bu genellikle C2C12, mil murin arka bacak kasları izole sıçan miyoblast progenitör hücreleri, ya da bir fare miyoblast hücre hattı oluşurkollajen / Matrigel oluşan bir karışım ile Duran ve iki ankraj noktası arasındaki kaplama, kas bağları taklit. Diğer hücrelerin yanı gibi L6 sıçan miyoblastları ^4, yenidoğan kas kaynaklı progenitör hücreleri ^5, insan ⁶ hatta indüklenen pluripotent kök hücreler (iPS hücreleri) ⁷ gibi diğer türlerden erişkin kas dokularının türetilen hücreler olarak örneğin alternatif hücre hatları kabul edilebilir . Hücre kontraktilite yapı ^8,9 ve kültür yaklaşık bir hafta sonra kas progenitör hücrelerin farklılaşma uzun ekseni boyunca hücre hizalama yapar. Dahası, elektrikli uyarım uygulama ölçüde ⁸ farklılaşma sürecini geliştirmek olabilir. Çünkü sınırlı boyutu (8 x 2 x 0,5 mm) tam doku örneğin canlılığı, farklılaşma ve hücre hizalama izlemek için konfokal mikroskopi kullanılarak analiz edilebilir. Söz konusu uygulamaya enginee için gereksinimleri bağlı olarakkırmızı kas dokusu değişecektir; diğer türler için bir et alternatif çeviri gerekli olarak hizmet ederken rejeneratif tıp örneğin kullanımı, doku boyutu ve vaskülarizasyon yukarı ölçeklendirme gerektirir.

Protokol

1. Mürin myoblast Progenitör Hücreleri veya C2C12 Hücre Kültürü

1. Başlangıçta Shefer ve arkadaşları ¹⁰ tarafından yayımlanan ve Collins et al. ¹¹ ve Boonen ve ark. ¹² göre adapte protokolüne göre hücreler izole ve sıvı azot içinde bu saklayın. Bu fareler, örneğin, C57BL / 6 gerektirir. Alternatif yöntemler örneğin Li, Y ve arkadaşları ile görselleştirilmiş Deney yayınlanan bir yöntemi, diğer laboratuarlarda kullanılmaktadır. ^13. Reaktifler ve cihazlar için, sayfa 7 ve 8'de verilen tabloda verilir. Tek bir fare kas itibaren genellikle sıvı azot içinde yaklaşık 20 şişeleri cryopreserve yeterli hücre elde edecektir. Sonra, sıvı azot depolama hücrelerinin çözülme için protokol başlar.
2. 25 cm ² Matrigel (1 mg / ml) kaplanmış doku kültürü şişesi içine 1 şişeden hücrelerin yerleştirin ve oluşan büyüme ortamı (GM) (335 ml DMEM gelişmiş, 100 ml cenin bovin eklemeke serum (FBS), 50 ml HS, 5 ml penisilin / streptomisin, 5 ml L-glutamin, 5 ml tavuk embriyo özü (OA)).

Not: Oda sıcaklığı az 2 saat süreyle ceket ve aspirasyon ile Matrigel çıkarın.

3. Hücrelerin yaklaşık olarak 3 gün boyunca her 01:03 alt kültür.
   Bu şu anlama gelir: 3. gün: biri 75 cm ² balon iki 150 cm ² matara (kaplamasız şişeler preplating 30 dk) geçişi hücreleri: günde 6, 75 cm ² balon bir 25 cm ^2, gelen Passage hücreler. Günde 9 tek transfer 150 cm ² balon üç 150 cm ² matara (gerekirse preplate tekrar hücrelerin fenotipi bağlı olarak) kullanılamayabilir 1 üçlü 150 cm ² balon veya eğer. Günde 12 hücreleri kas yapı içine tohum hazır bulunmaktadır.

Notlar: - Üçlü 150 cm ² başına hücre sayısı yaklaşık 4,5 x 10 ⁶ hücre olacak.
- Via kullanınfarklı izolasyonların gelen ls ekimi sırasında hücre karışık bir nüfus elde etmek karıştırın.

Not: birincil piller ile çalışmak istemezseniz, C2C12 miyoblastları iyi bir alternatiftir.

2. Mühendislik İskelet Kası Dokular

1. "Sertleştirici" (10:1) ile "elastomer" karıştırılarak silikon yapıştırıcı hazırlayın. Tek üçgen tarafı (; Şekil 1 şekil ev gibi) ile Velcro 5 mm kare bölümler + / - Kes. Kare arasında yaklaşık olarak 12 mm arasında bir boşluk bir 6-kuyulu kültür plakasının kuyu içine Tutkal Velcro.

Notlar: - Sadece Velcro yumuşak tarafı kullanın ve bu yan yukarıya dönük.
- Çatıları birbirine baktığından emin olun.
- Sadece silikon yapıştırıcı ile Velcro kapak, iyi boyunca tutkal yayılır yok.
- Daha sonra elektriksel stimülasyon için bu iyi bir maç dikey yönde yapıları hizalamak alakalı(uzun ekseni boyunca) yedik.

2. Vakumlu fırın içinde gece boyunca kurumaya bırakın, ısıtmalı değil, öncelikle hava kabarcıklarını çıkarmak için. 15 dakika için inkübe kuyuları ve% 70 EtOH ilave edilerek sterilize edin. PBS ile 3x durulayın ve 15 dakika UV altında koymak. Kuyulardan tüm PBS ve kullanıma kadar kuvöz Velcro ve yer çıkarın.
3. Buzdolabında Matrigel çözüm çözülme ve kısa süre 3D yapıları yapmadan önce istenilen konsantrasyona kollajen solüsyon hazırlanır. Steril% 0.02 asetik asit (nihai konsantrasyon 3.2 mg / ml) ile stok kollajen seyreltilir.

Not: buz üzerinde her şeyi bırakın.

4. GM ve sayısında tekrar süspansiyon hücreleri, Trypsinize. Inkübatör santrifüj tüpündeki hücreler bırakın.
5. Bu kollajen çözüm 0.5M NaOH ekleyin, bir tüp (Tablo 1 'e göre) yapmak istediğiniz yapıları numaraları için Kollajen stok solüsyonu istenilen miktarda Ekle açık pembe Colo kadarr 7,5 arasında bir pH değerine işaret etmektedir. Yukarı ve aşağı pipetleme tarafından yavaşça karıştırın ve kabarcık oluşumunu önlemek. Sonra Matrigel ekleyin ve yavaşça ama iyice çok karıştırın. Nihayet, Kollajen / Matrigel karışımı (uygun miktarlarda için Tablo 1'e bakınız) için GM ekleyin.

Notlar: - buz üzerinde her adımı gerçekleştirin! Matrigel ve kollajen artan sıcaklıkta kolayca jel olacaktır.
- Rengi aslında pembe olduğunu dikkat! PH seviyesindeki artış da hızlı jelleşme neden olacaktır.
Kollajen - nihai konsantrasyon: 1.6 mg / ml.

6. 5 dakika için 1000 rpm'de hücrelerin istenen miktarda santrifüjlenir ve süpernatant çıkarın.

Not: - yapı başına hücre sayısı ayarlanması gerektiğinde hücre faaliyeti bağlı olarak değişir. Tipik olarak, hücre sayısını yapı başına 750,000 ila 1,250,000 hücreler yer alır.

7. Hücre pelet tekrar süspansiyon jel karışımı bazı kullanınve kalan karışımı içine hücreleri aktarmak ve iyice karıştırın, ama hava kabarcıkları tanıtan olmadan.
8. Kuvöz ve pipet Velcro ilk içine hücre jel karışımı 0.35 -0.4 ml ısıtılmış kuyucuğu çıkarın. Ardından, ek siteler arasında merkezine karışımı Pipeti ve Velcro uzatmak başlar. Son olarak, Velcro parçaları etrafında iki Velcro çapa ve pipet arasındaki boşluğu doldurmak için jel kalanını da kullanabilirsiniz.
9. Jeller aktarılacak yeterince sağlam olup olmadığını dikkatlice 5-10 dakika sonra kontrol edin, yani hafifçe yemekleri dokunun ve jel katı ise görsel inceleyin. Eğer öyleyse, bir inkübatörde yemekleri dikkatle yerleştirin. Genellikle, onlar on dakika sonra alınabilir. Daha sonra, 1-2 saat sonra, yavaşça sıcak GM 4 ml her biri jel üzerinde görüntülenir.

Not:-Do tabak tutarken güçlü hareketleri yapamaz.

10. (Büyüme ortamında farklılaşma, orta GM değiştirincivciv embriyo özü olmadan) 24 saat sonra, ve taze orta 2-3 günde bir ile değiştirin. Gün 7 sitesinde sigortalı kas liflerinin çapraz çizgili gelişimi için boyama ile değerlendirilebilir gibi, olgun odaklı kas liflerinin elde olmalıdır.

3. Elektriksel Stimülasyon

1. Bir güvenlik kabininde UV altında% 70 etanol ve sonra kuru kullanmadan önce ionoptix plaka elektrotlar (reaktifler ve ekipman tabloya bakınız) sterilize edin. Yapıları ile kültür plaka üzerine elektrotlar ile plaka yerleştirin ve kültür plaka ve bir inkübatöre transfer kapağı ile kapatın. Kablolar ile uygun Ionoptix C-pacer bağlayın.

Not: Elektrotlar kas yapı (Şekil 2) ile birlikte paralel olarak yerleştirilir.

2. Beklendiği gibi stimülasyon protokolü uygulayın.

Not: Biz genellikle, 4 V / CM kullanın2Hz bir frekansta 6ms bakliyat. Kültür ortamı uyarılma sırasında her 24 saat değiştirin.

Sonuçlar

Son ürün olarak Şekil 3 'de gösterilen kas yapı olacaktır. Doku büyüklüğü yaklaşık 8 mm uzunluğunda, 2 mm genişliğinde ve 0,5 mm kalınlığında olacaktır. Farklılaşması sırasında elektrik stimülasyonu miyozin ağır zincir izoform ifadesi değişecektir, ancak farklılaşma orta 8 ile uyarılan olarak büyük ölçüde farklılık sürecini geliştirmek değil, aynı zamanda elektrik stimülasyonu kas işlevselliğinin kontrol etmek için işlem sonunda uygulanabilmektedir ?...

Tartışmalar

Kas dokularının mühendislik rejeneratif tıpta ilaç tarama için bir hastalık modeli olarak ve et üretimi için kullanılmak üzere büyük bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, bu tür uygulamalar için gereksinimleri değişir. Kollajen hücre hizalama sağlar çünkü önceki 2B çalışmaları ¹² yılında belirlenen miyoblast progenitör hücreler bazal membran kaynaklı proteinlerin varlığını gerektirir çünkü, kollajen ve Matrigel kombinasyonu ile çalışmayı seçti. Ayrıca, fibrin...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Matrigel-büyüme faktörü azalır	Beckton ve Dickinson
DMEM (yüksek glukoz) *	Gibco	42430
Gelişmiş DMEM	Gibco	12491
At serumu	Gibco	65050-122
Fetal bovin serumu	Greiner	758075
0.45 ve 0.22 mikron şırınga filtresi *	Whatmann (Schleicher ve Scheull)	10462100
L-glutamin	Gibco	25030024
Penisilin / streptomisin	Gibco	10378016
Amfoterisin	Gibco	15290-018
Kültür plastik	Greiner		Kültür şişeleri ve pipetler içerir
Civciv embriyo özü	Amerika Birleşik Devletleri Biyolojik	C3999
Pasteur pipeti *	Hilgenberg		Pamuk, açık ucu L daralma ile Pasteur pipetler,: 0,9 ucu çapı 230 mm - 1,1 mm
Pasteur pipeti *	Hilgenberg		Pamuk, açık ucu L daralma ile Pasteur pipetler,: 1,4 ucu çapı 230 mm - 1,6 mm
Pasteur pipeti	VWR	612-1702
Kollajenaz tip I*	Sigma	C0130-16
40 mikron hücre süzgecinden *	BD Falcon	352340
19G iğne
Elastomer	Dow Corning şirketi	3097358-1004	Silastik MDX 4-4210 #
Ajan Kür	Dow Corning şirketi		Silastik MDX 4-4210 #
Velcro	Düzenli mağaza		Siz düzenli bir mağazasında bu satın alabilirsiniz, sadece yumuşak tarafı kullanın
Kollajen tip I, sıçan kuyruğu	BD Biosciences	3544236
C-Pace EP Kültür Pacer	Ionoptix
Elektriksel uyarım için 6-kuyulu kültür tabaklarında	Beckton Dickinson-Falcon	BD Falcon # 353846
C-Bulaşık kültür çanak elektrotlar	Ionoptix
			* Hücrelerin izolasyonu (puan 1.1) için ihtiyaç duyulan # Birlikte tek bir kit içerisinde