Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Özet

Biz neonatal serebral korteks ve yetişkin omurilik canlı mikroglia verimli ve hızlı izolasyon / kültür yöntemleri özetlemektedir. Kortikal mikrogliya diseksiyonu ve kaplama ilk diseksiyonu sonrasında yer ~ 10 gün alarak sonraki mikrogliyal hasat ile, 90 dakika içinde yapılabilir.

Özet

Mikroglia gibi, bu MSS gelişiminde olgunlaşma, multipl skleroz ve spinal kord yaralanması gibi fizyolojik ve patolojik süreçlerde kritik önemli rolleri olan, merkezi sinir sistemi (MSS) yerleşik makrofaj benzeri hücreler ve. Mikroglia aktif ve MS veya inme kaynaklanan iskemik beyin travması görüldüğü aksonal hasar nöronal yaralanma veya stimülasyon, harekete için işe edilebilir. MSS Bu bağışıklık üyeleri de patolojik olmayan koşullarda sinaptik plastisite rol olduğu düşünülmektedir. Biz diğer merkezi sinir sistemi hücre tipleri ve hücre kültürü enkaz varlığı olarak karıştırıcı değişkenler, en aza indirirken canlı hücre sayıları en üst düzeye çıkarmak amaçlanmıştır yenidoğan ve yetişkin dokulardan kültür mikrogliya için protokolleri kullanır. Biz tüm süreci uygulanabilir ve tekrarlanabilir hale getirir büyük ve kolayca ayırt MSS bileşenleri (örneğin korteks, spinal kord segmentleri), kullanmaktadır. Yetişkin hücrenin kullanımınıbirçok patolojiler özellikle doğum sonrası omurilik etkiler okudu olarak s, neonatal beyin mikroglia kullanımına uygun bir alternatiftir. Bu kültür sistemleri de doğrudan ya da inhibe etmek veya mikrogliyal aktivasyonun teşvik edebilir bileşiklerin etkisini test etmek için yararlıdır. Mikrogliyal aktivasyonun, yetişkin merkezi sinir sisteminde hastalıkların sonuçları şekil bu yana, neonatal ve yetişkin mikroglia kültürlenir ve incelenmiştir edilebileceği in vitro sistemler için bir ihtiyaç vardır.

Giriş

Mikroglia en yakın yapı ve fonksiyon ¹ periferik makrofaj benzeri MSS, yerleşik bağışıklık hücreleri bulunmaktadır. Son zamanlarda doğum sonrası mikroglial hücreleri ilkel myeloid öncü hücrelerden elde ve doğum sonrası hematopoetik ataları yetişkin beyin ² mikroglia kaynağı olduğu önceki kavramı upending, embriyogenez sekizinci gün önce oluşturulan olduğu gösterilmiştir. Onlar çeşitli nörolojik hastalıklarda önemli rol oynayan ve hızlı bir şekilde pro-inflamatuar ve anti-inflamatuar sitokinler ³ bırakarak enfeksiyon veya yaralanma yanıt verebilir. Böylece mikroglia hastalığın ilerlemesini etkileyecek manipüle edilebilir MSS bağımsız bir birim kapsayacak. Izole etmek için sağlam ve üretken kültür ve yenidoğan veya yetişkin mikroglial hücreleri geliştirme ileri çalışmalar için önemlidir.

Mikroglia beyin patolojilerinin bir dizi kritik oyuncu olduğu bilinmektedir. Daha yakın zamanda, roles hipokampus ^{1, 4} dentat girus gelen mikroglia fagosite aşırı nöral progenitör hücrelerin normal beyin gelişimi ve işlevi hücreleri için ortaya çıkmaktadır. Mikroglia da MS gibi omurilik etkileyen çeşitli nörolojik koşulları, nöropatik ağrı, ve spinal kord yaralanması ^5-7 modüle olabilir. Omurilik mikroglia yerel ortamda farklılıklar nedeniyle muhtemelen aktivasyon sinyalleri ^{8, 9,} yanıt olarak beyin mikrogliya göre farklı şekilde etkiler. Bu nedenle in vitro kültür sisteminde uygun bir tesis ve omurilik mikroglia incelemek için önemlidir. Yenidoğan mikroglia, IFN-γ, TNF-a ya da ^10,11 bazı hastalıkların bağlamında mikroglia incelemek için yetişkin hücrelerin kullanımı ihtiyacını daha vurgulayarak. Ile in vitro stimülasyondan sonra yetişkin hücrelere kıyasla, pro-inflamatuar sitokin, nitrik oksit önemli ölçüde daha fazla üretmek

Biz cu laboratuarda istihdam protokolüLTURE yenidoğan mikroglia hücre kültürü şişesi ¹² yüzeyinden mikrogliya kaldırmak için bir çaba karışık glial kültürlerin sallayarak kullanmak en yeni tekniklerin bir çeşididir. Ayrıca, ilk Yip ve ark ¹³ ile tarif edilen bir protokole göre yetişkin fare omurilik kültürüne mikroglia için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, mevcut diğer protokolleri ¹⁴ ile karşılaştırıldığında kültür yetişkin hücrelere daha hızlı bir yol sağlar. Sonuçta elde edilen müstahzarlarda% 70 mikroglia olan, geri kalan yüzde astrositler oluşmaktadır. Bizim kültür saflığının başka yayınlanmış yöntemler ¹³ kıyasla daha düşük olmasına rağmen, bu kültür sisteminde özellikle omuriliği ve hastalıkların çalışması için çeşitli aktive edici uyaran hem de kültür yanıt olarak mikroglial keşfetmek için yararlı olan güçlü bir hangi inflamatuvar yanıt bir ana özelliğidir.

Açıklanan tüm protokoller Stony Brook üniversite tarafından onaylanmıştırty IACUC.

Protokol

1. Diseksiyon (Gün 0)

1. Hipotermi ile p0-2 fare yavrular için anestezi neden. Doku dezenfekte% 70 etanol batırılmış bir Kimwipe ile yavrular başkanları silin.
2. 10 cm kültür plaka başına 4 yavrular kullanarak, bir makas ile kafaları çıkarın. Buz Hank tampon içeren bir petri başkanları yerleştirin.
3. Göz çukurları ile kavisli bir forseps kullanarak kafaları demir ve dikkatli bir şekilde düz microforceps ile kafatası kaplayan deri kaldırmak.
4. Değil delinme veya hasar korteks için dikkatli kullanarak, düz microforceps ile kafatası kemikleri çıkarın. En etkili bir şekilde bu bölgede atılır olarak, başın tabanında yer alır beyincik, yanından başlayıp kaldırma başlamak etmektir.
5. Küçük bir spatula ile beyin çıkarın ve buz Hank tampon içeren yeni bir petri (4) beyin yerleştirin.
6. Bu noktadan itibaren tüm adımları microforceps kullanmak ve bir disse altında gerçekleştirilirction mikroskop. Beynin ventral tarafında başlayarak, beyincik tutarak doku demir ve orta beyin her iki tarafında iki küçük kesiler yapmak. Korteks bu bölgede orta beyin kapak olarak, doku üzerinden tüm yol kesmek için dikkat edin.
7. Yavaşça iki korteks gelen tek parça halinde orta beyin ve beyincik kızdırmak. İki korteks içbükey bir şekil oluşturmalıdır.
8. Daha fazla diseksiyon için medial yüzü iki korteks ve yönlendirmek tek korteks ayırın. Hipokampus gözlemlemek için zor olabilir, ama korteksin sivri ucunda küçük bir nodül olarak görünen koku ampul karşısında yer almaktadır.
9. Bir hilal şekli vardır hipokampus, çıkarın. Sırt tarafında görmek için korteks ters çevirin.
10. Bir başlangıç ​​noktası olarak koku ampul kullanarak, tüm zarları ve korteksten koku ampul kendisini kaldırmak.
11. Parçalara korteks col 14 ml 'si ile 15 ml konik tüp içine yerleştirilmelidirbuz üzerinde d Hank tamponlu tuzlu.

2. Hücre Kültürü (gün 0)

1. 37 ° C'de 3 saat boyunca otoklava su içinde seyreltildi poli-D-lizin (PDL) 5 ug / ml 'si ile ön kat 10 cm doku kültür tabaklarında
2. Otoklava su ile bir kez PDL ve yıkama plakaları aspire. 20 dakika boyunca doku kültürü kaputu UV altında kuru plakası. Bu adım, diseksiyon işlemi hemen önce yapılmalıdır.
3. 4 Brain her birinden korteks içeren tüpler aspire Hank tampon 1x tripsin / EDTA çözeltisi, 4 ml uygulamak ° C inkübatör 15 dakika boyunca 37 P1000 ucu ve yerine borular ile doku çiğnemek.
4. Enzimatik sindirim, mix, durdurmak ve 5 dakika boyunca 1.5K rpm içeriğini aşağı dönmeye tüp başına tam mikrogliyal medya 4 ml ekleyin.
5. Süpernatant aspire ve eksiksiz bir medya 4 ml yıkama tekrarlayın. 40 mikro 10 ile tam bir ortam mikroglial ml (% 10 FBS DMEM,% 1 sodyum piruvat,% 0.08 gentamisin), ve filtre hücrelerin tekrarn örgü hücre süzgecinden.
6. 37, bir doku kültürü inkübatöründe 10 cm doku kültürü plakası ve yerine 10 ml başına 8 korteks yoğunluğunda Plaka ° C ve% 5 _CO2 (Yetişkin Mikroglia protokolü bakınız).

(Gün 3)

1. Tam mikrogliyal medya ile tüm hücre kültürü yemekleri ortamı değiştirin.

(Gün 10)

1. 60 mM 400 mikrolitre 10 cm doku kültürü plakaları, orta ve 10-15 dakika için oda sıcaklığında (RT) inkübe HBSS (mikroglia ayırmak için), lidokain ekleyin.
2. Plakadan medya / hücre süspansiyonu toplayın ve Hank tamponu ile bir kez plaka yıkayın. Kalan mikroglia kurtarmak için yıkama tamponu toplayın.
3. 50 uM veya bir 1/100 dilüsyon nihai bir konsantrasyona hücre süspansiyonu 5 mM EDTA (pH 8.0) ilave edilir.
4. 5 dakika boyunca 1000 xg (1500 rpm) hücre süspansiyonu aşağı Spin ve% 1 FBS ile 1 ml DMEM yeniden askıya.
5. (Canlı hücre sayısını Yetişkin Mi görecroglia 3.1/3.2) ve istenen deney yoğunluğunda doku kültürü plakaları halinde bölünmüş hücreleri. Yaklaşık 1x10 ⁶ mikrogliya 4 beyninden korteks içeren 10 cm plaka hasat edilir. Immünofloresans için, 18 mm lamel başına 2.5x10 ⁴ hücre yoğunluğunda tavsiye edilir.
6. Mikroglial hücreleri için en az 24 saat tam kullanmadan önce kendi dallanmış, dinlenme durumuna geri dönmek için izin verin.

Protokol Yazı: (Yetişkin Mikroglia)

1. Doku Toplama

1. 37 °, 3 saat boyunca poli-D-lizin (PDL) ile kaplayın doku kültürü plakaları ° C ya da gece boyunca 4 ° C'de Otoklava bir kez su ile kullanılmadan hemen önce plakalar, yıkama.
2. CO ₂ boğulma ve ötenazi eksiksiz olduğunu tespit tarafından fare Euthanize. % 70 etanol ile omurilik alanı temizleyin.
3. Bir makas kullanarak omurilik üstüne deri kesilir, sonra bölge T1 T12 için omurilik kesip geçin. Kesmekomurilik tarafın kalan kas kapalı.
4. Yavaş yavaş hafifçe parmak uçlarınızla omurilik tutmak olarak microscissors kullanarak vertebra kesti. Doku çok yumuşak olduğu gibi delinme omurilik için dikkatli olun. Yavaş yavaş microforceps kullanarak omurilik ayıklayın.
5. Buz HBSS içeren bir petri Batmak omurilik. Bir ışık mikroskobu kullanarak microforceps kullanan tüm görünür zarları çıkarın
6. Çeşitli parçaları üretmek için küçük çapraz bölümler halinde omurilik kesin. Parçaları kalınlığı etkin sindirim kolaylaştırmak için 2 mm'den fazla olmamalıdır. 1 ml buz gibi soğuk HBSS içeren 15 ml konik bir tüp omurilik parçaları aktarın. Sindirim adım kadar buz üzerinde tüp tutun.

2. Doku sindirimi

1. Omurilik dokusu içeren 15 ml konik tüp HBSS aspire. Doku herhangi bir parça aspire için dikkatli olun.
2. Tripsin (2 1 ml ilave edilir.5 g / L, ışınlanmış domuz tripsin ve HBSS içinde 0.2 g / L EDTA) ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
3. Sindirim tripsin çıkarın ve enzimatik sindirim durdurmak için serum içeren birincil mikroglia orta 3 ml ekleyin durdurmak için.
4. Pipet yukarı ve aşağı doku çıkarmak için. 40 mikron hücre süzgecinden kullanılarak hücre süspansiyonu filtre.

3. Hücre Sayım ve Kaplama

1. Hücre süspansiyonu ve DAPI çözeltisinin eşit bir hacmi karıştırın.
2. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
3. 5-7x10 ⁵ hücre / PDL kaplı 35 x 10 mm yemekleri ml arasında bir yoğunlukta plaka. Hücreler 35 x 10 mm tabaklar ile karşılaştırıldığında daha küçük bir alana sahip 12 oyuklu plakalar içinde kültürlendi bile daha düşük bir yoğunlukta Kaplama hücre büyümesini engellemiştir.

Sonuçlar

Dinlenme ve aktive mikroglial hücreleri bir örneği Şekil 1'de gösterilmiştir. Mikroglia kaplama sonra 24 saat görüntülendi (Şekil 1a) ve dallanmış (dinlenme) morfoloji gösterirler edildi. Astar reaktif maruz kalmak, hücreler olarak mikrogliyal morfolojisi değişiklikler bakteriyel lipopolisakkarid (LPS) sonuçları (Şekil 1b) aktif olur.

Kaplama için hücre sayımı bir örnek Şekil 2'de göst...

Tartışmalar

Mikroglia MSS normal işleyişi yanı sıra çeşitli patolojiler için inflamatuar yanıtları modüle. Mikroglia tarafından fonksiyonel sinaptik yeniden normal beyin dengesinin ¹⁵ bakım sorumlu tutulmuştur. Nörojenik kaskad sırasında, hipokampus ^{4, 16} dentat girus gelen nöral progenitör hücrelerin boşluk katılmak. Bu nedenle, mikrogliya birden fazla ayrı işlevlere sahip olan boyunca gelişim ve yetişkinlik büyük tarama alanı kapsayacak yenidoğan ve yetişkin mikroglia, çalışm...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
EDTA, 5mM	Invitrogen	15567-028
Lidocaine, 60mM	Sigma	L-5647
Trypan Blue	Sigma	T8154
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-052-CI
DMEM, 1X	Cellgro	10-017
Sodium Pyruvate	Cellgro	25-000-Cl
Gentamycin Sulfate	Biowittaker	17-518Z
35 x 10mm tissue culture dish	Falcon	353001
Poly-D-Lysine, 100 μg/ml			Dilute 1:20
HBSS, 1X	Cellgro	20-023-CV