Zebra balığı görme keskinliğinin bir nicel ölçü olarak Optokinetik Tepki

Özet

Zebra balığı birçok araştırma alanları için değerli bir araç olmuştur. Burada görsel bir yanıt ortaya çıkarmak ve yetişkin Zebrafish fonksiyonel görme keskinliği hesaplamak için bir yöntem ortaya koymaktadır.

Özet

Zebra balığı genellikle larva balık odaklanmış veya basit bir tepki göstermiştir önceki yöntemlerden ancak birçok görme araştırma için kanıtlanmış bir modeli vardır. Daha yakın Zebrafish yetişkin görsel davranış ilgi haline gelmiştir, ancak belirli tepkilerini ölçmek için yöntemler gelen yeni. Bu açığı gidermek için, biz tekrar tekrar ve doğru bir yetişkin zebrabalıkları görme keskinliği ölçmek için optokinetik yanıtı (OKR) kullanmak için bir yöntem geliştirmek için yola çıktı. Burada Yetişkin Zebra Görme keskinliği, binoküler ve monoküler keskinliği dahil olmak üzere, ölçülebilir olduğunu göstermektedir. Balık işlemi sırasında zarar olmadığından, görme keskinliği zaman kısa veya uzun süreler boyunca ölçülebilir ve karşılaştırılabilir. Burada anlatılan görme keskinliği ölçümleri istenirse hızlı, yüksek verim için ve ek görsel işlemler için izin de yapılabilir. Bu analiz türü ilaç müdahale çalışmalarında ya da hastalığın ilerlemesine soruşturmalarına vesile olur.

Giriş

Zebra balığı (Br.rerio) nedeniyle diğer omurgalılar, kısa yaşam döngüsü, ve genetik olarak değiştirilmiş mutantlar ^1,2 kullanılabilirliği kendi retinanın benzerliği görsel fizyoloji çalışmak için iyi bir model vardır. Optokinetik refleks / tepki / nistagmus (OKR) düzgün takip ve hızlı sakkaddan göz hareketlerinin bir kombinasyonudur. 60 yılı aşkın için klinisyenler OKR objektif hastalarda görme keskinliği ölçümü için kullanılan ve bebek görme yeteneklerinin ^3-5 belirlenmesi için özellikle yararlıdır edilebilir olduğunu göstermiştir. Hayvanlarda okr kaydedilmiş ilk kullanımı 1950'lerde ⁶ güvercin kullanıyordum. Daha yakın zamanlarda, OKR larva zebrabalıkları görsel fonksiyonu değerlendirmede ve genellikle görme bozukluğu ^1,2 olan genetik mutantlar için ekran için kullanılan için değerli bir araç haline gelmiştir. OKR yaygın larva Zebrafish görme fonksiyonunu belirlemek için kullanılmış olsa da, sadece son zamanlarda yetişkin zebra kanıtlanmıştır^{7-10 arası} balık. Tappeiner tarafından yeni bir kağıt ve diğ. Geleneksel fareler için kullanılan piyasada mevcut optomotor sistemi kullanır, OptoMotry, yetişkin zebrafish görme keskinliği hatta çeşitli açısal hızlarda ⁷ karşısında, derece başına 0.59 çevrimler (CPD) ~, oldukça sabit kaldığını göstermek için .

OKR larva zebra balığı çalışmalarda oldukça yararlı olduğu kanıtlanmıştır, ancak görsel davranışı için diğer yöntemler başarıya ilişkin olarak değişen derecelerde zebra balığı yetişkinlerde kullanılmıştır. Kaçış tepkisi deneyi hem pigmentasyon mutantlar, parlak ışık koşullarında ^11,12 görsel tepkiler azalttı, albino ve yakut Zebra balığı gösterdi. Bu aynı kaçış tepkisi deneyi de başarıyla yaş ¹³ 2 yıllık da olsa, gece körlüğü d mutantlar belirlemiştir. Ancak, kaçış tepkisi tahlil kusurları olmadan değildir. Bu kesin bir görme fonksiyonu atfetmek zordur ve sadece bir brüt approximatio olduğunuGörsel değişikliklerin n - değişiklik tanımlanır önce büyük bir değişiklik alır anlamına gelir.

Görme bozukluğu olan yetişkin zebrafish belirlenmesi için geliştirilmiş olan bir başka yöntem, optomotor tepkisi (OMR) ^11'dir. Bu deneyde, balık merkezinde bir opak sütun ile dairesel tankı yerleştirilir. Siyah ve beyaz çizgili tankı etrafında döndürün ve balık şerit hareket yönünde yüzme ile görevlendirilmiştir. Kaçış tepkisi gibi, OMR yetişkin zebrafish visuomotor yetenekleri üzerinde duruluyor. Ancak böyle lrp2/bugeye mutantlar ¹⁴ gibi görme bozuklukları, balık tanımlamak için başarıyla kullanılmaktadır. Lrp2/bugeye Zebra balığı sergi buphthalmos, yüksek göz içi basıncı, OMR azalmış, ve progresif retinal dejenerasyon ^14,15.

Birçok çalışmalar genellikle öznel ve kant olamaz yetişkin zebrabalıkları visuomotor yetenekleri, kullanmışitatively analiz edilmiştir. Okr kullanarak, bir daha objektif yetişkin balık görme keskinliği eğitim görebilirsiniz. Biz başlangıçta larva çalışmaları ¹ için kullanılan bir sonra modellenmiştir kendi OKR cihazı, inşa etmişlerdir. Bu çalışmada OKR tek gözlü ve zebrabalıkları binoküler görme keskinliği her iki hesaplamak için kullanılabileceğini göstermektedir.

Protokol

Tüm hayvancılık ve deneyler onaylanmış ve ilgili kurum veya diğer yasal gereklerin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara uygun olarak yapılmalıdır.

1.. Zebra balığı Bakımı

1. 10 saat karanlık-14 saat ışık döngüsü ¹⁶ 28.5 ° C'de standart koşullar altında zebrafish koruyun.
2. Yaklaşık 3 balık / L. tank yoğunluğunda yetişkin zebrafish tutun

2. Optokinetik yanıt (OKR)

1. Tamburu 14,5 cm çapa, ayarlanabilir ışık şiddeti ayarları (300-8.000 lux) ile bir stereo mikroskop ve bir bilgisayar (Şekil 1a) kullanarak özel OKR kayıt cihazını oluşturun.
   1. Bitişik bir monitöre canlı yem sağlamak ve görüntü yakalama ve kayıt için izin verir mikroskop bir kamera takın.
   2. Accommo bir bilgisayara bağlı bir mikrodenetleyici ile dönen bir kontroltarihi, çeşitli hız ve yön seçimleri.
2. 2-3 dakika boyunca 0.016% tricaine balık anestezisi ve sonra kenar üzerinde asılı gözleri ve solungaçları ile küçük bir platform üzerinde balık yer.
3. Balık vücut üzerinde ince bir sünger / havlu yerleştirin ve hareketsiz tutmak için balık üzerinde balık karşılamak için şekilli köpük 2-3 adet, pin. Balık kuyruğu hareketini sınırlama balık yaralanmasına neden olmadan hareketsizleştirme için çok önemli bir yönü olduğu bulunmuştur, ve en iyi köpük düz parça kullanılarak elde edilmiştir. (Şekil 1b)
4. OKR kayıt cihazının döner tambur içinde uygun olduğu, silindir şeklinde bir su dolu bir tank içinde balık yerleştirin. Yaklaşık 7.3 cm tamburun kenarından gözlü, dik balık konumlandırmak için platform üzerinde mıknatıslar kullanın. Balık, birkaç dakika içinde anestezi canlandırmak gerekir - normal solunum devam eder ve rastgele göz hareketleri dikkat edilmelidir.
5. Bir bas yerleştirine dönen tambur içine derecesi (CPD) başına 0.07 döngüleri ızgara ve rotasyonu ve video çekimi başlamak için bilgisayar kontrolleri meşgul (12 rpm hız, bu kağıt için kullanılan, ancak 8-16 rpm hızları benzer sonuçlar vermelidir).
6. Bir ilk OKR ızgara tabanından ortaya sonra, kısa bir süre dönüşü duraklama ve daha küçük bir ızgara (daha yüksek uzamsal frekans) ile ızgara değiştirin.
7. Bir OKR artık ortaya olabilir kadar bu işlemi tekrarlayın. Bir modifiye merdiven yaklaşım aşağıdaki bir okr neden ve sonra okr kaybını doğrulamak için bir yanıt ortaya çıkarmak için başarısız ızgarayı kullanarak tekrarlamak küçük mazgal sınayın. Nihai ızgara birinci söndürme olayı için göreceli değiştirilir, bu işlem, en küçük tespit ızgara için gerçek bir yanıt doğrulamak için tekrar edilebilir.
8. Ters göz bitişik çizgili siyah bir plastik oklüder koyarak monoküler görme keskinliği ölçümleri alın. (2,6-2,7 adımları) yukarıdaki işlemi tekrarlayın.
9. Tıkayıcı yeniden konumlandırma ve yeniden adımlar 2,6-2,7 tekrarlayarak karşısında gözün keskinliği edinin.
10. Her bir göz doğru keskinliği önlemler, aşağıdaki adımlarda hesaplanabilir, böylece balık tank altında referans ölçüm şeridi kullanarak test prosedürü sırasında çizgili dan mesafe dikkat edin.

3. Görsel Keskinliğini Hesaplama

1. CPD hesaplayarak görme keskinliği edinin: Bir ızgara için lens merkezinden mesafedir, ve h OKR (Şekil 1c) gözlendiği en küçük ızgaranın bir döngünün uzunluğudur.
2. Birleştirilen görme keskinliği ölçümleri için, ortalama sol ve sağ göz hem de a-değeri kullanılır.

Sonuçlar

OKR Cihaz İşlevsellik

Yukarıda açıklandığı ve Şekil az bakım ile 1 fonksiyonlar gösterildiği gibi OKR cihaz. Kuyruk immobilize, aşama 2.3 'de belirtildiği gibi, kayıt sırasında ölçülü balıkları tutmak için çok önemlidir. Yeterince hareketsiz, balık zaman uzun süreler için OKR cihazda tutulabilir. Daha fazla veri, her bir balık için toplanır, böylece Sonuç olarak, bakım, ilk hareketsiz adımları sırasında alınmalıdır.

Görme keskinliği ölçümleri

Binoküler OKR kolayca normal erişkin balık açığa çıkartılır. Yukarıdaki prosedürü izleyerek bir çok yaştan zebrabalıkları (Şekil 2) için görme keskinliği bulabilirsiniz. Biz kaydedilen en iyi dürbün mekansal keskinliği 0.74 gbm oldu. Şekil 2 'de belirtildiği gibi, iki gözlü keskinliği genellikle yaşla orantılı olarak artar (n = 46, p = 0.002 ile SPSS V14 ANOVA), fakat düzeyleri offyaş yaklaşık 12 ay sonra. Yabani tip, biz yaştaki lrp2/bugeye balık 5 aylık vahşi tip balık olarak ölçülen görme keskinliği karşılaştırıldığında, biz lrp2/bugeye balık anlamlı keskinliği (p <0.001 azaltılmış buldu: 0.49 ± 0.05 gbm; n = 8; lrp2/bugeye: 0.35 ± 0.06, n = 10; Excel kullanarak Student T-testi).

Sağ göz tıkanmasıyla sol göz için görme keskinliği tam tersi tespit edilebilir. Binoküler keskinliği karşılaştırıldığında, binoküler toplama insan görme ¹⁷ (Şekil 3) benzer görülmektedir. Binoküler görme keskinliği genellikle sağ (OD) veya sol bağımsız olarak ölçülen (OS) keskinliği ya% 5-10 daha iyi oldu. Bazı bireysel balık için fark% 25 iyileşme oldu.

Şekil 1. OKR recording. A) OKR cihaz ayarlanabilir ışık yoğunluğu ayarlarında (300-8.000 lux) ile davul ve mikroskop dönen 14,5 cm çapında oluşur. Bir kamera bitişik bir monitörde bir canlı yayın sağlar. Derece (GBM) göre gereken şekilde dönen tambur saat yönünde ve saatin tersi yönde değiştirilebilir ve uzamsal frekans ızgaralar hem de çeşitli hız ayarı vardır yerleştirilir ve çıkarılır. B) Balık güvenli ve döner tamburun ortasına yerleştirilir. C) döngüleri hesaplanır Mhg = kullanarak Daha büyük resmi görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2. Görme keskinliği yaşla birlikte değişir. Grafik 5 ölçülen bağımsız görme keskinliğini gösterir - Yaş 15 ay. Görme keskinliği genellikle gelişmenin ilk yıl boyunca artar ve daha sonra 15 aylıkken (p = SPSS v14 kullanarak 0.002 ANOVA) de biraz azalır. Her nokta ya 1 ya da birkaç balık temsil edebilir. Görme keskinliği devir / derece (CPD) olarak ölçülür. (N = toplam 46, 5 ayda 8; 6 ayda 4; 8 ayda 7, 9 ayda 6; 10 ayda 11; 11 aylıkken 2; 12 ayda 2 ve 15 ayda 6). buraya tıklayın Daha büyük resmi görmek için .

Şekil 3,. Binoküler görme keskinliği toplamı etkisi. Binoküler (OU) görme keskinliği sağda (OD) veya sola (OS) göz keskinliği göre genellikle daha yüksektir. Bu özel gruptaki OS keskinliği daha düşük bulunmuştur. (* P = 0.006, N = 8),jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig3highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Tartışmalar

Vesileyle balık su tankının içine kaçabilir. Bu kuyruk hareketsiz hale getirmek için önemlidir. Balığın vücut üzerinde ince bir sünger / havlu Ayrıca kullanımı da uzun süre askıya balık tutmak için çok değerli olduğu tespit edildi. Biz balık zarar vermeden bu yordamı kullanarak daha 30 dakika boyunca hareketsiz balık tutmayı başardık. Zaman bu miktar binoküler ve monoküler hem keskinliği yapmak için fazlasıyla yeterli.

Fiziksel olarak dönen bir birimin ya da dijital bir görüntü ^18-22 sunarak buradan ve başka bir yerde tarif edildiği gibi ızgaranın sunumu ya da yapılabilir. Her iki tür avantaj ve dezavantajları var. Biz hem maliyet nedenleri ve teknik özellikleri için fiziksel rotasyon kullanmayı seçti. Bilgisayar ve görüntüleme cihazları hariç, burada açıklanan OKR cihaz yaklaşık 150 $ için inşa edilebilir.

OKR vis belirleyici bir amacı, bir araçtıryetişkin Zebrafish ual keskinliği. Vizyon için birkaç diğer visuomotor analizler önceki deneylerde kullanılan ve ağır konu olmamışsa olsa bile elektroretinogram başarıyla, yetişkin zebrabalıkları gözünde yapılmış olsa da, yetişkin zebrabalıkları OKR birçok yeni deneysel şartlarda ²² kapıyı açar. Bu çalışmada göz hastalığı modellerinde görme keskinliği farkı tanımlayarak, zamanla görme keskinliği değişiklikleri ölçmede okr adlı programını gösterdi ve monoküler görme keskinliği belirlemede gelmiştir.

İlginç olarak, erişkin zebra balığı görme İnsan gözü (20/20) ile karşılaştırıldığında, yaklaşık 20/1, 000 (0.60 cpd -0,3 logMAR'dan dönüştürüldüğünde) 'dir. Bu kötü görünse de, Zebra balığı gözleri çok iyi çevresi için uygundur. 6.5 su cm, polikarbonat birkaç milimetre, ve hava başka bir santimetre bakarak görsel görevi rağmen, balık oldukça iyi bir performans! Biz yetişkin zebrabalıkları keskinliği Abo olduğunu bulunduut. ^23. Kontrast bunların fotoreseptör aralık verilmiş çıkarsanabilecek% 70 olduğu optimum insan performans ile ~ 20/12, ki bu yaklaşık% 80 20/10 öngörülen ve yetişkin Zebrafish görme yeteneğini ölçmek için OKR teknik etkileyici ^{24 25.}

Bağımsız göz görme keskinliği ölçüm tekniği, bir gözü tedavi edilebilir ve diğer bir kontrol olarak kullanılmıştır edildiği çalışmalar için olanak sağlayacaktır. Ayrıca, bu tür katarakt gelişir lrp2/bugeye veya balık gibi asimetrik göz gelişimi ile balık daha doğru takip edilebilir. Bu bakım doğru çizgiler için gözlerden mesafeyi ölçmek için ve görüş alanını tam tıkamak için alınması gerektiği unutulmamalıdır. Bu teknik Zebrafish görme fonksiyonunun daha doğru ve spesifik önlemlere kapıyı açmak gerekir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Super Low Light Black White Video Security Camera	Super Circuits	PC164CEX-2	Any low light camera may be used
Arduino Duemilanove microcontroller	Adafruit Industries		The Arduino Uno is also compatible with the speed control software.
Tricaine Methanesulfonate	VWR	101107-950