, Yavaşlatıldı Hızlandırılmış ve Ters Honey Bee Model Yaşlanma ile Örneklerin Alınması

Özet

Bal arısı işçiler, yaşlanma sosyal davranışları ziyade kronolojik yaşına bağlıdır. Burada çok farklı yaşlanma desenleri ile işçi-tipleri elde edilmiş ve hücresel yaşlanma için analiz edilebilir göstermek.

Özet

Çok sosyal hayvanlar Dernekleri yakından ilgili bireyler arasında büyük farklılıklar ömrü bulunmaktadır. Sosyal böcekler arasında, bal arısı ömrü ve yaşlanmanın plastisite sosyal faktörler ile açıklanmaktadır nasıl çalışma için iyi kurulmuş bir modeldir.

Bal arılarının işçi kast nektar ve polen toplamak damızlık eğilimi hemşire arılar, arılar ve silaj içerir. Önceki iş beyin fonksiyonları ve uçuş performans hemşireler daha silaj daha hızlı senesce göstermiştir. Silaj geri hemşirelik görevleri dönmek Ancak, beyin fonksiyonları, kurtarabilirsiniz. Hızlandırılmış yaşlanma ve ters fonksiyonel bu gibi desenler protein bolca değişikler ve bağışıklık fonksiyonu, değiştirilmiş metabolik kaynak seviyeleri ile bağlantılıdır. , Vitelogenin, hormonal kontrol ve hücresel savunma uyarlanmış işlevleri olan bir yumurta sarısı protein, işçi farklı yaşlanma dinamiklerini kontrol eden bir ağda önemli bir düzenleyici eleman olarak hizmet edebilir.

Burada hemşire ve silaj ortaya çıkması izlenir, ve daha uzun ömürlü hemşire içine genellikle kısa ömürlü silaj ters dahil olmak üzere, nasıl manipüle edilebileceğini açıklar. Bizim temsilcisi sonuçları benzer kronolojik yaş ile bireylerin deneysel koşullar altında silaj ve hemşire arıların içine ayırt nasıl gösterebilir. Biz geri hemşirelerle silaj davranış tersine valide nasıl örneklemektedir. Son olarak, burada hücresel yaşlanma lipofusin birikimi, yaşlanma evrensel bir biyomarker ölçülerek değerlendirilebilir kadar farklı gösterir.

Sosyal etkileri bağlantı olabilir mekanizmaları eğitim ve plastisite yaşlanma için, bu protokol, ilgili örnek malzeme elde etmek ve gelecekteki çalışmalar arasında veri karşılaştırılabilirliği artırmak için ayarlanmış standart bir araç sağlar.

Giriş

Çok sosyal hayvanlar kompleks koloni yapıları üreme kastın etkileşimi yoluyla korunur ve farklı sosyal görev davranışları tipik olmayan-yenidenüretim işçilerin bir yardımcı kast. Farklı işçiler, belirli fizyolojik adaptasyonlar farklı sib bakım davranışlarını sağlamak ve aynı zamanda aşırı ömrü farklılıklara bağlıdır. Bal arıları ve körfareler toplumsallık hızlandırılmış, ihmal veya ^1-3 yaşlanma ters kalıpları ile nasıl bağlantılı olduğunu incelemek için en gelişmiş hayvan modellerini temsil eder.

Bal arısı kolonilerinde, bir tek yumurtlayan kraliçe gıda için damızlık, yem eğilimindedir binlerce işçi tarafından destekli, ve, termoregülasyon veya hijyenik davranışları ⁴ koruma meşgul. Bu işçiler arasında, son derece kısa ömürlü yem, ara ile hemşire arılar, ve uzun ömürlü kış (diutinus) arı vardır. Bireyler, ancak, belirli bir kalıcı wo bağlı değildirrker-tipi, ancak esnek bir davranış ontogenezini görüntüler: Onlar ("temporal kastlara") bir sosyal görev davranışı değiştirmez. Toy arılar sonunda dışında toplayıcı değişebilir ki, yavru eğilimi hemşire arılar için değiştirebilirsiniz. Ancak, toy yuva arılar da uzun ömürlü kış arıları dönüşebilmektedir ve kısa ömürlü yem bile genellikle uzun ömürlü hemşire içine dönebilirsiniz. Aşırı (kış arılar) ve orta (hemşire arılar) ömrü ile İşçi bol kaynakları ile gıda üretim ve depolama organları iyi gelişmiştir - ^(1,5 gözden) kısa ömürlü aramayanlara aksine. Ancak, bireysel ömrü düzenleme bireyin kaynak dengesi basit değişiklikler ötesinde böyle jöle üretimi ^6, hormonal kontrol ^7, bağışıklık gibi olmayan çoğaltılması işçi kast çeşitli adapte işlevleri vardır, bir yumurta sarısı protein, üzerinde araştırma tarafından önerilmektedir ⁸ ve anti-oksidan savunma ^9.

F Desenlerkoku için kurulmuş, ve diğer beyin veya motor fonksiyonların ^10-13 gibi Fonk düşüş (ihtiyarlık) işçiler arasında ayna ömrü eşitsizlikler,. Uzun ömürlü kış arı ¹⁵ saptanabilir bir düşüş (ihmal edilebilir ihtiyarlama) eksikliği karşı Spesifik olarak, toplayıcı sadece iki hafta sonra öğrenme fonksiyonunda önemli bir düşüş, toplayıcılar ¹⁴ benzer bir ölüm ilerlemesini eşleşir.

Biz izleme ve yaşlanma-tip geçişler ^8,16,17 işlemek için izin kurulan deneysel paradigmalar uyarlanmış esnek yaşlanmanın moleküler parmak izlerini tespit etmek. Kronolojik yaş ve yaşlanma üzerinde işçi-tipi belirli sosyal davranışların etkileri ayrılabilir hangi örnekleri edinme 1. ayrıntıları deneme. Deney 2 yavaşladı yaşlanma dinamikleri ile hemşire arılar içine hızlandırılmış ile arayıcıların tersine anlatılmaktadır. Deney 3 Anatomica tarafından hücresel yaşlanma etkilerini incelenmesi için bir yaklaşım sağlarHücresel yaşlanma (lipofusin) ¹⁸ için kurulmuş bir biyolojik belirteç l ölçümü.

Protokol

1.. Kronolojik Çağı'na ihtiyarlama ayırımı

Bu bölüm aynı kronolojik yaş ("tek yaş kohort") ve yuva arıların bir grubu tespit paylaşan bireylerin bir kohort oluşan çift kohort kolonilerin, kurulumunu açıklar. Tek yaş grubu aynı yaştaki bireyler sonunda farklı yaşlanma dinamikleri farklı işçi tipe ayrı olacak - bu hızlandırılmış fonksiyonel düşüş yavaşladı ve toplayıcı arılar ile hemşire arılar vardır. Tüm prosedürler bir deney koloni için tarif edilmiştir. Biz böylece koloni etkileri (iki suret-tasarım) için kontrol edilebilir en az iki koloni için deneyler gerçekleştirmek için, ancak, çoğaltır öneriyoruz.

1. Çift kohort sömürgeler için kovanı kutuları hazırlanıyor: bal ile iki gıda tarak alır normal bir kovan kutu, polen başka gıda tarak ve iki boş tarak hazırlayın. 3.000 'den fazla olan bir evlendirdi kraliçe gibi bir donör koloni bulmak için emin olunyuva arılar. Her ikisi de daha sonra tanıtılacak (1.3).
2. Alınması ve benzeri kronolojik yaş ile bireylerin işaretleme: ortaya üzeredir mühürlü yavrularıyla tarak toplayın. Bir replikasını için 3.000-5.000 şapkalı kuluçka hücrelerinin toplam tarak toplamak için bekliyoruz. Her anne genotipleri (kovanı kökenli) çarpık dağılımları önlemek için en az üç farklı kovanı kaynaklardan damızlık dengeli miktarda kullanmak çoğaltmak için.
   1. % 60-70 bağıl nem ile 34 ° C'ye ayarlanmış bir kuluçka makinesi içinde kuluçka tarak yerleştirin. Gelişmekte olan damızlık kaçamaz böyle bir şekilde tarak saklamak için emin olun.
   2. Arılar iki gün boyunca ortaya edelim ve toraks (örneğin Uni Posca, Mitsubishi Pencil Co Ltd) üzerinde küçük bir boya etiketi ile bu arıları işaretlemek. Boya işareti tek yaş grubu (doğuşunun gün) arıları belirlenmesini sağlayacaktır, ve diğer çoğaltmak kolonilerden ayırt etmek.
3. I kohort içeren bir çift kohort koloni kurmadentified, tek yaş arılar: gününde genç arılar işaretlenmiş, (bkz. (. Tartışma bölüm 1 karşılaştırmak), ve daha önce hazırlanan kovan kutusuna bu işaretlenmemiş arılar eklemek verici bir koloni yaklaşık 2,500-3,000 yuva arıları toplamak ) 1.1 adıma. İkinci bireyler tanımlanamayan yuva arı kohort teşkil edecektir.
   1. Başlangıçta bir kraliçe kafes (piyasada mevcut) sınırlı olacak kraliçeyi ekleyin. Yenilebilir şeker (örneğin Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Almanya) işçi arıların kraliçe yavaşça serbest bırakmak yapmak ile kafesi kapatılmalıdır.
   2. Tek yaş kohort teşkil edecek yeni ortaya çıkan ve işaretli arılar ekleyin. Bu arılar sadece işaretli kişiler vardır, ve tüm aşağıdaki adımları için odak grup vardır.
4. Başlangıcı yem ve silaj işaretleme İzleme: başlangıcı ve tek yaş grubundaki hasta-hemşire forager geçiş dinamikleri değerlendirmek için, toplayıcı faaliyeti e demografik gelişimini izlemekHer koloninin çok gün. Koloniler (Şekil 1) kuruldu sonra beş gün saymaya başlayacaktır.
   1. Sabit zamanlarda 3 x 20 dk gözlem süreler içinde uçuşlar (giriş sayımları) kazarak dönen arıların toplam sayısını. (Tartışma) oryantasyon uçuş dönemlerinde arıları saymak değil emin olun.
   2. Giriş sayısı (> 100 giriş sayım / gün) başlaması için önemli bir yiyecek arama etkinliğini gösterir zaman, silaj işaretleme başlar. Bunu yapmak için, tek yaş grubunda (tek işaretli kişi) silaj ilk toplayıcı uçuşları dönen üzerine ikinci bir boya izi alırsınız. Bu boya işareti başlangıcını toplayıcı gününü belirler ve daha sonra her forager toplayıcı yaş tanımanızı sağlayacak.
   3. Arıların yeterli sayıda işaretlenmiş kadar günlük işaretlerini tekrarlayın. Bu arı tipik olarak 14 gün sonra, yaş edildikten sonra işaretli toplayıcılar yeterli sayıda tahmin etmek için, en fazla 5-10% arasında bir alma oranı beklemekforaging.
5. Örnekleme: Tüm başlangıçta işaretli arılar benzer bir kronolojik yaş olduğundan silaj ≥ 14 gün boyunca foraged ne zaman, hemşire ve eski arayıcıların yaştaki gruplar, aynı anda tahsil edilebilir.
   1. Tek belirgin hemşire arılar kovan içinde toplanır ve hemşirelik davranış (açık yavru hücrelere aşağı koymak başkanları ile besleme ve larva temizlik) ile tanımlanır.
   2. Günlük toplayıcı aktivite başlamadan önce Çift işaretlenmiş silaj da kovan içinde toplanır.
   3. Yeterli havalandırma sağlamak kafeslere (tüpler, kutular) arıların toplayın, ve daha fazla işlem kadar karanlık tutun. Alternatif olarak, Transkriptomik, epigenetik veya proteomik çalışmalar için, doğrudan sıvı nitrojen içinde dondurularak arılar oturtun. Tüm test gruplardan bireylerin dengeli numaralarını toplamak ve koloniler çoğaltmak.

2. Hive Demografi

Bu bölümde yavaşladı yaşlanma (hemşire arılar) ile işçilere hızlandırılmış yaşlanma (silaj) ile işçiler dönüş yapılır nasıl ayrıntıları. Silaj normalde yavru bakımı meşgul hemşire arıların eksikliği, karşılaştığınızda bu tür davranışsal ters, uyarılmaktadır. Hemşire arı fraksiyonu ile bir kovan ("hemşire-türetilmiş"), ve silaj fraksiyonu ile başka bir ("toplayıcı-türetilmiş"): reversiyon yordam tek bir koloni iki kurdeşen içine çoğaltmak ayrı olacaktır. Başarılı ters, plastik olası belirtileri ve ters yaşlanma döndürüldü işçiler, devam silaj, sürekli hemşire arılar ve yeni işe silaj ile tek yaş grubunda okudu olabilir sonra. Daha önce olduğu gibi, tek bir yaş grubunda, değil tanımlanamayan yuva arıların kohort arasında belirlenen arılar, deneysel odak grubu oluşturmaktadır.

1. Hazırlanışı: Bir önceki bölümde açıklandığı gibi hemşireler (tek işaretli) ve silaj (çift işaretli) ile kovanlarını Çoğaltılamıyor hazır. Dönme tamamlandıktan sonra yeterli alınmasını sağlamak için tekrarlanan koloni başına en az 500 belirgin silaj ile reversiyonunu başlamak değil emin olun.
   1. Dönüşü sonrası test grupları güvenli bir kimlik için orijinal kovanında tüm silaj nüfus reversiyon öncesinde kapalı işaretlendiğini önemlidir. Aşağıdaki prosedür, bir örnek için açıklanmaktadır.
   2. Reversiyon önce bir gün, silaj-türetilen kovanı için bir ek kovan kutusu (adım 1.1) hazırlamak. Donör kovandan iki kız ve iki kuluçka tarak bulun. Deneysel koloniler transferden önce bu taraklar Tüm yetişkin arıları uzak fırça. Bir kafesli kraliçe (adım 1.3) ve bir kuluçka tarak orijinal kovan kutusuna kraliçe ve kuluçka tarak yerini alacak. Kraliçe ve damızlık tarak diğer dizi yeni kovan kutusu için ertesi gün kullanılacaktır. Hem özgün ve yeni kovan emin olmak için tavsiye edilir yeni yavru taraklar ve yabancı kraliçelerin Benzer tahsisi ayrılmış yem ve hemşires eşit deneyimi kovan yardımlar ("kovanı koku") değişmiş olacaktır.
2. Reversion: Sabah, hemen reversion önce, toplayıcı-türetilmiş bir kısmını alacak yeni kutusuna kafesli kraliçe ve kuluçka tarak ekleyin. Zirve toplayıcı zaman başlayana kadar bekleyin. Sonra en az 100 m uzakta orijinal konumundan işaretlenmiş silaj ve hemşire arılar ile orijinal koloni taşıyın.
   1. Özgün konumda, damızlık ve sadece kraliçe ile toplayıcı-türetilmiş kovan için yeni bir kutu kurmak.
   2. Silaj disloke orijinal kovan kutusunu bırakın ve özgün konumlarına geri başkanlık edecek. Silaj yuva arılar toplayıcı nüfusun ayrılmasını tamamlamak için bir sonraki ulaşmak için 2 saat boyunca özgün konumuna geri dönmek için izin verir.
   3. Ardından, ayrılık sona orijinali kapatmak, şimdi kovanı "hemşire-türetilmiş", ve en az 3 km uzaklıkta bir arılık aktarmak.
3. Başarılı bir sosyal görev için kovan bakım ve izlemeters: Sağlıklı, açık damızlık düzenli deneysel kovanlarını kontrol edin.
   1. Koloni manipülasyonu sonrası ilk günlerinde potansiyel patojen yükünü azaltmak için gözetimsiz ve ölü yavru değiştirin.
   2. Dönme deney (Şekil 2) tamamlandığında taraklar değiştirilmesi veya zaman yine bu tanıtmadan önce yavru peteklerin fotoğraf çekmek, ve, toplayıcı-türetilmiş kovanı içinde başarılı tersine doğrulamak için. Önceden değişkenliklidir yavrularıyla ve açık, canlı damızlık Alanları toplayıcı-türetilmiş koloniler hemşirelik faaliyet güvenilir göstergeleridir.
4. Örnekleme: Sosyal ters eşlik fizyolojik etkileri 3-8 gün silaj ve hemşireler sonra tespit edilebilir ayrıldı.
   1. Biz ters başlatılan 8 gün sonra tüm test grupları, yani geri döndü işçi ve devam silaj (toplayıcı-türetilmiş kovan), hem de sürekli hemşire ve yeni işe silaj (hemşire-türetilmiş kovan) örnekleme öneriyoruz.
   2. ColAdım 1.5 'de tarif edildiği gibi lect örnekleri.

3. Lipofusin Nicelik ile İşçi-tipi özel Hücresel Yaşlılık Desenler analiz

Lipofusin Hücresel yaşlanma evrensel biyomarkerdir. Içsel bir birikim ürünü olarak, lipofusin spesifik otofloresan (emisyon _max = 530-650 nm) tespiti ¹⁸ için kullanılabilir.

1. Diseksiyon ve sabitleme: hareketsiz kadar buz üzerinde soğutun arılar, kaldırmak ve istenilen doku örneği teşrih.
   1. 4 ° C'de gece boyunca inkübasyon için, sabitleyici içerisine (pH 7.2 fosfat tamponlu tuzlu su, PBS içinde% 4 paraformaldehid) aktarın
   2. PBS içinde numuneleri 3 kez yıkayın.
2. Doku işleme ve montaj: titreşimli bir bıçak mikrotom örneğin Leica VT 1000'ler (Leica Biosystems, Nussloch, Almanya) kullanılarak, örneğin, en fazla 40 um 'den kalınlıkta bölümlere doku örnekleri kesin.
   1. Temizleme için,% 30 gliserol (PBS) içinde bir gece boyunca inkübe doku bölümleri ve% 50 gliserol (PBS) içinde bir 2 hr.
   2. % 50 gliserol (PBS) içinde mikroskopik slaytlar üzerine bölümlerini monte edin. Uzun süreli depolama mühür kapağı oje ile kayıyor.
3. Görüntü edinimi: Lipofusin algılamak için, λ = 514, 561nm veya uyarma için benzer lazer çizgiler sağlayan bir lazer tarama konfokal mikroskop kullanılarak önermek ve dedektör bant genişliği 570-650 nm'ye ayarlanmış.
   1. Lipofusin daha iyi tanımlanması için, ikinci bir kanal içerir ve kısa dalga boyu spektrumları bir eşzamanlı tarama yapmak (uyarım = 405 nm, emisyon = 410-450 nm). Uzun dalga boyu kanal nedeniyle autofluorescent trakea ve diğer non-taneli yapılara, granül Lipofusin hem de ortaya, ama aynı zamanda belirsiz "arka plan" olacak. Ikinci, daha kısa dalga boyu kanal sadece spesifik otoflüoresanı ortaya, ama değil lipofusin olacaktır. Bu durumda, kimlik lipofusin tesislerinin olabilir, sadece bir tanesi lipofusin özel floresan ile granüller ortaya ile, her iki kanal sinyalleri karşılaştırarak tated.
   2. Yüksek çözünürlüklü görüntülerin elde 40X büyütme veya daha yüksek, ve 1.25 veya daha yüksek, tercihen bir sayısal açıklığa sahip bir objektif kullanın. Tarama görüntü yaklaşık 100 x 100 x 10 mm boyutlarında ³ ile yığınlar. Her birey ve doku örneği, birden çok görüntü yığınlarının tarafından temsil edilmelidir.
   3. Teknik varyasyonu neden içi bireysel ve bireyler arası farklılıkları azaltmak için, her zaman lazer güç ve dedektör hassasiyeti sabit tutmak.
   4. Gün için günlük teknik varyasyonlar tarafından yanlılığı azaltmak için çeşitli tarama oturumları her tüm test grupları eşit örnek numaraları tarayın.
4. Görüntü işleme: mikroskobik görüntü yığınlarının gelişmiş işleme izin modülleri ile yazılım paketleri kullanın, örneğin ImageJ (Sağlık, Bethesda, Maryland, ABD ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri,gej.nih.gov / ij / "target =" _blank "> http://imagej.nih.gov/ij/).
   1. 3D görüntü yığınlarının her biri için en fazla 2 boyutlu çıkıntı oluşturur.
   2. Yüksek frekans gürültüyü azaltmak için, ve lipofusin granül boyutları ile yapıları korumak için bir miktar çekirdek büyüklüğüne sahip bir Gauss filtre uygulama.
   3. Lipofusin kimlik (adım 3.2) kolaylaştırmak için her iki renk kanallarını birleştirme.
5. Görüntü analizleri: sayısallaştırma adımları gerçekleştirmeden denek grubu kimliğini test kör olacak emin olun.
   1. Tüm görüntüler için, ilk olarak, ilgili yapıları kapsar ve diğer görüntüleri ROI'ler benzer boyutlara sahip çıkar (ROI) bir bölge seçin.
   2. Sonra her ROI temsil lipofusin granüllerinin istediğiniz numarayı seçin. Bir ROI içinde lipofusin granülleri seçerken, aşağıdaki kuralların uygulanması öznel önyargı azaltacaktır.
      1. İlk Granu seçmek için tutarlı bir konum seçinle. Bu durum, örneğin, bir ROI en sol kenar ve kenarına en yakın olan granül her zaman ilk seçim olacaktır olabilir.
      2. Birbiri ardına, granüller önceki seçime (sonraki komşu) en yakın olduğu seçilir.
      3. Sonraki komşusu seçerken, sadece bir önceki seçimden doğru arama, örneğin, sadece bir yöne doğru hareket ettirin. Bu kural seçim yoğun dolu granüller arada kümeleri hakimdir önler.
      4. Seçme işlemi tamamlandığında, söz konusu granül alan ana hatlarını ve ölçülerek, her lipofusin parçacık boyutunu değerlendirmek. Farklı test grupları bireyleri karşılaştırmak uygun istatistiksel testler kullanın.

Sonuçlar

Protokol bölüm 1 ve deney grupları hızlandırılmış niteliklerini incelemek için elde edilebilir nasıl 2 ayrıntı, yavaşladı ve tek bir yaş grubu ile koloniler yaşlanma tersine. (Şekil 1, bölüm 1 karşılaştırma) 6 koloni için silaj sayıları ("giriş sayar") değerlendirilir, normal ontogenezini eşlik işçi-tipi farklılaşmasını izlemek için. Grafikler bireylerin daha 10 gün eski önce silaj devlete hemşire gelen önemli değişiklik, tipik olarak gözlenen olmadı...

Tartışmalar

Biz burada daha önce açıklanan ^{8,16,17,19,20} yaklaşımları benimsemek, bal arıları ve esnek yaşlanmayı okuyan kolaylaştıracak tek bir iş akışına entegre. Amacımız, ilgili örnek materyal elde etmek için ayarlanmış bir standart araç ile bu alana acemi bilim adamları sağlamak ve farklı araştırma ekipleri arasında deneysel tekrarlanabilirlik geliştirmektir. Bizim prosedürleri basitleştirilmiş ve (örneğin ⁸ karşılaştırmak) önceki açıklamalarında olduğu gibi öz...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apifonda	Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Glycerol	Merck	1.04094.1000