Donma İnsan ES Hücreler

Özet

Burada bizim laboratuvar tonlar insan embriyonik kök hücre hatları donuyor nasıl göstermektedir.

Özet

Burada bizim laboratuvar tonlar insan embriyonik kök hücre hatları donuyor nasıl göstermektedir. Sağlıklı, katlanarak genişleyen kültür, aksi takdirde tripsin tepki söndürmeye kalan ortamı çıkarmak için PBS ile yıkanır. Sıcaklaşır% 0.05 tripsin-EDTA sonra hücrelerin eklenir ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe izin plaka. Bu süre içinde hücreleri yuvarlama gözlenen ve koloniler plaka yüzeyinden kaldırırken olabilir. Nazik tekrarlanan pipetleme plaka yüzey hücreleri ve koloniler kaldıracaktır. Tripsinize hücreleri kalan tripsin gidermek için, önceden ısıtılmış embriyonik kök hücre medya içeren bir standart konik bir tüp yerleştirilir ve daha sonra spun. Hücreler medya, bir donmuş kısım 10cm plaka üzerinde bir kültürü yeniden canlandırmak için yeterli olduğu gibi bir konsantrasyon mL konsantrasyonda yaklaşık bir milyon hücre bir büyüme ortamı yeniden süspanse. Hücreleri yeterince yeniden süspanse sonra, buz gibi dondurma medya eşit miktarda eklenir. Hücre süspansiyonları iyice karıştırılır dondurma şişeleri içine aliquoted ve 24 saat içinde yavaş yavaş-80C dondurmak için izin. Donmuş hücreler daha sonra uzun süreli depolama için sıvı nitrojen buhar fazında taşınır, ya da yaklaşık altı ay -80 kalır.

Protokol

1. Sağlıklı, katlanarak genişleyen kültür, aksi takdirde tripsin tepki söndürmeye kalan ortamı çıkarmak için PBS ile yıkanır.
2. Sıcaklaşır% 0.05 tripsin-EDTA sonra hücrelerin eklenir ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe izin plaka. Bu süre içinde hücreleri yuvarlama gözlenen ve koloniler plaka yüzeyinden kaldırırken olabilir.
3. Nazik tekrarlanan pipetleme plaka yüzey hücreleri ve koloniler kaldıracaktır.
4. Tripsinize hücreleri kalan tripsin gidermek için, önceden ısıtılmış embriyonik kök hücre medya içeren bir standart konik bir tüp yerleştirilir ve daha sonra spun.
5. Hücreler medya mL konsantrasyonda yaklaşık bir milyon hücre bir büyüme ortamı yeniden süspanse.
6. Hücreleri yeterince yeniden süspanse sonra, buz gibi Donma Medya eşit miktarda eklenir.
7. Hücre süspansiyonları iyice karıştırılır dondurma şişeleri içine aliquoted ve 24 saat içinde yavaş yavaş-80C dondurmak için izin.
8. Donmuş hücreler daha sonra uzun süreli depolama için sıvı nitrojen buhar fazında taşınır, ya da yaklaşık altı ay -80 kalır.

Not: 106 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon gibi donmuş bir kısım 10cm plaka üzerinde bir kültürü yeniden canlandırmak için yeterli.

Tartışmalar

Dondurma tonlar hücre hatları için tarif tekniği tonlar hücre hatları ve ayrıca herhangi bir ilgi memeli hücre etkin bir şekilde depolanması ve diriltmek için iyi çalışır. Karyotip anormallikler ortaya çıkabilir ve anormal hücreler hızlı bir hat üzerinden alabilir, embriyonik kök hücre hatları ile çalışırken küçük bir oranda her bir geçit hücrelerinin dondurulması önemli bir husustur. Bu nedenle, dondurulmuş belli pasajlar büyük bankaların yanı sıra her geçit böler son derece arzu edilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
HuES Medium	medium			For a total of 651.5 mL, add: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA 6.5 mL + beta-mercapt–thanol 0.6 µL (14.3 M stock) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium	medium			80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulfoxide). Stored at 4 °C.