Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA'ların görselleştirilmesi

Özet

Burada memeli doku kültürü hücrelerinde endoplazmik retikulum ilişkili mRNA'ların görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, floresan, ardından sitoplazmik boşaltılmaya digitonin ile birlikte plazma zarının geçirgenliği seçici içerir In situ melezleme.

Özet

Ökaryotlarda salgılanan ve membran proteinleri endoplazmik retikulum (ER) yüzeyine lokalizedir kodlamak haberci RNA'lar (mRNA) çoğu. Bununla birlikte, bu mRNA'ların görselleştirme zor olabilir. Bu mRNA yalnızca bir kısmını ER ilişkili olduğunda özellikle doğrudur ve bu organel kendi dağıtım olmayan hedefli (yani "özgür") transkript tarafından engelleniyor. Aynı anda ER bütünlüğünü korurken ER-ilişkili mRNA izlemek için, biz, hücreler seçici olarak plazma zarının bir permeabilizes digitonin ekstraksiyon çözeltisi için kısa bir maruz kalma ile muamele edildiği bir yöntem geliştirilmiştir ve bu nedenle sitoplazmik içeriğini kaldırır adres . Bu yöntem in situ hibridizasyon (FISH) flüoresan ile birleştiğinde, biri açıkça floresan mikroskobu ile ER-bound mRNA'ların oluşturulabiliyor. Bu protokol kullanılarak yığın poli (A) ya da spesifik mRNA transkriptleri için ya da ER-bağlantının derecesini tespit edilebilirve hatta sayılabilir. Bu süreç içinde bir mRNA ER etkileşimlerinin doğası araştırmak için bu testte kullanılabilir.

Giriş

Ökaryotlarda mRNA kodlama çeviri ^3,4 sırasında ribozomlar ve translocons arasındaki doğrudan etkileşim yoluyla salgılanan ve membran proteinlerinin eş Çevrimsel sinyal tanıma parçacık ^1,2 ER hedeflenebilir ve ER korunabilir. Ancak, mRNA hedefli ve ribozomlar veya çeviri birinin ER bağımsız üzerinde muhafaza edilip edilemeyeceğini çok yakın zamanlara kadar belli değildi. Önceki çalışmalar hücresel fraksiyonlama teknikleri kullanılarak ER ile çeviri bağımsız mRNA ilişki olup olmadığını değinmeye çalıştık. Sert kimyasal koşulların potansiyel hassas mRNA-ER dernek kesebileceği ER türetilmiş veziküller, ribozomların kesmek için gerekli olduğu için, bu çalışmalarda ^5-8 delil sağlayan, sonuçsuz ve ^9,10 karşı ribozomal bağımsız mRNA ER ankraj .

Bu sorunları aşmak için bir proto geliştirdikcol yalıtmak ve görüntü ER bağlı mRNA'ların için. Bu prosedür, aynı anda ER morfoloji ve ilişkili moleküllerin tüm koruyarak etkin bir şekilde hücre (ER-bağlı olmayan mRNA dahil), tüm içerik sitoplazmik kaldıran bir hafif çıkarma tedavi, içerir. Bu protokolü kullanarak biz mRNA'ların bir alt hedef ve sonra bağımsız ribozomlar veya çeviri ¹¹ ER muhafaza olduğunu göstermiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Ekstraksiyon için Materyallerinin Hazırlanması

1. Hücre Hazırlanması
   1. Deney öncesinde en az bir gün için asit ile tedavi edilen lameller üzerine Tohum doku kültürü hücreleri. Bu iki hücre hatları salgılanan protein güçlü üretim sergilemek ve iyi tanımlanmış bir ER sahip olarak biz, COS-7 veya U2OS kullanın. Yüksek ekstraksiyon verimi elde etmek için, hücrelerin deney gününde lamel confluency% 80 geçmemesi gerektiğini unutmayın.
   2. Belirli bir eksojen mRNA araştırılmaktadır, hücreler transfeksiyon standart protokoller kullanılarak ilgilenilen geni ihtiva eden plasmidler ile tohumlama bir gün sonra, transfekte edilir. Hücreler daha sonra ekstre etmeden önce en azından 18 saat için mRNA ifade etmek için izin vardır.
2. Çeviri İnhibitörleri ile Hücreleri Tedavisi
   1. ER ile mRNA'ların dernek bakım sağlam ribozomların etkisini test etmek için, hücrelerin dernek bozabilir çeviri inhibitörleri ile tedavi edilebilirmRNA ¹¹ ribozomların.
   2. (4-metil-2 ,6-dinitroanilino -) - bu tür homoharringtonin (HHT), pactamycin ya da 2 gibi bir çeviri başlatma inhibitörü, aynı anda için meşgul ribozom izin verirken, N-methylpropionamide (mdmp), transkript ile ilişkilendirilmesi yeni ribozom önlemek Çeviri ^12-14 tamamlayın. Memeli hücrelerinde en proteinler için çeviri oranı ne olursa olsun, kodon kullanım veya mRNA uzunluğu ^15, ikinci başına 5 amino asit olduğu için, 30 dakikalık bir muamele 27,000 nükleotidler (proteinler için kodlama yapan sürece açık okuma çerçeveleri ile mesajların ribozom kapalı temizlemek gerekir ) 9,000 amino asitler sürece.
   3. Böyle puromisin gibi İnhibitörleri doğmakta zincirin erken ejeksiyon teşvik etmek ve böylece polysomes ¹² bozabilir. Ancak tamamen mRNA ile puromisin-tedavi ribozomların dernek bozmaya, EDTA gibi magnezyum şelatörlerin digitonin ekstraksiyon tamponu ¹¹ eklenmelidir.
   4. Bu deneyde, hücreler 200 uM puromisin, 5 uM HHT, veya ekstraksiyon önce 30 dakika için kontrol aracı ile tedavi edilir.
3. Digitonin Ekstraksiyon Tampon hazırlanması. Ücretsiz (yani sitoplazmik, non-ER-ilişkili) transkript engel olmadan ER-yerelleştirilmiş mRNA'ların görselleştirmek için, biz seçici digitonin, 3β-hydroxysterols ile tercihen etkileşime bir steroid glikozit ile hücre geçirgenliği. Düşük konsantrasyonlarda, digitonin seçici 'leakiness' ¹⁶ sebep plazma zar bölümleri permeabilizes. Aksine, kolesterol yoksul ER zarı ve çekirdek zarı, ^16,17 değişmeden kalır.
   1. Digitonin (Sigma Aldrich) tozu% 5 ağırlık / hacim deiyonize su içinde çözülür ve bu stok çözelti küçük miktarlar halinde bölünüp edilir ve -20 ° C'de saklanır Bizim tecrübelerimize göre, birden fazla donma-çözülme döngüleri çözünmüş digitonin verimini azaltır.
   2. Bir stok solüsyonuCHO 10x tampon (1x çalışma çözeltisi konsantrasyon: 115 mM Kac, 25 mM HEPES pH 7.4, 2.5 _mM MgCl2, 2 mM EGTA, 150 mM sakaroz), RNase içermeyen reaktiflerle hazırlanır ve -20 ° C'de depolanır Bir çalışma çözeltisi (1 x tampon CHO) RNase içermeyen su ile stok çözelti seyreltilmesi ile hazırlanır ve 4 ° C'de saklanır

2. Digitonin Ekstraksiyon

1. Ekstraksiyon Çözümleri hazırlanması
   1. Düz bir yüzeye sahip ısıtma bloğu ısıtılır ila 40 ° C ile ekstraksiyon sırasında bu sıcaklıkta tutulur.
   2. RNase içermeyen bir çalışma düz bir yüzey oluşturmak için, ısıtma bloğu Parafilm M (Bemis Company, Inc) taze bir parça ile bir miktar su ve üste konan ile nemlendirilir. Parafilm levha ve ısıtma bloğu arasındaki hava kabarcıkları RNaz içermeyen eldiven ve Kimwipes (VWR) kullanılarak düzgünleştirilir.
   3. 1x CHO tampon, bir su banyosu içinde inkübe edilerek 37 ° C'ye kadar ısıtılır.
   4. 6 oyuklu plakalar yıkamak için kullanılırve hücreler sabitleyin. 3 kuyuda her satırı bir kapak kayma için kullanılır. Satırdaki birinci iki kuyu için ısıtılmış CHO tampon, 2 ml ilave edilir. Son olarak da için, tespit çözelti 2 ml (PBS +% 4 paraformaldehit (Elektron Mikroskop Bilimleri)) ilave edilir. Hücreleri çıkarılması için hazır olana kadar Bu kaset 37 ° C inkübatör saklanabilir.
   5. Digitonin ekstraksiyon çözeltisi hemen önce kullanmak için sıcak CHO tamponu ile% 0.025 için stok digitonin çözüm seyreltilmesi ile hazırlanır. Yine puromisin işlenmiş hücreleri için, ekstraksiyon tamponu ilave verimli ribozomların ¹¹ bozmaya 20 mM EDTA içermelidir unutmayın. Ekstraksiyon çözeltisinden 100 ul damlaları çıkarma hemen önce, parafilm kaplı bir ısıtma bloğu üzerine yerleştirilir.
2. Digitonin Ekstraksiyon ve Hücre Fiksasyon
   1. 37 ° C inkübatör gelen hücreleri çıkarın.
   2. Ayıklama işlemi sırasında, lamelleri Jewler forsepsi yardımı ile işlenir. Ileforseps lamel pick up ve büyüme orta yıkamak için de içeren ikinci sonra birinci ve CHO tampon içine batırın.
   3. Hızla bir Kimwipe ile lamel arka tarafı kapalı aşan tampon kapalı kurulayın ve hemen ekstraksiyon çözeltisi üzerine, aşağı bakacak lamel, hücre yan yerleştirin.
   4. 10 saniye sonra, forseps ile lamel pick up ve hemen hücre yan sıra içeren% 4 paraformaldehid sabitleme tampon, yukarı bakacak, aktarın.
   5. Oda sıcaklığında, en az 15 dakika için sabitleştirici içinde örnek inkübe izin verin.
3. Unextracted Kontrol Hücrelerinin hazırlanması. Bir unextracted kontrol numunesinin hazırlanması için iyi bir fikirdir, sitoplazma içinde mRNA toplam miktarını belirlemek için.
   1. Lamelleri üzerinde yetiştirilen hücreler digitonin ayıklama adım (2.2.3) atlanır olması dışında, (bakınız Bölüm 2.2) yukarıdaki gibi hazırlanır.
   2. Tespit edildikten sonra, un-Ayıklanan hücreler PBS permeabilize gerekir +% 0.1 TritonX-100 oda sıcaklığında 15 dak.

3. BALIK Boyama

1. Floresan in situ hibridizasyon probları için tasarlama
   1. Ilgili bir mRNA sekansı bu gibi birincil RNAstructure 5.0 ¹⁸ olarak RNA ikincil yapı tahmini yazılımı kullanılarak katlanır. MRNA kıvrımlar görsel önemli ikincil yapıların serbest yaklaşık 50 nükleotid belirlemek için değerlendirilir.
   2. Bu bölgenin ters tamamlayıcı prob 5 'ucu (Integrated DNA Technologies firmasından satın alınmıştır) bağlanmış bir Alexa546 florofor ile sentezlenir.
   3. Prob -20 ° C'de muhafaza edilebilir 100 uM'lik bir stok konsantrasyonu RNase içermeyen su ile seyreltilir
2. FISH probları ile Boyama
   1. Digitonin-Çıkartılan hücrelerinin daha fazla geçirgenliği gerektirmez, ancak,% 0.1 2 ml ile bu sabit örnekleri tedavi Not Triton X-100 ile seyreltilirPBS FISH boyamadan önce oda sıcaklığında 15 dakika için, bir arka plan sinyali azaltmaya yardımcı olur.
   2. Slaytlar sonra herhangi bir kalıntı paraformaldehit veya Triton X-100 uzaklaştırmak için PBS ile iki kez yıkanır.
   3. Hücreler daha sonra 1X sodyum sitrat tampon (150 mM NaCl ve 15 mM sodyum sitrat) içinde% 25 ile% 60 formamid ile iki kere yıkanır. Genel olarak, uzunluğu 50-60 nükleotid olan belirli FISH probları için,% 60 formamid kullanılır, ancak oligo (dT) FISH sonda ile poli (A) mRNA boyama için, formamid seviyesini% 25 düşürülür.
   4. Boyanma oda hazırlamak için, 150 mm'lik bir Petri kabı alt su ile kaplıdır ve parafilm bir parça su üzerinde yüzen edilir. Böylece su parafilm tabağın tabanına bağlı sağlayan, çanak fazla döndürerek çıkarılır. Hava kabarcıkları elle Kimwipes ile kaldırılır.
   5. Her bir lamel lekeli edilebilmesi için, eşit üzerine çıkar FISH prob ihtiva eden bir çözelti hibridizasyon 100 ul damla pipetleboyama odasında afilm. Stok FISH probunun bir çalışma konsantrasyonu için hibridizasyon tamponu içinde% 25 ile% 60 formamid (1 x SSC, 100 mg / ml dekstran sülfat, 1 mg / ml maya tRNA, 5 mM vanadil ribozit kompleks,% 25-60 formamid) ile seyreltilir 0.2 uM. Formamid miktarı, kullanılan özel sonda için optimize edilmiş ve SSC yıkama tamponu içinde olduğu gibi aynı konsantrasyonda (adım 3.3.3 bakınız) mevcut olması gerektiğine dikkat edin.
   6. Lamel bu gibi doku kültürü kuluçka makinesi gibi bir nemlendirilmiş bir oda içinde 37 ° C sıcaklıkta boyama oda içinde FISH çözelti üzerine hücre yan yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirilir ve 5-24 saat için kuluçkalanır.
3. Lekeli örnekleri Çamaşır ve montaj
   1. Bir RNaz ücretsiz yıkama alanı hazırlamak için, böyle bir laboratuar tezgah olarak düz bir yüzey üzerine parafilm bir şerit, uzandı. Parafilm yüzeye ıslak, düz olduğundan emin olmak için, üstüne parafilm yerleştirin ve elle Kimwipes ile herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın.
   2. Boyama odasıdırinkübatör çıkarıldı ve bir düz yüzey üzerine yerleştirilir. Lamelleri sonra her lamel kenarında FISH yıkama tamponu yaklaşık 500 ul pipetleme tarafından süzülüyor edilir. Çözüm kılcal hareket yoluyla lamel ve parafilm arasındaki çekilecektir.
   3. Her bir lamel için, yıkama tamponu 1 ml (1 x SCC% 25-60 formamid, 3.3.3 adım bakınız) yıkama alan parafilm (adım 3.4.1) üzerine pipetle konulur.
   4. Forseps kullanılarak, lamelleri boyama oda çıkarılır ve her bir yıkama tamponu damla üzerine yerleştirildi ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi. Yıkama işlemi 3 kez tekrarlanır.
   5. Cam slaytlar% 70 etanol ile yıkandı ve Kimwipes ile kurutulur.
   6. Her lamel için, montaj çözümü (DAPI Fluoromount G, Güney Biotech) 25 ul slayt üzerine pipetle konulur. Bu çözüm 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), lekeleri DNA içerir ve çekirdeklerin görselleştirme sağlar unutmayın.
   7. USIng forseps ile Kimwipes, lamel arka kurutulur ve aşırı FISH yıkama tamponu örnek kurutma olmadan kapalı bulanıklaşmıştır. Her lamel sonra montaj solüsyonu damla üzerine, aşağı bakacak hücre yan yerleştirilir.
   8. Atlı sonra numuneler etiketlenir ve 4 mağaza olabilir ° C

4. Görüntüleme ve Ölçülmesi

1. Görüntüleme
   1. Bir Epifloresans mikroskop görüntüsü FISH boyama sonrasında hücreler için kullanılır. Transfekte hücre uygun kanal parlak floresan sinyal tarafından untransfected hücreleri ayırt edilebilirler. İdeal olarak, her bir alınan alanın aynı zamanda ölçümü için arka plan floresan belirlemek için kullanılmak üzere bir untransfected hücre içerir.
   2. Için FISH ve DAPI kanalın her alanın görüntüleri elde edilir. Hücreler protein işaretleri ile birlikte-lekeli Ek olarak, eğer, immünofloresans kanalın bir görüntü de elde edilir. Digitonin çıkarma de kullanılabilir dikkat edinizER-bağlı ribozomlar ve protein ¹¹ görselleştirmek için.
   3. Alanlar arasındaki floresans yoğunlukları karşılaştırıldığında olabilir emin olmak için, her bir kanal için maruz kalma süresi deney her set için sabit kalmalıdır.
   4. Yine farklı lamelleri üzerine hücreleri arasındaki floresan yoğunlukları mukayese edilebilir olmasını sağlamak için, FISH sinyal epiluminescence yoğunluğu veya çürüme gün-gün değişiklikleri görüntüleme tek bir oturuşta lamelleri her minimize edilmelidir.
2. Niceleme. ER yerelleştirilmiş mRNA miktarını ölçmek için, Nikon NIS Eleman yazılımı kullanın. Bununla birlikte bu tür ImageJ gibi diğer görüntü analiz programı kullanılır.
   1. Nikon NIS ELEMANI görüntü analizi aracını kullanarak, hücre çevre ve çekirdek İlgi (ROI) ayrı Bölgesi olarak özetlenmiştir.
   2. Her bir ROI, floresan yoğunluğu (I _T total hücre yoğunluğu ve ben için _N içinNükleer yoğunluk) ve alan (A _T ve A _N) kaydedildi ve bir excel elektronik tablo ihraç edilmektedir.
   3. Her bir görüntü için, arka plan floresan yoğunluğunu (I _B) olmayan bir transfekte edilmiş bir hücre yoğunluğu kayda tarafından belirlenir. Poli (A) mRNA düzeyleri analiz ediliyor ise, bir hücre serbest bölge seçilir.
   4. ER toplam miktarı (ekstre hücreleri) ve sitoplazmik (unextracted hücreleri) floresan formül ile hesaplanır:
      [A _T] [I _T - I _B] - [A _N] [I _N - I _B]
   5. Nükleer boyanma yoğunluğu de hesaplanır ve çeşitli tedaviler arasında iç kontrol olarak da kullanılabilir. Çekirdekler digitonin tedavi ¹⁷ veya ribozom bozulması ¹¹ etkilenmez yana, nükleer mRNA miktarı bu tedavilerin her biri arasında sabit kalmalıdır. Aşağıdaki formül kullanılır nükleer floresans hesaplamak için:
      [A _N] [I _N - IB]
   6. ER-hedefli olan sitoplazmik mRNA yüzde 30-40 unextracted hücreler (tekrar 4.2.4) elde edilen ortalama sitoplazmik floresans bölünmesiyle 30-40 çıkarılan hücrelerin ortalama ER floresans (Madde 4.2.4) alınarak hesaplanabilir . Bu ayıklanır ve unextracted hücreleri, hazırlanan lekeli ve paralel görüntülü önemlidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

ER-ilişkili olan mRNA yüzdesi, plasental alkalin fosfataz (ALPP) ya da sitokrom P450-8B1 (CYP8B1) ya da digitonin ile ekstre edilmiş ve daha sonra çözülmüştür, ya da direkt olarak tespit edildi içeren plazmitler ile birlikte transfekte edilmiş COS-7 hücreleri belirlemek için (bkz. Şekil 1, karşılaştırın "Ctrl Çıkarılan" için "Ctrl Unextracted"). Nükleer olmayan floresan örnekleri ve ER-ilişkili mRNA fraksiyonu (Şekil 2) he...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Çeşitli Subselüler sitelere mRNA'ların lokalizasyonu, mRNA localisation proteinler ile transkript etkileşimi aracılığıyla, bir hücre içi ve yerel gereksinimler nihai hedefe proteinlerin doğru sıralama için ve gen ekspresyonu ince ayar için önemli bir yaygın bir olgudur bölge ^19,20.

Tahlil kullanılarak burada açıklandığı gibi, bu salgı proteinleri kodlayan mRNA ribozom ya da çeviri varlığında veya yokluğunda, ER muhafaza edilebilir olup olmadığı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.