JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makalede, formalin içerisinde tespit edilmiş böbrek bölümlerinde microRNA ifade Renkölçer tespiti için optimize edilmiş bir in situ hibridizasyon protokolü tarif eder.

Özet

Bu yazıda microRNA problar etiketlenmiş digoksijenin ile in situ melezleme yoluyla böbrekte miRNA kolorimetrik tespiti için bir yöntem tarif eder. Başlangıçta Kloosterman ve Exiqon miRNA sondalar 1 ile geniş kullanım için meslektaşları tarafından geliştirilen bu protokol, böbrek dokularında miRNA analizinde doğal zorlukları aşmak için modifiye edilmiştir. Bunlar yapı tespiti ve kalıntı prob ve antikor çıkarmak zor gibi konuları içerir. Nispeten ince kullanımı olup, 5 mm kalınlığında, güçlü bir prob sinyal hücrelerinde muhafaza ederken, böbrek yapıları net bir görünüm için izin verilen doku kesitleri. Ayrıca, prob konsantrasyonu ve inkübasyon koşulları Düşük arka plan ve spesifik olmayan sinyal ile mıkroRNA ifade görselleştirme kolaylaştırmak için optimize edildi. Burada, optimize edilmiş prosedür protokolü sonunda slaytların montajı yoluyla ilk doku toplanması ve hazırlama kaplama açıklanmaktadır. Temel componeBu protokolün nts diğer doku ve hücre kültürü modelleri uygulama için değiştirilebilir.

Giriş

MicroRNA endojen olarak üretilir kodlayıcı olmayan RNA'lar (yaklaşık 22 nükleotid uzunluğunda) küçüktür. Bunlar genellikle translasyon baskı veya mRNA degradasyon yoluyla protein ekspresyonunu engellemek için çalışır. eksik tamamlayıcılık mRNA hedeflere miRNA'ların bağlamak mümkün, tek bir miRNA çoklu hedefleri bastırmak için yapım.

Hücre tipleri ve yapılarının miRNA'lar ifade anlayış mekanizmaların anlaşılmasında önemli bir parçası olan aracılığıyla miRNA ifade etkisi hücre ve doku fenotipleri değişiklikler. Bu tür sıralama MiRNA, QPCR ve Kuzey beneklemesi gibi yöntemler bütün dokularda miRNAs tespiti için kullanılabilecek olmakla birlikte, bu yaklaşım, bir de, belirli bir doku içinde gelen hangi belirli bir hücre tipi belirlemek için izin vermez. Bu yöntemlerle analizden önce hücresel ve yapısal bileşenlerin Diseksiyon çok zor olabilir ve yeterli izolasyonların elde etmek için gerekli olan koşullar al yol açabilirgen ekspresyonu ya da RNA'lar parçalanmasında önemli ola. in situ hibridizasyon microRNA dokularda microRNA konumu ve ekspresyon seviyelerini görselleştirmek için kullanılan bir yöntemdir. Bu teknik, böbrek gibi heterojen yapıların, oluşan dokularda, özellikle değerlidir.

MicroRNA böbrek gelişimi 2,3 ve fizyoloji 4 düzenleyici bir rol oynadığı gösterilmiştir. microRNA sentezleme değişiklikler, aynı zamanda, 5-10 fibrosis, diabetik nefropati 7, renal karsinom 11,12 ve akut böbrek hasarı 13 gibi renal patoloji ile ilgili olduğu gösterilmiştir. Bizim araştırmada, böbrek dokularında in situ hibridizasyon mıkroRNA optimize sağlık ve hastalık 14 hem de miRNA ifade tesisinin yapısal yeri saptanması için değerli olduğunu bulduk. Farklı microRNA boru şeklindeki ve hücresel ifade belirlenmesi önemlidir, çünkü ta onların düzenlenmesirgets hücre fonksiyonları bağlı olabilir. Hastalıklı eyaletlerde bu miRNA ifadesi değişiklikler fonksiyonunu etkileyen olabilir belirlemek için de önemlidir.

Burada tarif edilen yöntemin amacı Kloosterman et al. 15, diğer araştırmacılar 16,17 tarafından geliştirilen mevcut ISH yöntemleri üzerine inşa etmek için, ve bu Exiqon 1 tarafından verilir ve formalin sabit böbrek dokularında yöntemini optimize eder. Biz başarıyla tek taraflı üreter 18 ile böbrek mıkroRNA miR-382 ifadesinde belirgin bölgesel farklılıkları belirlemek için bu yöntemi kullandık. Bu yaklaşım ek optimizasyonu ile, hem de diğer dokuları ile kullanılabilir.

Protokol

1.. Böbrek Doku Bölümler

  1. Formalin-sabit (% 10) parafin-gömülü böbrek bölümleri slaytlar analizden önce birkaç ay boyunca saklanabilir bir Microm HM 355 S. kullanılarak 5 mm kalınlığında mikroskop lamı üzerine kesilir.

2. Çözüm Hazırlığı

  1. Bir Otoklavlanabilir vida üst şişede GKD 2 O 1x PBS 1 L hazırlayın. GKD 2 O. 1 L ile bir şişe doldurun Her şişe, kapak DEPC 1 ml ekleyin ve şiddetle çalkalanır. Çözümler RNaz'larına yok etmek ve daha sonra otoklavlanmasıdır gece oda sıcaklığında bekletin. PBS-T için 400 ml Tween-20 1x PBS L 1 ekle.
  2. Proteinaz K tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve DEPC 1 mM CaCl2 su muamele edilmiş) hazırlayın.
  3. PBS-T içinde% 0.2 glisin içeren bir çözelti hazırlayın.

3. Doku Hazırlanması

  1. Hibridizasyon tamponu büyük bir hacim% 50 Formamid oluşan (50-100 ml), 5x SSC,% 0.1 Tween, 9,2 hazırlanmasıpH 6, 50 ug / ml heparin ve DEPC içinde 500 ug / ml maya RNA için ayarlama için mM sitrik asit GKD 2 O. muamele -80 ° C'de 1 ml'lik numuneler hazırlayın ve depoya Böl
  2. Her biri 5 dakika için taze ksilen içinde 3 kez yıkayarak dokudan parafin çıkarın.
  3. GKD 2 O. etanol konsantrasyonunu (% 100,% 75,% 50 ve% 25) azaltmada 5 dakika inkubasyon ile doku bölümleri rehidrate
  4. Tam olarak 1 dakika boyunca doku bölümleri (yaklaşık olarak 0.4-0.5 mi) karşılamak için yeterli DEPC ile slaytlar tedavi. Emin olun dokular kuru değil.
  5. DEPC yılında slaytlar uygun bertarafı için DEFPC içeren atık toplama, 5 dakika boyunca iki kez PBS-T tedavi durulayın. Tüm reaktifler DEPC bu noktadan RNaz'larına ortadan kaldırmak için tedavi edilmelidir.
  6. Ön ısıtılması Proteinaz K tamponu ve 10 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar proteinaz K ilave edin. Proteinaz K solüsyonu ile doku bölümleri kapak ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
  7. Çabuk proteinas çıkarıne K çözeltisi ve 30 saniye için PBS-T içinde% 0.2 glisin ekleyin.
  8. DEPC içinde durulayın slaytlar 30 saniye, her iki kez PBS-T işlemden geçirildi.
  9. 10 dakika boyunca taze% 4 paraformaldehid içinde bölümleri düzeltildi.

4. Melezleme

  1. Hibridizasyon tamponu 50 ul (% 50 formamid, 5x SSC,% 0.1 Tween, pH 6, 50 ug / ml heparin, 500 ug / ml maya RNA için ayarlama için 9.2 mM sitrik asit) doku kesiti başına ekleyin ve RNAse serbest HybriSlips ile kapağı doku bölümleri biraz daha büyük kesilir.
  2. 3 'digoksigenin işaretli prob (sonda genellikle Tm için belirlenmiş DNA melezleştirme sıcaklığında 2 saat boyunca nem kontrollü bir hibridizasyon fırınında Prehybridize bölümler -21 ° C, miR-382 için (örneğin, 54 ° C, DNA Tm = 75 ° C, sonda ), bölmeyi tutmak için% 50 formamide/50% 5x SSC batırılmış doku laboratuar mendil ile nemlendirilir.
  3. MiRNA probu, pozitif kontrol (U6 küçük nükleer RNA) ve negatif kontrol (şifreli sulandırmakhibridizasyon tamponu içinde 40 nM'ye sekans) (tampon maddesi 75 ul), her bölüm gereklidir.
  4. 5 dakika boyunca 65 ° C'de hibridizasyon tamponu içinde probu ısıtın.
  5. Melezleme fırını slaytları çıkarın ve melezleme gelen lamelleri ve aşırı hibridizasyon tamponu çıkarın.
  6. Doğrudan dokuya, doku Bölüm başına prob ihtiva eden bir tampon içinde 75 ul ekle. Doku bölümleri kapsayacak kadar sadece büyük HybriSlips ile doku örtün.
  7. Slayt tutucu düzeyde tutulması, Aşama 4,2 (yaklaşık 16 saat) arası bir sıcaklıkta gece boyunca inkübasyon için melezleme fırını dönün.

5. Sertliği Yıkama

  1. Dokudan lamel serbest bırakmak için sadece lamelleri bir kenarının altında hibridizasyon sıcaklığa ısıtılmış 200 ul 2x SSC ekleyin. Slayt eğerek lamel çıkarın.
  2. 30 dakika her biri için melezleştirme sıcaklık 3x% 50 formamid,% 50 2 x SSC içinde 200 ul slaytlar yıkayın.
  3. DurulamaSlaytlar düşük hızda orbital çalkalayıcı üzerinde 5 dakika her biri için oda sıcaklığında PBS-T içinde 5 kat.

6. Bulma

  1. Düşük hızda orbital bir karıştırıcı üzerinde oda sıcaklığında 1 saat süreyle (% 2 keçi ya da at serumu, 2 mg / ml PBS-T içinde BSA) bloke slayt inkübe edin.
  2. 1:100 bloke edici tampon içinde bir anti-DIP-AP Fab fragmanları seyreltin. Doku Bölüm başına 100 ul ekleyin ve HybriSlips ile kapak bölümünü kaplayacak kadar sadece büyük kesti.
  3. 4 ° C'de, gece boyunca (yaklaşık 16 saat), bir nemlendirilmiş oda içinde antikor inkübe edin.
  4. Düşük hızda orbital çalkalayıcı üzerinde 5 dakika her biri için, PBS-T 7x slaytlar yıkayın.
  5. 5 dakika her biri için, 3x (100 mM TrisHCI pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl,% 0.1 Tween 20) ön-arka tampon maddesi içinde slaytlar yıkayın.
  6. AP tamponuna NBT / BCIP solüsyonu (200 mi μl/10 tamponu)
  7. Tamamen tüm doku bölümleri kapsayacak şekilde her slayt için seyreltilmiş NBT / BCIP çözeltisi 400-500 ml ekleyin. Karanlık, seviye, gösterilmeyen nem Develop4-5 saat için IED odası.

7. Montaj Slaytlar

  1. 5 dakika her biri için etanol konsantrasyonlarını (% 25,% 50,% 75,% 100) artan bölümleri kurutmak.
  2. Bölümleri temizlemek için ksilen 5x inkübe.
  3. Dağı Permount montaj orta ve kuru gecede slaytlar.

Sonuçlar

Hibridizasyonlar, inkubasyon sırasında kurutulmuş veya NBT / BCIP gelişimi sırasında daha koyu lekelere sona genellikle yıkama aşamaları olur bir doku kesitinin alanları. 1 HybriSlip kenarının kaymış olduğu bir böbrek bölümünün bir bölümünü göstermektedir, Şekil kısmen susuz olmak sağlayan doku. Kalan adımda rehidrasyon ve içerisinde rağmen, susuz kısmında sinyal yapay yüksektir.

NBT-BCIP gelişme zamanını kontrol önemi, ...

Tartışmalar

Bu makalenin amacı formalin sabit böbrek dokularında iyi çalışır in situ hibridizasyon miRNA için bir protokol açıklar oldu. Bu protokol üzerinde çalışırken boyama dışlayıcı birçok önemli kaynakları tespit edilmiştir. Bu noktalara dikkat ve özen boyama objeyi önlemek ve başarılı ISH çalıştırmak olasılığını artırabilir.

Haline doku bölümleri uzun inkubasyon sırasında kuruduğunda boyama dışlayıcı en önlenebilir nedenlerinden biri oluşab...

Açıklamalar

Ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen HL082798 ve HL111580 verir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
ParaformaldehydeSigmaP6148
PBSGibco70011044
Diethyl PyrocarbonateSigmaD5758
Tween-20SigmaP1379
XylenesSigma534056
EthanolUltra Pure200CSPTP
Tris-HClLife Technologies15506-017
CaCl2SigmaC2536
GlycineJ.T. Baker4059-00
Citric AcidSigmaC2404
FormamideSigmaF9037
20x SSC BufferLife Technologies15557-044
HeparinSAGENT25021-400-30
Yeast RNALife TechnologiesAM7118
MgCl2SigmaM8266-1004
NaClJ.T. Baker4058-01
Proteinase KFermentasEO0491
3’ DIG- miRNA probeExiqonmiR dependent-05
3’ DIG- Scrambled miR probeExiqon99004-05
3’ DIG- U6 miR probeExiqon99002-05
Anti-Digoxigenin-Ab FabRoche11093274910
NBT/BCIPRoche11681451001
PermountFisherSP15-500
CoverslipsFisherFit to tissue size
Microtom HM 355 SThermo Scientific23-900-672
In-slide Out Hybridization OvenBoekel241000
Aluminum Tray AssemblyBoekelC2403973
Stainless Steel Rack InsertBoekelC2403754

Referanslar

  1. Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
  2. Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors. J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).
  3. Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis. Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).
  4. Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1. Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).
  5. Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes. Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).
  6. Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).
  7. Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).
  8. Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β. Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).
  9. Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells. Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).
  10. Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).
  11. Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer. Urol. 75 (4), 835-841 (2010).
  12. Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21. Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).
  13. Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension. 122 (10), 439-447 (2012).
  14. Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes. Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).
  15. Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
  16. Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).
  17. Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis. Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Temel ProtokolSay 81m kroRNAIn situ Melezlemeb brekrenal t b llerdem kroRNA prob

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır