EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Özet

Protein kompleksleri önemli hücre fonksiyonlarını katalize eder. Birçok temel komplekslerinin detaylı fonksiyonel ve yapısal karakterizasyonu rekombinant üretimi gerektirir. MultiBac özellikle ökaryotik protein ve kompleksleri ifade etmek için özel bir bakülovirüs / böcek hücre sistemidir. MultiBac açık erişim platformu ve faydayı maksimize için geliştirilmiş standart çalışma prosedürleri olarak uygulanmıştır.

Özet

Proteomics araştırmalar benzeri görülmemiş ayrıntılı olarak ökaryot proteomlarda etkileyici karmaşıklığı ortaya çıkardı. Şimdi hücrelerdeki protein soyutlanan varlıklar olarak değil var ama çoğu değilse tüm hayati fonksiyonları için hücrede montaj hatları oluşturan, insanlar on veya daha fazla, pek çok diğer proteinler ile birlikte biyolojik aktivite uygulamayın bir genel kabul gören bir kavramdır. ^{1 ,} bu multiprotein meclislerin işlevi ve mimarisi ² Bilgi detaylı analiz için üstün kalite ve yeterli miktarda kendi ayrılmasını gerektiren. Hücreleri içinde birçok protein kompleksleri yetersizliği, ökaryotlarda, özellikle doğal kaynaklardan ekstraksiyon yasaklar, ve rekombinant üretim gerektirir. Bakulovirüs ekspresyon vektör sistemi (BEVs) ökaryotik proteinler üretmek için özellikle yararlı olduğu kanıtlanmıştır, ve aktivite genellikle translasyon sonrası işleme dayanan yaygın olarak kullanılan diğer ekspresyon sistemleri genellikle mümkün olduğudesteklemez. ³ BEVs ilgilenilen genin da tercih edilen bir proteini üretmek böcek hücresi kültürleri enfekte içine eklenmiş bir rekombinan bakulovirüs kullanın. MultiBac özellikle birçok alt birimleri içeren ökaryotik protein kompleksleri üretimi için özel olan bir BEVs olduğunu. ⁴ verimli proteinlerin üretimi ve kompleksleri için hayati bir ön koşul ideal olarak uygulanabilir bir ifade deneyde ilgili tüm adımlar için sağlam protokolleri standart operasyon prosedürleri (SOP) ve karşılaştırmalı kolaylıkla uzman olmayan kullanıcılar tarafından da takip. Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuarı (EMBL) de platformun MultiBac proteinin küçük ölçekli analizlerine heterolog protein üretimi özellikleri için optimize edilmiş bir mühendislik bakuloviral genlerin genomun içine sokulmasını başlayarak, bir multiprotein karmaşık ifade deney ile ilgili tüm adımlar için SOP kullanır üretilen numuneler. ^5-8 platformuEMBL Grenoble bir açık erişim modunda yüklenir ve akademi ve protein kompleksi araştırma projeleri hızlandırmak için sanayiden birçok bilim adamı desteklemiştir.

Giriş

Biyolojik aktivite protein ve hücresel fonksiyonları katalize uyum içinde hareket diğer biyomoleküllerin meclisleri tarafından kontrol edilir. Önemli örnekler mesajcı RNA DNA bulunan kalıtsal bilgi transkripsiyonun makine içerir. İnsanlarda, 100'den fazla protein olan RNA polimeraz II ve bu TFIID, ve diğerleri gibi TFIIH genel transkripsiyon faktörlerini içerir. ⁹ Diğer örnekler de dahil olmak üzere 10 ve daha fazla alt-birimleri ile büyük multiprotein kompleksleri oluşturarak, gen transkripsiyonu için bir tanımlanmış ve regülasyonuyla bir araya gelip ribozom, protein sentezi, ya da ökaryotlarda çekirdek zarı yoluyla biyomoleküllerin mekik sorumludur nükleer gözenek kompleks katalize birçok protein ve RNA molekülleri arasında oluşur. Hücrede aslında tüm bileşenli makineleri ayrıntılı bir mimari ve biyokimyasal diseksiyon işlevlerini anlamak için çok önemlidir. Prokaryotik ve eukar yapısı aydınlatılmasıyotic ribozomlar, örneğin, bu makromoleküler makineleri hücre n belirlenen işlevlerini yerine nasıl içine görülmemiş fikir veren damgasını olaylar oluşturmuştur. ^10,11

Ribozomlar hücre kütlesinin% 30'u ribozomların oluşması nedeniyle, kültürlenmiş hücrelerden endojen malzeme saflaştırılmasıyla detaylı bir çalışma için yeterli kalitede ve miktarda elde edilebilir. RNA polimeraz II diğer önemli kompleksler ezici çoğunluğu ancak mevcut zaten maya kültürü daha az büyüklükte siparişleri ile bol ve birçok bin litredir transkripsiyon merkezi bu temel karmaşık ayrıntılı bir atom görünümü elde etmek için işlenecek vardı. ¹² böylece yerli hücrelerinde olmuş, ve çok daha düşük miktarda yerel kaynak malzemeden yeterli saflaştırılmış edilemez. Ayrıntılı yapısal ve fonksiyonel analiz için erişilebilir bu tür kompleksleri işlemek için rekombinant te kullanarak heterolog üretim gerektirirchniques.

Rekombinant protein üretimi yaşam bilim araştırma üzerinde önemli bir etkisi vardı. Birçok protein yeniden birleştirilerek üretilen ve kendi yapısı ve işlevi yüksek çözünürlükte disseke edildi. Yapısal genomik programları yüksek verimli (HT) modda tüm organizmaların gen ürünü repertuar yönelik birçok organizmaların genomları en aydınlatılması yararlanmaktadır. Protein yapılarının Binlerce böylece belirlenmiştir. Bugüne kadar, yeniden birleştirici protein üretimi için en çok üretken kullanılan sistem E. olmuştur coli ve birçok ekspresyon sistemleri bu ev sahibi heterolog üretimi için yılda gelişmiş ve rafine edilmiştir. E. protein üretimini sağlamak için işlevleri bir bolluk barındıran plazmid coli ticari sağlayıcılarının tüm katalogları doldurun.

Bununla birlikte, E. coli birçok ökaryotik protein üretmek için uygun yapmak bazı sınırlamaları vardır ve pçok sayıda alt-birimleri ile eklem protein kompleksleri. Bu nedenle, ökaryotik ana protein üretimi giderek son yıllarda tercih edilen yöntem haline gelmiştir. Ökaryotik proteinler üretmek için özellikle çok uygun sistem laboratuarda yetiştirilir böcek hücresi kültürleri bulaştırmak için, heterolog genleri taşıyan bir rekombinan bakulovirüs dayanır bakulovirüs ekspresyon vektörü sistemine (BEVs) 'dir. MultiBac sistem özellikle birçok alt birimden (Şekil 1) ile ökaryotik protein komplekslerinin üretimi için uygun olan, daha yakın zamanda geliştirilmiş BEVs olup. MultiBac ilk olarak 2004 yılında tanıtıldı. ¹³ tanıtılmasından bu yana, MultiBac sürekli geliştirildi ve kullanımı kolaylaştırmak hedef protein kalitesini artırmak ve genel olarak verimli standart operasyon prosedürleri (SOP) tasarlayarak uzman olmayan kullanıcılar için sistem erişilebilir hale getirmek için dere-astarlı. ⁴ MultiBac ac içinde, dünya çapında birçok laboratuvarda uygulamaya konmuşturademia ve sanayi. Grenoble EMBL de, uluslararası erişim programları araştırma ilerleyen bu üretim sistemi kullanmak isteyen bilim adamları için MultiBac platformda uzman eğitim vermek için Avrupa Komisyonu tarafından uygulamaya konuldu. Onlar EMBL Grenoble de MultiBac tesisinde operasyonda olduğu gibi şimdiye kadar erişilebilir değildi birçok protein komplekslerinin yapısı ve fonksiyonu MultiBac ile üretilen numuneler kullanılarak aydınlatıldı. ⁴ Aşağıda, MultiBac üretim önemli adımlar protokolleri özetlenmiştir.

Protokol

1. Multigen İfade Yapıları oluşturmak için tandem Recombineering (TR)

1. Ortak ifade stratejisini planlama. Vericiler ve alıcılar içine ilgi genler eklemek için tasarım yaklaşımı. Lütfen kompleks potansiyel fizyolojik alt modüller özel alıcıları ve Bağış birlikte gruplandırılmalıdır. Bireysel Donör ve Alıcı plazmid üzerinde ifade kasetleri birleştirmek BstXI çift ^7,8 siliko ilgili tüm yapıları oluşturma ve deneysel çalışma geçmeden önce iyice strateji doğrulamak - Homing endonükleaz (HE) oluşan Çarpma Modülü kullanın.. Örneğin, ilgili genleri, o ya da diğer sınırlama sitelerini ve doğru açık okuma çerçeveleri (ORF'ler) varlığı teyit edilmesi gerekmektedir içeren değil kontrol edilmelidir. Protein üretimi seviyeleri hem de herhangi bir exi çıkarılmasını geliştirmek için böcek hücre kodon kullanımı ve mRNA ikincil yapısını optimize sentetik genler sipariş düşününHE ilgi genlerinden siteleri acı. Esnek veya maruz N-ya da seçtiğiniz proteinlerin C-Termini ile ilgili literatür verilerine dayanarak arıtma etiketleri yerleştirerek düşünün. Bireysel proteinlerin nispi miktarları karmaşık nedeniyle stokiyometri sorunları kontrol edilmesi gerekiyorsa karmaşık birçok protein alt üretmeyi hedefliyoruz poliprotein stratejileri uygulayarak düşünün. "Nasıl Yapılır" belge (elektronik laboratuar kitap tavsiye edilir) ⁴ ayrıntılı hazırlayın içeren projenin tüm öngörülen deneysel adımlar tam multigen yapı (lar) kadar lider. Berger grup ana sayfa (indirilebilir Cre-ACEMBLER yazılımı kullanarak örneğin Cre-LoxP erimiş plazmid elektronik dosyaları oluşturmak www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / CRE-acembler ).
2. Seçilen Bağış içine ilgi genler yerleştirin veRestriksiyon enzimleri ve ligaz kullanılarak, veya alternatif olarak, yayınlanan protokolleri takip ligasyon bağımsız yöntemler kullanarak alıcıları. ^5,6,14 bir sıvı taşıma iş-istasyonuna erişimi varsa ve elde edilecek yapıları çok sayıda (planlıyorsanız kombinatoryal yaklaşımlar için örneğin) bir sıvı taşıma iş istasyonu mevcut değilse Berger grubu (Şekil 2). ^14,15 tarafından geliştirilen ve uygulanan robotik komut dosyalarını kullanarak düşünün, mikrotitre plakaları kullanarak manuel kullanım moda gibi bir HT gen ekleme sağlar.
3. Ifade alt birimlerinin stokiyometri kontrol etmek için ihtiyaç dayattığı kısıtlamaları hayata olabilir. Bir protein kompleksinin tek tek alt birimlerinin stokiyometrik olarak dengesiz ekspresyon düzeylerinin durumunda, s aralıklı tek bir büyük ORF da kompleks birçok alt birimden ve belirli bir proteaz (örneğin tütün etch virüsü Nla proteaz) birleşmek için poliprotein stratejiler uygulayarak dikkatepecific proteolitik siteleri. ^4,8 düşünün eş-ifade eden bir çok alt-birimleri ile çok büyük bir kompleks olan ve yaygın olarak tek tek alt biriminin moleküler ağırlığı arasında değişen eğer tek bir ekspresyon kasetleri, bir kez ya da birkaç poliproteinlerin. Göz önünde ko-ifade bu proteinin düşük üretim verimi ile karakterize edilir, bir poliprotein içinde, ya da daha fazla özdeş ekspresyon kasetleri ile aynı proteini kodlayan birçok gen. ^4,13
4. Kısıtlama haritalama (isteğe bağlı olarak yüksek verimli) ve sıralama ile klonlanmış tüm Donör ve Alıcı yapıları doğrulayın. Tercih multigen ifade yapıları oluşturmak için Cre-LoxP rekombinasyon tarafından Donör-Alıcı kombinasyonları sigorta geçin. Kısıtlama haritalama Alıcı-Verici füzyon plazmid arıtılmış doğrulamak, Cre-ACEMBLER veya bir referans olarak benzer programlar tarafından oluşturulan elektronik dizileri kullanın.
5. -20 ° C'de saf ve doğrulanmış Bağış, alıcıları ve Donör-Alıcı füzyonlarını Mağaza veya -80 ° C Arşiv plasmids ve daha sonra kullanım için dikkatli dizileri (Microsoft Excel, Filemaker, diğerleri).

2. Kompozit multigen Baculovirus Üretimi, Amplifikasyon ve Depolama

1. Viral genom ve Tn7 aktarılması için gerekli işlevleri barındıran DH10 hücrelere dönüştürerek multigen transferi vektörleri MultiBac bakuloviral genom entegre edin. Multibac bakuloviral genom Tn7 entegrasyon önceki vivo Cre reaksiyon bir tarafından kendi LoxP sitesinde ilgi belirli genler (YFP işaretleyici, chaperones, vb) (Tn7 eki siteye distal genomuna mühendislik) ile önceden yüklenmiş olabilir unutmayın. ¹³ Tn7 aktarılması sonra, ilgi genleri içeren kompozit bakülovirüs ile hücre beyaz / mavi tarama (β-galaktosidaz α-tamamlama kaybı başarılı Tn7 aktarılması sonuçları seçilir, bu nedenle, doğru Tn7 aktarılması ile koloniler seçici bir beyaz kalırgar X-gal içeren plakalar) ve genom alkalin lisizi ve etanol / izopropanol çökeltme ile hazırlanır. ^5,6
2. Transfeksiyon ve ilk virüs üretimi. Steril bir başlık içine yerleştirin 6-çukurlu bir doku kültür plakası. Geçmiş faz, Sf21 böcek hücre kültüründen, tarif edildiği gibi kültür ortamı içinde karıştırıldı saflaştırılmış baküloviral genomu ve bir transfeksiyon reaktifi ekleyerek kuyular ve transfekte hücrelerin alikotları üzerinden tohumu. Ortam kaldırarak 48-60 saat sonra hasat ⁶ ilk virüsü ( yüksek kalite, düşük titre virüs V _0, iyi başına tipik olarak 3 ml). Ilave 2-3 gün sonra, protein üretimi için taze ortam ve test (ve bir YFP işaretleyici mevcut ise, flüoresan) için ek. ^6,7
3. Virüs Amplifikasyon, düşük İçişleri Bakanlığı rejimi. Küçük (100-250 mL) çalkalama Erlenmeyer şişeleri içinde ajite log fazında hücrelerin 25-50 ml (mi başına hücre yoğunluğu <1x10 ⁶ hücre) enfekte etmek için virüs V ₀ kullanınyörünge platform shakers üzerinde (Şekil 3). Hücre sayımı ve hücreler (çoğalması tutuklama) iki katına durana kadar her 24 saat ayrıldı. Bir (hücre başına virüs parçacıkları enfeksiyonu yani sayısı çokluğu) İçişleri Bakanlığı düşük rejimi takip edin: Hücreler bir kez (İçişleri Bakanlığı <1), aksi V ₀ daha küçük bir hacmi ile deneyi tekrar (en az) iki katına gerekir ekledi. Normal olarak, V, _0, 3 ml 0.5x10 ⁶ hücre / ml 'lik bir yoğunlukta, Sf21 böcek hücreleri, 25 ml hastalık bulaştırmak için kullanılmıştır. Bu zararlı önlemek için şarttır ilgi heterolog genlerin kaybına neden olabilir virüs aşırı büyütmesi ve otomatik silme. Hücreleri peletleme ve virüs içeren medya kaldırarak 48-60 saat sonra hasat V ₁ virüsü (25-50 ml). ^6, 1x10 ⁶ hücre her 12 veya 24 saat çıkarmadan peletleme ve protein üretimi ve işaretleyici protein (YFP) sinyali doğrulayarak. Tarafından YFP ve protein üretimi için taze medya ve test ile Ek, (virüs AmplifyV ₂₎ daha büyük ifade hacimleri yukarıdaki düşük İçişleri Bakanlığı rejimi (hücreleri V ₁ ile enfeksiyon sonrası en az bir kez çift gerekir) saygı V ₁ virüsü ile 2 L Shaker şişeler 400 ml hücrelere kadar nüfuz ederek yöneliktir eğer. Sıkı artık ilgi genleri içeren kusurlu virüslerin birikmesini önlemek için amplifikasyon sırasında protein üretimi ve işaretleyici protein sinyal test edin. Her amplifikasyonlar de biriken ^5-7 Kullanım hücre pelet ilgi ifade protein kompleksi için arıtma protokolü kurulması için zaten adım.
4. Üretim virüs BIIC depolama. Önemle kullanılarak üretim virüsü gibi V ₂ virüs saklamak için tavsiye BIIC (B aculovirus-i C arşın nsect nfected) rekombinant virüs değişiklikler (ilgilenilen genin örneğin kayıp) önlemek ve yüksek ifade korumak için, yöntem seviyes çoğalması tutuklanmasının ardından 24 saat gözlenmektedir ¹⁶ Pelet enfekte hücreleri -. onlar medya içine (tomurcuklanma ile) serbest olacağını hemen önce bu aşamada hücre tam viral parçacıkların içerir. Sıvı nitrojen içinde ortam ve hücre taneciklerine dondurularak bölüntülerin ve süresiz saklayın. ^7,16

3. Protein Üretimi ve Aşağı İşleme

1. Büyük (r) kültür ve izleme YFP enfekte. Üretim süreçleri (2 L şişeler içinde tipik olarak 400 ml) daha büyük hücre kültürleri bulaştırmak için V, _{1, 2} veya dondurulmuş BIIC alikotları kullanın. Düşük İçişleri Bakanlığı rejimi (öyle ki enfekte kültürü en az bir kez iki katına enfeksiyon için kullanılan virüs ses seviyesini ayarlamak) uyun. Şişe sayısı çarpılarak gerekirse enfekte kültür hacimleri Büyüt. YFP işaretleyici protein varsa, belirli aralıklarla 1x10 ⁶ hücre geri pelet ve hücreler lyse ve bir plato ind ulaşılana kadar YFP sinyal evrimi izlemekmaksimum yeniden birleştirici protein üretimi icating. YFP seviyeleri floresan sinyalleri (örneğin, Tecan SPECTRAFluor) kayıt kapasitesine sahip standart bir 96 çukurlu tabla okuyucusu ölçülebilir. Bu aşamada hücreler hasat. -20 ° C (kısa süreli) veya -80 mağaza hücre pelet ° C (uzun vadeli).
2. Hücre parçalama ve ayrıştırma. Protein gereksinimlerini (donma-çözülme, sonikasyon, Fransız basını, diğerleri) uygun seçtiğiniz favori yöntemi, hücreleri lyse. ^5-7 damıtmak sitozol ve ilgi proteinlerin varlığı için çekirdek ve test. Protein saflaştırma basitleştirmek için sonuçlarına göre arıtma protokolü geliştirin. Sizin protein nükleus yerleşimli ise yüksek KCl koşullar altında nükleer fraksiyonu adresinin protein ayıklamak için nemlendirici yöntemler uygulanarak düşünün. ^7,18
3. Protein saflaştırma (mikro ölçekli, büyük ölçekli). Hücre kültürü genellikle küçük miktarlarda (10 ya da 25 mL) ile su olduğuna dikkatnedeniyle bakulovirüs / böcek hücre sistemleri (L kültür ve daha başına protein genellikle 10-100 mg), heterolog proteinlerin tipik olarak yüksek veya çok yüksek üretim seviyelerine ilgi proteinlerin önemli miktarda saflaştırılması için hücre pelletleri elde etmek için fficient. Mikro saflaştırma (yuvalı plakalarda, mikro tip yöntemler, GE Healthcare ÄKTAmicro sistemi, diğerleri) ile bağlantılı olarak bu biyokimyasal ve aktivitesi ile ilgili veriler ve genellikle de nanolitre ölçekli, yüksek verim kristalleştirme için istenilen proteinlerin ve kompleksleri yeterli miktarda (HTX elde etmek mümkündür .) Küçük iyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisi ile bağlantılı olarak, saflaştırma kolaylaştırmak için kompleks, protein alt birimlerinin maruz metal afinite saflaştırma (Clonetech Takara Talon Qiagen NiNTA Metal kelat yapıcı reçineleri) ve bir oligo-histidin (6-10 kalıntıları) etiketi kullanılarak göz önünde Örneğin ÄKTAmicro veya benzer bir küçük hacimli arıtma makinesi (Şekil 4 ile hacimleri ). Diğer yakınlık arıtma adımları ve oligo-histidin etiketleri veya diğer etiketleri ile yakınlık arıtma ek olarak iyon değişimi (IEX) adım (diğerleri GST, MBP, CBP, seçim) can ve düşünülmelidir, proteinlerin biyokimyasal özelliklerine göre ilgi ve bireysel tercihler. Arıtma verimi artırmak için afinite etiketleri ile etiketleme birden fazla altbirim düşünün. Sizin saflaştırılmış protein kompleksleri Konsantre ve gliserol olan veya olmayan dondurma gibi depolama protokolleri kurmak. Arıtılmış proteinlerin toplu-seri değişimi değerlendirmek için (etkinlik testleri, biyokimyasal ve biyofiziksel testler) standart olarak uygulanabilir kalite kontrol kriterleri geliştirin.

Sonuçlar

MultiBac sistemiyle elde heterolog proteinlerin güçlü ortak ifade Şekil 1d (süspansiyonuna hücre kültürü bulaşmasını 48 saat sonra alınan probları) 'de gösterilmiştir. Aşırı ekspresyona uğramış protein bantları tüm hücre ekstresi (SNP) ve temizlenir lizat (SN) açıkça görülebilir. Üretilen protein malzeme kalitesi ve miktarı genellikle Şekil 1e gösterilen bu mitotik kontrol noktası karmaşık MM gibi protein kompleksleri, yapısı tespitine imkan ve...

Tartışmalar

Şekiller 2 ve 3'te ek video görüntüleri çoklu gen ifade cDNA'dan robot yardımıyla kuşaktan tüm süreci gösteren protein üretimi için bir böcek hücresi kültürlerinin enfeksiyon tüm yol oluşturur. Yeni reaktifler (plazmid ve virüs) ve sağlam protokolleri SOPler dayanarak bir boru hattı sağlamak için geliştirilmiştir. Tüm boru hattı Grenoble EMBL bir platform teknolojisi olarak uygulamaya konmuştur. MultiBac platformu multiprotein araştırma yapan akade...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bluo-Gal	Invitrogen	15519-028 (1 g)
Tetracycline	Euromedex	UT2965-B (25 g)	1,000X at 10 mg/ml
Kanamycine	Euromedex	EU0420 (25 g)	1,000X at 50 mg/ml
Gentamycine	SIGMA	G3632 (5 g)	1,000X at 10 mg/ml
IPTG	Euromedex	EU0008-B (5 g)	1,000X at 1M
Cre-recombinase	New England BioLabs	M0298
X-Treme GENE HP transfection reagent	Roche	06 366 236 001
Hyclone SFM4 Insect	Thermo Scientific	SH 30913.02
6-well plate Falcon	Dominique Dutscher	353046
2 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357507
5 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357543
10 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357551
25 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357535
50 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357550
50 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352070
15 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352096
1.8 ml cryotube Nunc	Dominique Dutscher	55005
100 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211917
250 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211918
500 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211919
2 L shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211921
Certomat Orbital Shaker + plateau	Sartorius	4445110, 4445233
Liquid nitrogen tank dewar 35 L	Fisher Scientific	M76801
Biological Safety Cabinet Faster	Sodipro	FASV20000606
Optical Microscope	Zeiss	451207
Sf21 Insect cells
Hi5 Insect cells	Invitrogen	B855-02
Tecan freedom EVO running Evoware plus	TECAN
10 μl conductive tips (black),	TECAN	10 612 516
200 μl conductive tips (black)	TECAN	10 612 510
disposable trough for reagents, 100 ml	TECAN	10 613 049
twin.tec PCR plate 96, skirted	Eppendorf	0030 128.648
96 well V bottom, non sterile	BD falcon	353263
96 deepwell plate color natural, PP)	Fisher	M3752M
PS microplate, 96 well flat bottom	Greiner	655101
96 deepwell plate	Thermo scientific	AB-0932
24 well blocks RB	Qiagen	19583
DpnI restriction enzyme	NEB	R0176L	20 U/uL
NEBuffer 4 10X	NEB	B7004S
2X phusion mastermix HF	Finnzyme	ref F-531L
2X phusion mastermix GC	Finnzyme	ref F-532L
DGLB 1.5X	homemade		7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF
High DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10496-016
Low DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10068-013
E-gel 48 1% agarose GP	Life Technologies	G8008-01
Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit	Macherey Nagel	740 708.24
PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract	Macherey Nagel	740 707.2
Gotaq green master mix	Promega	M7113
T4 DNA polymerase, LIC-qualified	Novagen	70099-3
DTT 100 mM	homemade
Urea 2 M	homemade
EDTA 500 mM pH 8.0	Homemade
LB broth (Miller) 500 g	Athena ES	103