Bireysel Renal Hücreli Kanserlerde içinde Protein Ekspresyonu Varyasyon kaynakları için Ters Faz Protein Diziler (RPPA) ve Kullanımı

Özet

RPPA floresan etiketli antikorlar kullanılarak, aynı anda sorgulanmak üzere nitroselüloz slaytlar basılı örnekleri yüzlerce, protein ekspresyonu sağlar. Bu teknik, şeffaf hücreli böbrek karsinomu olan ilaç tedavisi heterojenliğin etkisini araştırmak için uygulanmıştır.

Özet

Bulunduğu metastatik şeffaf hücreli renal hücreli kanser için hiçbir iyileştirici tedavi, hastalığın yaygın varyantı vardır. Bu tedaviye direnç önemli bir faktör hastalığı ¹ moleküler karmaşıklığı olduğu düşünülmektedir. Gibi tirozin kinaz inhibitörü (TKİ)-sunitinib olarak Hedefli tedavi kullanılmıştır, ancak hastaların sadece% 40 1 yıl ² içinde relaps bu hastaların büyük çoğunluğu ile cevap verecektir. Renal hücreli kanser hastalarında içsel ve kazanılmış direnç gibi soru ³ derece alakalı olduğu gibi.

Etkili, kişiselleştirilmiş tedavilerin geliştirilmesi nihai hedefi ile, TKI direnç incelemek için, hedeflenmiş tedavinin belirli bir süre sonra sıralı dokusu, kronik myeloid lösemi ⁴ başarılı olduğunu kanıtlamıştı bir yaklaşım gereklidir. Ancak renal hücreli karsinom, böyle bir stratejinin uygulama b yüksek düzeyde nedeniyle karmaşıklaşırrenal hücre karsinomu ^5,6 yanı sıra diğer katı tümörler ^içinde bir ⁷ özelliği oth arası ve intratumoral heterojen. Transkriptomik ve genetik farklılıklar nedeniyle Intertumoral heterojenite iyi bile benzer sunum, evre ve tümör derecesi olan hastalarda kurulmuştur. Buna ek olarak daha büyük moleküler heterojenite temsil etmek olasıdır BİK büyük morfolojik (intratümöral) heterojenite, var olduğu açıktır. Kombine morfolojik analiz ve Fuhrman derecelendirme ile BİK tümörlerin detaylı haritalama ve kategorizasyon proteomik analiz için temsili alanların seçimini sağlar.

BİK ⁸ Protein temelli analiz nedeniyle patoloji laboratuvarlarında yaygın durumuna cazip olmakla birlikte, uygulama spesifik antikorlar ⁹ sınırlı durumu nedeniyle sorunlu olabilir. Ters Faz Protein Dizilerin dot blot doğa (RPPA), antikor zorunluluktur Borçlar be ön doğrulanmış; kullanılan antikorların böyle sıkı kalite kontrol olarak büyük önem taşımaktadır. Bu kısıtlamaya rağmen dot blot biçimi tek bir nitroselüloz slayda örnekleri yüzlerce baskı sağlayan, tahlil minyatür izin vermiyor. Baskılı slaytlar sonra çoğullama sağlayan, hedefe özgü primer antikor ve fluoresan etiketli ikincil antikoru kullanılarak Batı analizi ile benzer bir şekilde analiz edilebilir. Slayttaki tüm örneklerin genelinde Diferansiyel protein ekspresyonu sonra bir daha maliyet-etkin ve yüksek-throughput şekilde floresans göreli düzeyi karşılaştırılarak aynı anda analiz edilebilir.

Protokol

1. Morfolojik ve Moleküler Tümör heterojenliği tanımlanması

1. Tümörler -80 ° C derin dondurucu kaldırıldı ve kuru buz üzerinde tutulmalıdır.
2. Yaklaşık 1 cm ³ bölüme tümörleri bölün. Her bir tümör, birbirlerine göre göreceli bölüm ve bir benzersiz ismi ile etiket ilk konumuna Harita. Mağaza örnekleri -80 bireysel kriyotüplerin ° C Kullanıma hazır oluncaya dek.
3. Coat örnekleri OCT ve -22 ° C'de kriyostat kesilmiş
4. Örnekleri Hematoksilen-Eozin counterstaining yöntemi kullanılarak boyandı.
5. Dondurulmuş kesitlerin Mikroskopi analizi onlar ccRCC doğa, canlı tümör ve dereceleme (frozen Fuhrman sınıflarda 1 ila 4 ayırt etmek zor düşük dereceli, yüksek dereceli veya karışık yüksek / düşük dereceli,) için vardır sağlamak. Şekil 1 a ve b (H & E boyama yüksek, düşük ve karma sınıf).
6. Protein ekstraksiyonu için her tümör içindeki her morfolojik farklı bölgeden 4 örnekleri kadar seçin.

2. Tümör Örneklerinde Protein Ekstraksiyonu

1. OCT tümör örneği kesin.
2. Lizis tamponu, 990 ul ile 2 ml'lik tüp içine doku il 50-75 mg [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EGTA (pH 8.5), 150 mM NaCl] aprotinin (Sigma A6279) (10 mg ile desteklenir / ml), fosfataz inhibitörü kokteyl 2 (Sigma P5716), fosfataz inhibitörü kokteyl 3 (Sigma P0044) ve bir proteaz inhibitörü kokteyl (Roche, 11836153001).
3. Her bir tüp için tek bir 5 mm çelik top ekleyin ve iki kez her 5 dk süre sonra, bir TissueLyser kullanılarak homojenizasyon seviyesini kontrol 5 dk için 50Hz'de homojenize.
4. Arkasında çelik topu bırakarak pipet kullanarak yeni 2 ml tüp homojenize örnek aktarın.
5. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 13,000 x g'de santrifüj önce her bir numune için Triton X-100, 10 ul ekle
6. Taze mikrosantrifüj tüpleri için süpernatan aktarın.
7. BCA assay (Şekil 2) kullanarak protein konsantrasyonu tayin edilir.
8. 1 mg / ml protein konsantrasyonu normalize edilir.

3. Antikor Doğrulama

1. Western blot için protein örneklerinin (uygun hücre hatları veya doku çıkarılır) hazırlayın ve% 10'luk SDS-PAGE jel üzerinde çalıştırın.
2. 4 gecede nitroselüloz membran üzerinde örnekleri aktarın ° C.
3. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca Li-Cor Odyssey engelleme tamponu (PBS içerisinde seyreltilmiş, 50:50) içinde membran engelleme.
4. Üreticileri de Li-Cor Odyssey Engelleme Tampon birincil antikorlar (PBS 50:50 seyreltilmiş) seyreltin seyreltme 1,000 tipik 1 önerilir.
5. 4 ° C'de gece boyunca birincil antikor olarak zar inkübe
6. % 0.1 PBS-Tween20 (; 1 ml Tween20 / 1L PBS PBS-T) Makyaj.
7. 5 dakika (x3) ile, oda sıcaklığında PBS-T içinde zar yıkayın.
8. Odyssey Engelleme Tamponu (PBS 50:50 seyreltilmiş) 0.01% 1:10,000 dilusyondaki SDS (1.5 μl/15 ml) sekonder antikor floresan etiketli seyreltin.
9. Ikincil membran inkübehafif sallama ile 45 dakika için oda sıcaklığında antikorları - bu şekilde sonunda taranmıştır zamana kadar, ışıktan korumak için zar önemlidir.
10. Karanlıkta zar tutma 5 dk (x3) ile, oda sıcaklığında PBS-T içinde zar yıkayın.
11. Yine karanlıkta zar tutma kalıntı Tween20 kaldırmak için 5 dak (x3), oda sıcaklığında PBS içinde zar yıkayın.
12. Karanlıkta filtre kağıt parçası düz membran yatın ve kurumaya bırakın - kuru membran sinyal geliştirmek ve arka plan azaltmak ancak sıyırma ve yeniden tarama için işe yaramaz hale gelebilir sağlar.
13. Licor Odyssey tarayıcının membran tarayın. Bu tarandıktan gibi zamana kadar karanlıkta membran tutun.
14. Sadece doğru moleküler ağırlık tek bir bant oluşturmak baskın antikorları seçmek. Şekil 3 RPPA ile kullanım için kabul edilebilir ve kabul edilemez antikorların örnekleri gösterilmektedir.

4. RPPA Printing

1. Protein lizatları bir MicroGrid II robotik gözcü kullanarak nitroselüloz kaplı cam slaytlar (Fastslides-whatman) üzerine tespit edildi. Kullanılan slaytlar örnekleri tespit edildiği üzerine 2 pedleri içeriyordu. Her ped Bu durumda 100 örnekleri, özdeş örnekleri ile fark edildi. Diğer kullanılabilir biçimler 1, 8 ve 16 ped slaytları içerir. Pedleri sayısı arttıkça daha küçük her biri üzerine tespit edilebilir numune sayısıdır.
2. Beş 2 kat dilüsyonlarının bir dizi her örnekten yapılmış ve her sonra (örnek başına 15 noktalar toplam sonuçlanan) üç nüsha olarak görüldü.

5. RPPA Protein Algılama

1. Aşırı Licor Engelleme Tampon Islak slaytlar (PBS 50:50 seyreltilmiş). Bir sallanan platform üzerinde 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
2. Istenen konsantrasyonlarda Licor Engelleme Tamponu (PBS 50:50 seyreltilmiş) primer antikor 800 ul hazırlayın ve buz üzerinde tutmak.
3. Ya (i) tek bir kare Chip Klip slaytlar monteveya (ii) 'FastFrame' dört defne slayt tutucu yüzden sıkı bir mühür slayt ve inkübasyon odası arasında oluşan olduğunu.
4. Kuyulardan rezidüel tamponu çıkarın ve ilgili kuyulara 600 ul primer antikor ekleyin.
5. 4 gecede platformu sallanan bir kapalı ıslak kutu ve inkübe içine slayt ve odasına yerleştirin ° C
6. % 0.1 PBS-Tween20 (; 100 ul Tween 20/100 ml PBS PBS-T) Makyaj.
7. Soğuk oda slaytları çıkarın ve dikkatle her kuyudan primer antikorlar çıkarın.
8. PBS-T 600 ul ekleyin ve 5 dakika (X3) için RT platformu sallanan ilgili slaytlar yıkayın.
9. Odyssey Engelleme Tamponu (PBS 50:50 seyreltilmiş) 0.01% ilk etapta 1:2,000 seyreltme (1 ul / 2 ml) SDS içinde seyreltilmesi ile floresan etiketli sekonder antikor hazırlayın.
10. Kuyulardan tamponu çıkarın ve ilgili kuyulara 600 ul floresan etiketli sekonder antikor ekleyin. Hafif sallama ile 45 dakika için oda sıcaklığında sekonder antikor inkübe - buNihayet tarandı zamana kadar, ışıktan korumak için zar önemlidir.
11. Oda sıcaklığında 600 ul PBS-T iyi ve kısaca yıkama (x3) ikincil antikorlar çıkarın. Taşıyıcı slayt çıkarın ve uygun bir kaba aktarın ve karanlıkta membran tutarak, 15 dakika boyunca aşırı PBS-T yıkayın.
12. Yine karanlıkta zar tutarak, kalıntı Tween-20 çıkarmak için PBS-T ile 15 dakika süreyle oda sıcaklığında PBS ile yıkayın daha fazla zar çıkarın.
13. 10 dakika için 50 ° C fırın içinde Fastslide kurutun ve sonra Li-Cor Odyssey tarayıcı üzerinde tarama. Tarandiktan kadar karanlıkta slayt tutun.
14. Sekonder antikor / kullanılan antikorlara bağlı 680 nm ve / veya 800 nm'de slayt tarayın. İki renk algılama için daima çapraz reaksiyon en aza indirmek için yüksek çapraz adsorbe sekonder antikorlar kullanır. Primer ve sekonder antikor dikkatli seçilmesi iki renk algılama için gereklidir. Birincil öneme seçimidiriki primer antikorları için farklı konak türler (örneğin tavşan ve fare). Bu kolayca ayırt emisyon spektrumları ile boya etiketli anti-tavşan ve anti-fare sekonder antikor tarafından ayrımcılık sağlar.
15. Resim dosyaları. Tiff dosyası olarak kaydedilir. Şekil 4 (taranan dosyaların görüntü).

6. Veri Analizi

1. MicroVigene Yazılım (VigeneTech, Carlisle, MA, ABD) başlatın.
2. Açın. RPPA slayt tarama içeren tiff görüntü dosyası.
3. RPPA slayt görüntü üzerinde bindirmek için bir kılavuz olacak bir önceden tanımlanmış şablon dosyası seçin.
4. Click Izgara getirmek için, faiz getirisi (ROI) düğmesinin Bölgeleri tanımlayın.
5. RPPA noktalar üzerinde Izgara konumlandırın. Şekil 6a (resmin üzerine ızgara görüntüsü).
6. Tüm ROI vurgulamak için Tümünü Seç düğmesini tıklatın.
7. Tümünü Bul'u tıklatın. MicroVigene autom olacakatically ROI bulmak noktalar bulmak, plan çıkarma, herhangi bir toz kaldırmak ve noktalar ölçmek.
8. RPPA Slayttaki tüm örnekler için sonuçlar getirmek için Görünüm Seyreltme Eğri düğmesini tıklatın.
9. Seyreltme Veri Kaydet'i tıklatın.
10. Her numune 5 seyreltme noktalar üzerinde yazdırılır olarak üç nüsha halinde, her analiz için 15 puan, hata riskini azaltır ve eğri uydurma kalitesini artırır vardır. MicroVigene antijen-antikor bağlanma kinetik bir Sigmoid eğrisi üretmek için tüm noktalar içeren bir 4-parametreli lojistik-log modeli "Supercurve" algoritması (Şekil 6b), üretir. Varsayım aynı antikor-antijen bağlanma kinetik ortak bir yanıt eğrisi sığdırmak için bir dizi tüm noktalar alarak böylece, hatta farklı örneklerdeki, her numune noktada gerçekleşiyor eğri uydurma ^10,11 güvenini artırabilir olduğunu
    Y = a + ((ba) / (1 + e (c * d-ln (x)))
    x dilutio olduğuK faktörü ve Y sinyal yoğunluğudur.
    Numuneler nispeten analizimize supercurve üzerine bu eşleme sonra x değerlerinin orta noktasından y değeri karşılık y0 değeri kullanılarak analiz edilebilir.
11. Şekil 7'deki gibi Microsoft Excel ve arsa y0 verileri aktarın.
12. İntratümöral protein varyans bir ANOVA çerçevede işlenmemiş ve işlenmiş hastalar için ayrı ayrı hesaplanmıştır. Tüm analiz proteinlerden gelen verilerin birleştirilmesi Varyans dağıtımları Mann-Whitney testi (MWT) ile karşılaştırıldı. Yanlış keşif hızı (FDR) düzeltme ¹² uygulandı; bireysel proteinlerin İntratümöral varyansları normallik ve homoscedasticity varsayımları Lillefours ve Fligner testleri kullanılarak sırasıyla, ölçme-değerlendirmeye düzenlenen bir F-testi ile karşılaştırıldı. Işlenmemiş ve işlenmiş hasta numuneleri arasındaki Diferansiyel protein ekspresyonu student t-testi kullanılarak her protein için test nerede normallik ve homoscedasticity varsayımlar aksi MWT yapıldı karşılandı; FDR kombine t-testi ve MWT değerler üzerinde ¹² uygulandı. Proteinler için protein ekspresyonu ve varyans Pearson korelasyon Önemi standart bir yaklaşım kullanılarak hesaplanmıştır [R referans] ve FDR ¹² uygulanır.

Sonuçlar

Taranan RPPA kayar bir örnek 680 ile gösterilen kanallar 800 nm her ikisi de, Şekil 4 (i) 'de görülebilir. Dalga boyu, Şekil 4 (ii) ile görüntü ayırma analiz edilmesi için RPPA kayar ve Şekil 4, (iii) tespit bireysel protein ekspresyonu üzerindeki her bir yastık sağlar. Şekil 4'te görüldüğü gibi (iii) örnek üzerinde tek proteinlerin ekspresyonu gelsolin çok daha düşük bir protein ifade vardır cMYC gö...

Tartışmalar

Burada sunulan RPPA yöntemi protein analizleri yaygın olarak kullanılan ancak nispeten düşük verim western blot için yüksek kapasiteli bir alternatif temsil eder. Yöntem örnekleri yüzlerce analiz edilmiş ve aynı anda hücre hatları ve doku örnekleri geniş bir yelpazede yer alan önemli proteinlerinin doğrudan karşılaştırma için izin karşılaştırıldığında yarı kantitatif olmasına imkan verir. Farklı antikor türleri ile Multiplexing daha çok antikor aynı anda kullanılmasına izin tekni?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası
Aprotinin	Sigma	A6279
fosfataz inhibitörü kokteyli 2	Sigma	P5726
fosfataz inhibitörü kokteyli 3	Sigma	P0044
proteaz inhibitörü kokteyl	Roche	11836153001
Triton X-100	Triton-X	T8787
Li-Cor Odyssey Tampon Engelleme	Li-Cor	927-40000
TissueLyser	Qiagen	85600
MicroGrid II robotik gözcü	Biorobotics
FastFrame 'dört defne slayt tutucu	Whatman	10486001
FAST Slayt - 2-Pad	Whatman	10485317
IRDye 680LT keçi anti-fare IgG	Licor	926-68020
IRDye 800CW keçi anti-tavşan IgG	Licor	926-32211