Desenli ve Yaratılış 3D Hücre Kültürü için iki bileşenli Hidrojeller için Thermoresponsive Ters Kalıpları Baskı

Özet

Bir bioprinter bir kurban kalıp dayalı desenli hidrojeller oluşturmak için kullanıldı. Poloksamer kalıp ikinci bir hidrojel ile dolduruldu ve daha sonra üçüncü bir hidrojel ile doldurulmuş boşluklar bırakarak elüt edilmiştir. Bu yöntem Biyopolimerlerin karmaşık mimarileri oluşturmak için hızlı sağım ve poloksamerin iyi baskı kullanır.

Özet

Bioprinting hızlı prototipleme sektöründe kökeni olan bir gelişmekte olan bir teknolojidir. Farklı baskı süreçleri temas bioprinting ^1-4 (ekstrüzyon, daldırma kalem ve yumuşak litografi), temassız bioprinting ^5-7 (lazer ileri transferi, mürekkep püskürtmeli birikimi) ve bu iki foton fotopolimerizasyon ⁸ olarak lazer tabanlı teknikler ayrılabilir. Bu tür farklı hücre tipleri ¹⁷ ko-kültür etkileri gibi temel biyolojik sorulara cevap vermek için bu gibi doku mühendisliği ^9-13, biyosensör mikroüretim ^14-16 gibi bir araç olarak bir çok uygulama için kullanılabilir. Ortak fotolitografik veya yumuşak-taş baskı yöntemlerinin aksine, ekstrüzyon bioprinting ayrı bir maske ya da damga gerektirmeyen bir avantaja sahiptir. CAD yazılımı kullanarak, yapının tasarımı hızla operatörün gereklerine göre değiştirilebilir ve ayarlanabilir. Bu litografi tabanlı daha esnek bioprinting yaparyaklaşımlar.

Burada örnek olarak bir hidrojel içinde ayağı bir dizi kullanarak bir çok malzeme 3D yapısı oluşturmak için bir kurban kalıp baskı göstermektedir. Bu yapı taşları bir sinir kılavuz kanalı içinde bir damar ağı veya tüpler için içi boş yapılarının temsil edebilir. Geçici kalıp için seçilen malzeme poloksamer 407, 4 sıvıdır mükemmel baskı özelliklerine sahip bir polimer thermoresponsive ° C idi ve jelleştirme sıcaklığının üzerinde bir katı madde ~ 20 ° C'de% 24,5 ağırlık / hacim çözümler ^18. Bu özellik, poloksamer dayalı geçici kalıp talep üzerine akıtılan olmasını sağlar ve özellikle dar geometrileri için, bir katı maddenin yavaş çözünme üzerinde avantajlara sahiptir. Poloxamer kurban kalıp oluşturmak için mikroskop cam slaytlar basılmıştır. Agaroz kalıp içine pipetlenir ve jelleştirme kadar soğutuldu. Buz gibi soğuk suda poloksamer elüsyon sonra, agaroz kalıp boşlukları aljinat metakrilat sp ile doldurulmuşturFITC etiketli fibrinojen ile iked. Dolu boşluklar daha sonra UV ile çapraz bağlantılı olduğu ve yapı bir epi-floresan mikroskop ile görüntülendi.

Giriş

Doku mühendisliği yaklaşımları insan doku ve organları ^19,20 rejenerasyonu ile ilgili olarak son yıllarda çok ilerleme kaydettik. Bununla birlikte, şimdiye kadar, doku mühendisliği odak çoğu zaman basit bir yapı ya da mesane ^21,22 ya da deri ^23-25 ​​kadar küçük boyutlara sahip doku ile sınırlı kalmıştır. Insan vücudu, ancak, hücreler ve hücre dışı matris bir uzamsal tanımlanmış bir şekilde düzenlenmiş çok sayıda karmaşık üç boyutlu bir doku içerir. Bu dokuların üretimi için, bir teknik belirtilen pozisyonlarda üç boyutlu bir yapı içinde hücre ve hücre dışı matriks iskele yerleştirebilirsiniz gereklidir. Bioprinting üretim karmaşık üç boyutlu dokuların vizyonu ^10,11,26-28 gerçekleştirilebilir böyle bir tekniği olma potansiyeline sahiptir.

Bioprinting desenlendirme için malzeme transferi süreçlerinin kullanımı "olarak tanımlanan ve biyolojik rel montaj olduğunuteknisyenleri tarafından, geçerli malzemeler - moleküller, hücre, doku ve biyolojik biyomalzemeler -. bir veya daha fazla biyolojik fonksiyonları ^"4 gerçekleştirmek için bir reçete kuruluşla Birkaç farklı teknikler kapsar iki alt mikron çözünürlüklü kadar farklı çözünürlüklerde ve uzunluk ölçüleri, az çalışan ekstrüzyon baskı ^1,12,30 için 420 mikron 150 mikron bir çözünürlük foton polimerizasyon ^29. Tek bir malzeme veya malzeme kombinasyonu her yöntemin ³¹ gereksinimlerini tatmin edecek. ekstrüzyon baskı için, anahtar parametreleri viskozite ve jelleşme zaman vardır Yüksek viskozite ve hızlı jelleşme arzu ^32,.

3D baskı karmaşık geometrileri ^30,33,34 oluşturmak için kurban kalıp kolay oluşturulmasını sağlayan bir tekniktir. Bu işlem, bir ekstrüzyon bioprinter gibi bir hızlı prototip tekniği kullanılarak bir kalıbın yapımında dayanmaktadır. Oluşturulan kurban kalıp kullanılırOnların düşük viskoziteli ve yavaş jelleşme süresi nedeniyle yazdırmak için zor malzemelerden kompleks yapılar oluşturmak için. Burada sunulan yöntem, düşük bir sıcaklıkta hızlı bir şekilde çözünür ve doğru bir şekilde ekstrüde edilebilir bir malzemeden oluşan bir geçici kalıp oluşturulmasını içerir. Blok kopolimer, poli (etilen glikol) _99-poli (propilen glikol), _67-poli (etilen glikol) ₉₉ (aynı zamanda Pluronic ® F 127 veya poloksamer 407 olarak da bilinir), bu gereksinimleri yerine getirmektedir. Zaten bildiğimiz kadarıyla, sıvı ortamlarda kendi istikrarsızlık nedeniyle değiştirilmemiş sürümünde yazdırmak için hiç kullanılmamış, ekstrüzyon baskı ¹ değiştirilmiş bir versiyonu kullanılmıştır ama olmuştur. Poloksamer 407, aynı zamanda, ters termal duyarlı davranış, ^18, ​​yani soğutma üzerine bir sol bir jelden bu değişiklikleri gösterir. En önemlisi, çok yüksek sadakat karmaşık keyfi kavisli yapılarına yazdırılabilir. Bu sayede, bir yapısal bir hidrojel oluşturmaDüşük viskoziteli bir madde, bu durumda yavaş jelleşen agaroz, basılı geçici kalıp içine çözeltisi pipetleme. Yüksek sadakat ve döküm yapılandırılmış hidrojel gelen onun hızlı elüsyon bir maske ya da sık sık taşbaskı yöntemleri gerekli olduğu gibi bir damga kullanmadan farklı geometri ile kalıp oluşturmak için hızlı ve esnek bir yöntem yapar ile kurban kalıp baskı kombinasyonu. Dökülmüş yapısal hidrojel daha da düşük viskozite nedeniyle ekstrüzyon baskı için uygun değildir başka bir malzeme ile doldurulabilir. Bu bizim durumumuzda bir düşük viskoziteli aljinat metakrilat çözümdür. Burada bir ayağı dizinin örneğinde hidrojel desenlendirme için thermoresponsive ters kurban kalıp yöntem mevcut.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Poloxamer 407 karışımların hazırlanması

Mevcut ise, soğuk bir odada (4 ° C) 'de poloksamer çözeltinin hazırlanması gerçekleştirin. Mevcut değilse, buz gibi soğuk su ile dolu bir beher cam bir şişe yerleştirin. Daha yüksek sıcaklıklarda poloksamer, jelleşme noktasının üzerinde olacak ve düzgün bir şekilde çözülür olmayacaktır.

1. Bir cam şişe içine buz gibi soğuk PBS çözeltisinden 60 ml ilave edilir ve manyetik bir karıştırıcı kullanılarak kuvvetli bir şekilde karıştırılır.
2. Poloksamer 24.5 gram ağırlığında ve soğuk PBS için küçük miktarlarda ekleyin. Poloksamer kısmen daha eklemeden önce çözünmüş kadar bekleyin.
3. Tüm Poloksamer çözünmüş kadar çözüm karıştırın.
4. 100 ml 'lik bir son hacim elde edilene kadar soğuk PBS ile ekleyin. Nihai konsantrasyon% 24.5 w / v olacak
5. Çözüm karıştırma durdurun ve ° C çözümünde kabarcıklar ve köpük kadar yok oldu 4 de bekletin. Jel içinde sıkışıp kalırlar Bubbles p aktarılırrinter kartuş ve basılı kurban kalıplara kusurları yol açacaktır.
6. Filtre (0.22 mikron filtre) İğne yapışmasına neden olabilir istenmeyen parçacıkları çıkarmak için doğrudan baskı kartuşunun içine çözüm. Filtreleme adımı filtrede poloksamer jelleşme önlemek (ya da değilse, soğutulmuş uçlarına, filtre vs ile temin edilebilir) soğuk bir odaya yapılmalıdır. ° C kadar 30 dakika deney önce 4 de yüklü kartuşu dışarıda tutun.

2. 3D Printer hazırlanması

Bu çalışmada kullanılan 3D yazıcı regenHU gelen "biyo" oldu. Sistemin çekme kısmı birkaç bölümden oluşmaktadır. En iyi bir basınç altında, kartuşun Luer-kilit adaptörü üzerinden bir konektöre bağlanmıştır. Bağlayıcı, kartuşun çıkış ve bir solenoid valf girişi arasındaki boşluk köprü oluşturur. Solenoid valfinin çıkışında, farklı çaplarda iğneler de kullanılabilir. Malzeme bir alt üzerine haddelenmektedirvakum bir hareket aşamasına düzenlenen olduğunu tedir. Sistemin büyük parçaları Şekil 1 'de tasvir edilmiştir. Diğer ekstrüzyon tabanlı sistemler baskı işlemi için kullanılan ve optimizasyon süreci her sistem için yapılması gereken edilebilir.

1. Ultra saf su ile doldurulmuş ayrı bir 1.5 ml'lik test tüpü içine selenoid valf (meme çapı 0,3 mm) ve iğne (iç çap 0.15 mm) yerleştirin ve 30 dakika için temizlemek için ısıtılmış bir ultrasonik banyosuna koyun. Etanol ile temizlenmiş vanalar durulayın ve bir azot silahla kurulayın.
2. Vana ve iğne yazıcı hem de boş, temiz kartuşu takın.
3. Sisteme 3 bar basınç uygulayın ve basınçlı hava ile yüklü vana ve iğne herhangi bir kalıntı sıvı dışarı darbe. Küçük bir iğne çapları için, iğne tıkayabilecek küçük partiküllerin girişini önlemek için basınçlı hava çıkış filtresi monte edilmiş bir (ortak bir şırınga filtresi, 0.45 mikron gözenek boyutu) olması tavsiye edilir.
4. Poloksamer yüklü kartuş basınç kapatın ve yükleyin. Poloksamer, oda sıcaklığında ve jel ulaşmak, böylece kartuş, kartuş montaj önce soğutma yaklaşık olarak 30 dakika üzerinden alınmalıdır.
5. Sisteme 3 bar basınç uygulayın ve iğne ucu ulaşır ve sürekli bir iplikçik haddelenmiş kadar Poloksamer dağıtmak.

3. Baskı Parametreleri optimizasyonu

Doğru 3D yapılar oluşturmak için, yazdırma işlemi seçilen malzeme ve konsantrasyon için optimize edilmiş olması gerekir. Viskozite ve 3D baskı sistemine bağlı olarak her bir malzeme parametreleri sabit bir dizi için özel bir dağıtım hacmi ve çizgi kalınlığı verecektir.

1. Uygun bir CAD yazılımı (çizimler ISO dosyaları oluşturmak mümkün) ile, yazdırmak düşündüğünüz yapı olarak aynı uzunlukta hakkında tek bir çizgi çizin.
2. Bir mikroskop cam slayt 25 mm x 75 mm x 1 yerleştirinmm veya yazıcı başka bir yüzey ve vakum açarak sabitleyin.
3. Yazıcı yazılımında, 50 Hz yüksek frekans için selenoid valf ayarlayın ve 3 bar yüksek basınç ayarlayın.
4. 300 mm / dak bir sahne hızı ile tek bir satır bir kat yazdırın.
5. İstenen çizgi genişliği ulaşana kadar baskıyı azaltmak. Ayrıca vananın açma süresi ile çekilmiş olan ses kontrol edebilirsiniz.
6. Hiçbir sürekli hat artık basılabilir kadar valf sıklığını azaltmak. Bu değerin üzerinde bir frekans seçin.

Not: İstediğiniz çizgi genişliği ve sürekli çizgiler elde edildikten sonra, bir basılı katman sonra en uygun sahne hızı ve iğne kaldırma yani tabaka kalınlığı belirler.

7. Her üst üste birkaç kat yazdırın ve iğne çeşitli basılı katmanları sonra önceki katman üzerinde doğru pozisyonda olup olmadığını görmek. Tabaka kalınlığı (iğne asansör ayarlayın) Her bir katman bir sonraki (Şekil 3) üzerine basılı olduğu.
8. 300 mm / haddelenmiş katmanları öncekilerin (Şekil 4) ile aynı pozisyonlarda başlangıç ​​ve bitiş böylece dk adım adım gelen sahne sahne hızını azaltmak. Çok yüksek sahne hızları ekstrüde malzeme Önceki katmana dokundu önce sahne hareket neden olur.
9. Yazdırmak için ayağı yapılar. Adımları 3.1.-3.8 takip, ancak bunun yerine tek bir çizgi çizerek tek bir noktadan çizin. Sütunlar yazdırırken odaklanmak parametreler ayağı yatırılması gereken konumda baskı kafasının basıncı (tabaka kalınlığı ve poloksamerin ayağı çapı düzenleyen), vananın açılması zaman (haddelenmiş hacim) ve ikamet zaman vardır .
10. Parametreleri optimize zaman, bir çizgi birkaç kat baskı sağlam bir duvar, ya da noktaları, bir ayağı durumunda sonuçlanmalıdır. Daha sonra kullanmak için parametreleri kaydedin.

4. Ters Kalıp baskı ve Elüsyon

Bu noktadan itibaren optimizasyon işlemi sırasında bulunan parametreleri kullanın.

1. Bir cam mikroskop lamı üzerine iç yapısı (burada bir ayağı dizidir) yazdırın ve gece kurumaya bırakın. Bu a) yapı büyüklüğü ve kalınlığını azaltır ve b) önlenebilir havalanma dolgu sırasında, bu nedenle yapı ve substrat arasında daha iyi bir yapışma sağlar.
2. CAD yazılımı ile, uzak yıkandı ve doldurduktan niyetinde yapıyı çevreleyen bir dış duvar oluşan bir yapı çizin. Poloksamer ile yapı yazdırın. Duvarın baskı 6 dakika sürer.

Dikkat: duvar iğne nedeniyle boyutlarının iç yapısının en az 3,5 mm uzaklıkta basılacak sahiptir. Aksi takdirde, dış duvarın baskı iç yapısının bozulmasına neden olur

3. Eğer Sacr doldurulacak istediğiniz çözümü hazırlayınificial ile kalıp (deiyonize su içinde, burada bir% 1 agaroz). Agaroz solüsyon, 35 ° C ile 45 ° C arasındaki bir sıcaklıkta olmalıdır Bu sıcaklık altında, agaroz çok hızlı pekiştireceğiz, poloksamer yapısını yumuşatır çünkü bu sıcaklığı üzerinde, bu basılı ayağı yok olabilir.
4. Yavaş yavaş bir pipet kullanarak dolgu çözüm kurban kalıp doldurun. Bu, duvar iç yapısının yok olmasını önlemek için yavaş yavaş yapılmalıdır.
5. Backfilled çözüm jel izin veya kullanılan polimer bağlı olarak çapraz bağ. Agaroz durumunda katılaşma 10 dakika boyunca 4 ° C'de gerçekleştirildi.
6. Poloksamer yapısı elüt için 10 dakika için bir buz banyosu içinde, doldurulmuş geçici kalıbın koyun.
7. Bir kağıt doku ile yeniden toprakla yapısı leke ve yeni bir cam mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Arasındaki boşluğa boşluğu gelen üçüncü hidrojel sızmasını önlemek için cam mikroskop lamı üzerine dikkatlice yapısı basınbackfilled yapısı ve cam mikroskop lamı.

5. Boşluklar doldurulması

1. Yıkanan poloksamer kalan boşlukları doldurmak için, bir 30 G iğne ile donatılmış bir şırınga içine amaçlanan polimer çözeltisi doldurun. Bu örnekte,% 0,05 'lik ilavesi ile 0.15 M NaCl çözeltisi içinde bir% 1 aljinat metakrilat kullanılan ağ / hac lityum fenil-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) ve% 2.5 v / v Alexa-488 konjuge fibrinojen . Alexa-488 konjuge fibrinojen görselleştirme amacıyla eklenmiştir.
2. 5 dakika ve görüntü için yüksek yoğunluklu UV lamba (100 Watt, 365 nm, yüzey mesafesinde 3,5 cm idi) ile polimer Photopolymerize bir epi-floresan veya konfokal mikroskop kullanılarak inşa.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Örnek sonuçlar ters kalıp tekniği (Şekil 2'de gösterildiği gibi) olan bir ikinci malzeme ile doldurulabilir yapılandırılmış bir jel oluşturacaktır olduğunu göstermektedir. Her baskı sürecinin başında baskı parametreleri ilk optimize edilmiştir. Parametreler adım adım ayarlamalar Şekil 3 ve tek bir hat basılır Şekil 4 'de gösterilen baskılı katmanlı yapıları ile sonuçlanacaktır. Tabaka kalınlığı (bir basılı katman sonra i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada, ilk kez, mevcut, hızlı bir şekilde bağlı olarak ~ 20 ° C arasında poloksamer edilen jel-sol geçiş için soğuk suyla yıkandı, olabilir, bir geçici kalıp için bir thermoresponsive polimerin kullanılması Sürecin hızı yeterli çözünürlüğe sahip basılamaz biopolimer yapıların hızlı oluşturma için Poloksamer ilginç hale getirir. Burada anlatılan teknik, bir hidrojel içinde ya da daha önce bir başka malzeme ³⁵ için rapor edildiği gibi mikroakışkan kanallarının oluş...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127)	Sigma	P2443
PBS	Invitrogen	10010-015
CAD software	regenHU	BioCAD
Alginate methacrylate	Innovent e.V Technologieentwicklung Jena		Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Invitrogen	F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Innovent e.V Technologieentwicklung Jena		Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose	Lonza	50004
EQUIPMENT
Bioprinter	regenHU	Biofactory
Valve	regenHU	300 μm Nozzel Diameter
Needle	regenHU	150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome	Zeiss
UV Light Source	UVP	Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp	100 W