Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Özet

Yaygın olarak kullanılan, in vitro olarak hücre göçü ve işgali incelenmesi için oldukça erişilebilir yöntemler tarif edilmiştir. Birinci yöntem, hücre motilitesini büyüklüğüne hücre yara kapatma deneyidir. İkinci yöntem kemotaktik ve hücrelerin invaziv kapasitesini değerlendirir transwell göç ve istila testtir.

Özet

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

Giriş

Motilite canlı hücre bir temel özelliğidir. Hücre göçü ömrü, embriyonik gelişmesi, bağışıklık tepkisi ve kanser metastaz ve enflamasyon ^1-9 gibi birçok patolojik süreçlerin kavramında yer almaktadır. Bu nedenle, hücre göç davranışlarını incelemek için yöntemler biyomedikal bilimler, biyoloji, biyomühendislik ve ilgili alanlarda disiplinler geniş bir yelpazede için çok yararlı bir araştırma araçlardır.

Kanser hastalarında başlıca ölüm nedenidir metastatik ilerlemesi ile ilgili olarak kanser araştırmalarında hücre göçünün çalışma özel önem taşımaktadır. Vücuda yayılmış ve yaymak için kanser için, kanser hücreleri göç olmalı ve intravasate kan dolaşımı içine, hücre dışı matriks (ECM) ile işgal, uzak bir siteye eklemek, ve nihayet uzak odaklar ^1,10-12 oluşturmak için damar dışına. Çeşitli biyolojik yöntemler ayrıntılı olarak bu olayları incelemek için kullanılabilir. Hücre kültürü yara kapanması bird transwell göç ve istila deneyleri geniş bilimsel topluluğun ^1,10 kullanılır. Bu testler belirli bir hücre tipi kendiliğinden göç ya da kemo-cezbedici cevap ve yönlendirilerek ona doğru nasıl göç iyi bir anlayış için izin verebilir gerekli verileri sağlayabilir. Çeşitli göç fenotipleri tarif edilmiştir. Hücreler, mezenşimal veya amoeboid benzeri hareket bölgesi veya ¹³ geçiş akış toplu ya da çok-etiketli hücre hareketi ile görüldüğü gibi, tek bir hücre şeklinde aktarılabilir. Hareketli hücrelerinde kullanılan hareket ait yöntem hali hazırda hücre kültürü yara kapatma tahlili kullanılarak gözlemlenebilir.

Hücre göçü çalışma için çok çeşitli yollar arasında, hücre yara kapatma deneyi basit biridir. Bu yöntem, tüm hücre kütlelerinin göç yeteneğini belirlemek için yararlıdır. Bir adım daha ileri alındığı zaman göç ¹⁴ sırasında bireysel hücrenin morfolojik özellikleri gözlemlemek için kullanılabilir. Yara kapanmasının analizi takiben birçok fenotipleri ortaya olabilir. Bir kontrol karşılaştırırken zamanla kapalı mesafeyi ölçen spesifik migrasyon değişiklik ya da önceden bilinmeyen bir engelli göçmen fenotip ortaya çıkarabilir. Ayrıca, tek bir hücre lamellipodium oluşumu, kuyruk geri çekme ve yönlü hareket ilgi ¹⁴ hücrelerinde bozulmuş veya gelişmiş olabilir ne için ipuçları verebilir.

Transwell göç ve istila deneyleri yönde bu kemokinler, büyüme faktörleri, yağlar, ya da nükleotid ^4,5,8,15,16 olup çeşitli kemo-cezbedici yanıt tek hücrelerinin yeteneği analiz etmek için kullanılabilmektedir. Ayrıca nedeniyle reseptörünün ^1,14 aşırı ifade diferansiyel göçmen yeterliliğini değerlendirmek olabilir. Bu deneyler, aynı zamanda, küçük bir GTPases ^2'nin Rho aile olarak hücre göçü anahtar regülatörleri belirlemek ve karakterize etmek için kullanılabilir. Acces kolayca bu kısa ve ardındanmak testleri, hücre göçünün modu ve bir 3-D matrisine işgal etmek için bir hücrenin yeteneği de belirlenebilir.

Protokol

1.. Hücre Kültürü Deneyi yara kapatma

1. Tripsin-EDTA solüsyonu% 0.25 ile doku kültürü hücreleri plakadan ayırın. Santrifüj ile bir 15 ml konik tüp içinde Pelet hücreleri, süpernatant aspire ve kültür ortamı hücreleri yeniden askıya. 24 saat içinde% 100 birleştiği için bir 6-çukurlu plaka içindeki hücrelerin uygun plaka.
   Not: Testler (örneğin, 1 x 10 ⁶ B16F10 melanom hücrelerinin bir kuyuda tohumlanır nedeniyle hücre tipi ile de kullanılan ölçülerine% 100 izdiham elde etmek için zaman ve hücrelerin sayısını belirlemek için gerekli olabilir 6-çukurlu plaka önce yara kuşağa 24 saat). Seçenek olarak ise, 12-iyi veya 24 oyuklu plakalar kullanılabilir.
   Not: Varsa, hücreler yara ön-döküm yapan bir tedavi doku kültürü plaka üzerinde bir Kültür-Insert (Ibidi LLC) içine numaralı seribaşı olabilir. A Kültür-takın pipet tarafından zararlardan doku kültürü plaka yüzeyini koruyabilirsiniz. Bir Kültür-Ekle omit adım kullanılırsa1.2.
2. Steril bir ortamda (genellikle bir biyogüvenlik kaput) doku kültürü plakasının üst karşı sıkıca basın 200 ul pipet kullanın ve hızla hücre tek tabaka aşağı dikey bir yara olun. Farklı büyüklükte pipet istendiği yara boyut yapmak için kullanılabilmektedir. Bu yüzeye zarar verebilir gibi pipet ile doku kültürü plakası karşı aşırı güç kullanmayın. Yara ön döküm ise bu adım, ihmal edilebilir.
3. Dikkatli medya ve hücre artıkları aspire. Yavaş yavaş kuyunun alt kapağı ve ilave ayırma hücreleri önlemek için de duvara kadar bir kültür ortamı eklenir. Yaranın üretimi ve kontrol eden bir ilk görüntü alınmalıdır. Uygun sıcaklık ve _CO2 konsantrasyonunda ayarlanmış bir kuluçka makinesi içinde doku kültürü plakayı (tipik olarak 37 ° C ve% 5 _CO2).
4. Bir kaç zaman noktasında, her 3 saatte bir, örneğin incubat ikinci plakayı kaldırınya da bir anlık resim çekmek için ve yara kapanması kontrol etmek için ters bir mikroskop altında yerleştirin. Zaman atlamalı mikroskopi varsa, her zaman bir sıcaklık süresi ve CO ₂ kontrol odası için Fotoğrafa (genellikle her 5 dakika ile başlayarak) dakika her X numarası almak. Hücre tipine bağlı olarak, yara kapanma süresi değişebilir.
5. Anlık resimlerin sonuçlarını analiz etmek, bir ölçek çubuğunu kullanarak diğer yaranın bir tarafındaki mesafeyi ölçün. Bir dağılım grafiği veya çubuk grafiği, örneğin Şekil 1 kullanarak analiz eder ve zamanla açık bir şekilde mevcut yara kapama.
6. Time-lapse fotoğrafları analiz etmek, bir video yapmak (http://rsb.info.nih.gov/ij/ serbestçe kullanılabilir) ImageJ yazılımı içine resim almak. Bu açık ImageJ yapmak için, İçe Aktar'ı tıklatın ve Görüntü Sırası. Resimlerle dosyasını bulun; dosyasındaki ilk fotoğrafı tıklayın. , Dosya seçerek video kaydetmek gibi kaydedin, ve AVI. Tek göç hücreleri chara kadar görülebiliryönlü hareket cterize. Ayrıca, bu tür lamellipodia oluşumu ve arka kenar olarak geri çekilmesi morfolojik özellikleri (Şekil 2 ve ek video) de incelenebilir.

2.. Transwell Hücre Göç ve Invasion Testi

1. Steril bir ortamda (tipik olarak bir biyo-güvenlik kapağı), bir enzimatik olmayan hücre ayrışma tamponunu ya da% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi, topak santrifüj ile hücreler kullanılarak doku kültürü hücreleri plakadan ayırmak ve mevcut medya pelet hücreleri bırakarak aspire. % 0.1 BSA (sığır serum albümini) içeren serumsuz hücre kültür ortamı içinde yeniden askıya hücreleri.
   Not: Tripsin-EDTA nedeniyle hücre yüzeyi ¹⁷ üzerinde çeşitli reseptörlerinin bölünme hücre göçü ve invazyonu etkileyebilir% 0.25 araştırılmaktadır hücre hattı ile ilgili olarak.
   Not: ml başına hücre sayısı hücrelerin büyüklüğüne bağlıdır. Ileri testler pro tohumlama yoğunluğu bulmak için gerekli olabiliriyi sonuçları vardır: Command. 24 oyuklu eklemek Transwell kullanırken tipik olarak 1 x 10 ⁶ hücre / ml 'çoğu hücre tipi için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. Bir Transwell insert boyutları aralığı ve katma hücre sayısı için buna uygun olarak ayarlanmalıdır bulunmaktadır.
2. Levha 100, transwell prospektüste filtre zarı üzerine hücre çözeltisinin ul ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe ve% 5 _CO2, hücreler yerleşmek için izin vermek.
   Not: Kullanılan transwell Zarın gözenek boyutu, belirli bir numunedeki hücrelerin kendi boyutuna bağlıdır. Hücreler, çok küçük, örneğin, bunlar göç kolaylaştırmak için gerek kalmadan gözeneklerden geçebilir ya da çok büyük olduğunda bunlar gözeneklerden uymayabilir. Birkaç transwell 3 ila mikron arasında gözenek boyutları ile uçlar, 5 um, ve hücre göçü deneyleri için 8 mikron vardır. Transwell uçlar örneğin Corning gibi firmalardan ticari olarak temin edilebilir.
   Not: transwell migration deneyi kolaylıkla hücre istilası tahlili gerçekleştirmek için modifiye edilebilir. Bunu yapmak transwell membran üstüne dışı matris (ECM) malzemeleri ekleyin ve sonra ECM üstüne hücre eklemek için. Örneğin, Matrigel çözülmüş ve buz üzerinde sıvılaştırılmış ve Matrigel 30-50 ul eklemek transwell 24 oyuğa ilave edilir ve bir ince jel tabakası oluşturmak için 15-30 dakika için bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde katılaştırılır. Hücre çözeltisi hücre-dışı matris boyunca işgal taklit etmek için Matrigel kaplamanın üzerine ilave edilir.
   Not: transwell hücre göçü ve transwell hücre işgali tahliller arasında belirgin farklılıklar vardır. Hücre göçü, transwell tahlil, bir kemo-cezbedici doğru hücrelerin kemotaktik yeteneğini ölçer. Transwell hücre istilası deneyi Ancak, hücre dışı matris boyunca genel olarak kanser metastazı veya embriyonik gelişim bulunan bir işlem hücre kemotaksisi ve hücre işgalini iki ölçer.
3. Bir pipet kullanarak, çok carefully, 24 oyuklu bir plaka içerisinde, alt haznesinin alt kısmına istenen kemo-cezbedici 600 ul ekleyin. Transwell yuvasını taşımadan kemo-cezbedici ekleyin ve kabarcıkları oluşmasını önlemek. Alt kuyudaki kemo-çekici sıvı kemotaktik bir gradyan meydana getirmek üzere, üst oyuğundaki membran ile temas emin olun. İnkübasyon süresi, hücre tipine ve kullanılan kemo-cezbedici bağlıdır.
   Not: Diğer testler kuluçka dönemi belirlemek için gerekli olabilir.
   Not: yapışık hücreler için, göç eden hücreler zar ^1,8 diğer tarafına eklenecektir. Göç eden hücrelerin miktar adımları 2.4 (2,4-2,8 steril bir ortamda yapılması gerekmez adım) 2.8 için aşağıdakilerden yapılabilir. Yapışkan olmayan hücreler için, göç eden hücreler alt bölmede ise ortamı içine düşecektir. Göç eden hücre sayısı hemasitometre kullanılarak sayıldı ve ⁵ akış sitometresi edilebilir.
4. Plakadan transwell yuvasını çıkarın. Gerektiği gibi dikkatli bir şekilde zarar vermeden, zarın üstünden geçirilir olan medya ve kalan hücrelerin çıkarılması için birçok kez bir pamuk uçlu bir aplikatör kullanın.
5. Bir 24-yuvalı plaka içinde bir kuyuya% 70 etanol 600-1,000 ul ekleyin. Hücre sabitleşmesi için 10 dakika boyunca% 70 etanol içinde transwell koyunuz. 24-iyi plaka transwell parçayı çıkarın ve zarın üstünden kalan etanolü çıkarmak için bir pamuk uçlu bir uygulama aleti kullanmak. Transwell membran (genelde 10-15 dakika) kurumasını bekleyin.
6. Bir 24-yuvalı plaka içinde bir kuyuya% 0.2 kristal violet 600-1,000 ul eklenir ve boyama için zar içine yerleştirin. 5-10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
7. Yavaşça bir pipet ucu ya da pamuklu çubuk ile zarın üstünden kristal mor çıkarın. Gerektiğinde çok dikkatli bir şekilde, sabit bir hücrelerini yıkama önlemek için fazla kristal Viole kaldırmak için pek çok kez damıtılmış su içine daldırma zart. Transwell membran kurumasını bekleyin.
8. Görüntüle, ters döndürülmüş bir mikroskop altında ve kemo-cezbedici doğru zardan geçirilir ve zarın alt (Şekil 3) üzerine takılı olan hücrelerin ortalama bir miktar elde etmek için farklı görüş alanları hücrelerin sayısı.

Sonuçlar

Burada sunulan deney yara kapatma ve Transwell hücre göçü deneyi, bir model sistem olarak fare B16F10 melanom hücreleri kullanılarak yapıldı. Yara kapatma tahlilde, B16F10 hücrelerinin bir 6-yuvalı doku kültürü plakasında tohumlandı ve 24 saat içinde% 100 konflüansa büyütülür. Yaklaşık 700 mikron genişliğinde bir yara time-lapse mikroskopi kullanılarak kaydedilen bir pipet ve yara kapanmasını (hücre göçü) kullanılarak oluşturulmuştur. Alternatif olarak, yara kapama da time-lapse mikros...

Tartışmalar

Hücre göçü kanser araştırmalarında incelemek için önemli bir yönüdür ve aynı zamanda, gelişim ve yara iyileşmesi immünolojik çalışmalar uygulanabilir. Hücre kültürü kapatma deneyi yara ve transwell hücre göçü ve işgali deneyleri hücre göç davranışları ayrıntılı bilgilerin açığa çıkarılması ve hücre göçü ^1,2,10,14 moleküler mekanizmaları araştırmak için kullanılabilir. Çalışmamız B16F10 melanom hücre çizgisinin hareket hızı ve invazyon yeteneklerini...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Gibco	11995-073
Fetal bovine serum (FBS)	Gemini	100106
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200-056
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-250
Crystal violet	Sigma	C0775-100G	Dissolved in water at 0.2%
Cell disassociation buffer	Gibco	13151-014
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific		Model # 3145
SterilGARD biosafety hood	The Baker Company, Inc.		Model # VBM-600
EVOS Fl inverted microscope	Thermo Fisher Scientific		Model # AMF-4302-US
Tissue culture plate	Becton Dickinson	353046	Catalog number varies depending on the type of culture plate
Corning Transwell insert	Fisher	07-200-150	Catalog number varies depending on the pore size of the membrane