Microfabricated Kanallar Hücre Göç Çalışması

Özet

Tek boyutlu bir kapalı mikro hücrelerin spontan göç incelemek için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, mikrofabrike kanalları yararlanır ve tek bir deneyde, farklı koşullar altında hücrelerin büyük sayıda göçünü incelemek için kullanılabilir.

Özet

Burada tarif edilen yöntem, bir boyutta kapalı alan içinde hücre göçü çalışma sağlar. Bu fiziksel kısıtlamaları ile hücrelere bir polarize fenotip empoze mikrofabrike kanalların kullanımına dayanmaktadır. Ileri ya da geri hareket: kanalların içine kez hücreler yalnızca iki olasılık var. Yön sınırlı olduğu bu basitleştirilmiş göç hücrelerinin otomatik izleme ve hücre hareketini tanımlamak için sayısal parametreler çıkarma kolaylaştırır. Bu parametreler, hareket esnasında hücre hız, yön değişimleri ve duraklar içerir. Mikro kanallar da floresan markerlerin kullanımı ile uyumludur ve yüksek çözünürlükte hücre geçiş sırasında, hücre içi organel ve yapıların lokalizasyonu incelemek için uygundurlar. Son olarak, kanalların yüzeyi kanallar ya da haptotaxis çalışma yapışkan özelliklerinin kontrol etmesine izin veren, farklı alt-tabaka ile fonksiyonalize edilebilir. Özet olarak, sistem here tarif bağımsız deneyin normalleştirme ve tekrarlanabilirlik kolaylaştırılması, geometri ve çevrenin biyo-kimyasal yapısı hem de kontrol edildiği koşullarda hücre sayıları büyük göçünü analiz etmek için tasarlanmıştır.

Giriş

Göç gelişimi, bağışıklık yanıtı, doku rejenerasyonu ve da dahil olmak üzere çok-hücreli organizmada, pek çok fizyolojik süreçler için önemli olan bir kompleks hücresel fonksiyonudur. Buna ek olarak, bu tür tümör istilası ve metastaz gibi bazı patolojik durumlar, hücre motilitesi ¹ dayanır. Bu nedenlerden dolayı, hücre göçü temel ve translasyonel hem araştırma bağlamında çalışmanın önemli bir alan haline gelmiştir. In vivo, çoğu dokuların zengin hücre-dışı matris ve yüksek hücre yoğunluğu ile karakterize edilir. Hücre göçü, bu nedenle, fizyolojik koşullar altında, bir kompleks kapalı bir ortamda meydana gelir. Klasik, çoğu tarihsel nedenlerden dolayı ve teknik sınırları olasılığı, hücre göçü gibi hapsi olarak dokularda bulunan çevre özelliklerinin çoğunu yeniden yok düz 2D sistemlerinde çalışılmıştır. Ayrıca, 2B motilite için gerekli olan hücre yapışması gibi faktörler, son zamanlarda necessa olmayabilir gösterdi edilmiştirrily 2B ve diğer ortamlarda hücre lokomosyonu kural mekanizmaları ² ayrı olduğunu öne sürerek, in vivo veya jellerin içinde göç için gerekli. Çeşitli hücre dışı matris sistemleri, bileşimin ³ özelliklerini yansıtan nişan dokuların, en ünlü olmak kollajen jel, karmaşık özelliklerini taklit etmek için geliştirilmiştir. Burada kapalı bir ortamda bir boyutta çalışma hücre göçünü sağlayan basit bir tamamlayıcı bir yöntem olarak mikrokanalların öneriyoruz.

Bu sistemde hücreler kendiliğinden girmek içine Mikrokanallar boyunca göç. Göç eden hücreler, daha sonra, büyük olasılıkla da bir polariteye güçlendiren boru şeklinde bir geometri benimseyerek, kanal şeklini kazanır. Kanallardaki hücrelerin doğrusal hareket otomatik hücre izleme ve deneylerden elde edilen kantitatif parametrelerin çıkarma sağlar. Görüş teknik açıdan bakıldığında, bu sistem kolay ve esnektir. Coatinkanal duvarlarının g kanalların boyutu ve şekli uyarlanabilir, manipüle edilebilir ve hücreler, çok sayıda tek deneylerde analiz edilebilir. Bu sistem aynı zamanda ölçekli yukarı olabilir hücre hareketi katılan moleküllerin orta menzilli ekran analizini gerçekleştirmek. Burada açıklanan protokol hücresel bir model olarak dendritik hücreler (DC) kullanılarak standardize edilmiştir. Bu ^4.. In vitro, DCler kendiliğinden kapalı ortamlarda geçiş gösterilmiştir spesifik bağışıklık yanıtlarının başlatılması ve bakım katılabilir ve bu nedenle mikro ^5,6 hücre hareketliliği incelemek için iyi bir model olarak bu hücreler bağışıklık sistemi için anahtar . Önemli olarak, bu sistem, T lenfositler, nötrofiller, ya da tümör hücreleri ^7-9 gibi başka bir hücre tipi hareketli göçünü analiz etmek için uzatılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Önemli not: Bu protokol, istenen mikrokanalların şeklini içeren kalıp zaten yapılmış olduğunu varsayar. Kalıbın hazırlanması hakkında daha fazla bilgi ^10, daha önce yayınlanmıştır. Bu protokol aynı zamanda kemik iliği DH'leri kültürü bilindiğini varsayar.

1.. Chip Fabrikasyon

1. Plastik bir kap içinde bir ağırlık oranı 10:1 PDMS yağ ve sertleştirme maddesi karıştırın. İyice her iki bileşiği karıştırın.
2. Kalıp yatak mikrokanalların üzerinde karışımı döküm. Toplam yüksekliği 0.5-1 cm arasında olmalıdır.
3. 1 saat boyunca bir vakum kavanoz çan hava kabarcıklarını çıkarın.
4. 65 ° C'de 2 saat boyunca bir fırın içinde ikinci yerleştirerek küfü içinde katılaşmaya PDMS
5. PDMS oda sıcaklığında sonra, bir cerrahi bıçak ile yapı etrafında büyük bir parça kesilir ve kalıbın (Şekil 1A) onu soyulabilir.
6. Hücreleri enjekte edilecektir delik (tipik olarak 2 mm) bir matkap ve PDMS boyutlandırmagöç (Şekil 1B) değerlendirilecek olan cam alt yemekleri boyutuna uyması için bir cerrahi bıçak ile. Devam etmeden önce, temizleme kağıdı lens kullanarak yemeğin kalan toz kaldırmak. Bu aşama 1.10 tarif cam PDMS bağlayıcı yanadır.
7. Yapı tarafta yapışkan bant yapıştırma ve soyma kanalları içeren resized PDMS çipi temizleyin.
8. PDMS toz ve küçük parçacıkların ayrılması için% 70 etanol içinde PDMS parçaları da 30 saniye sonikasyon. Temiz hava üfleme hızla sonradan onları kurutun.
9. 300 mTorr 30 sn boyunca hava (veya oksijen) ile (yukarı yapılar) ve PDMS kültür kaplarına aktive plazma işleme.
10. Sürekli olarak alt-tabaka için, PDMS sopa temas halindeki her iki yüzey aktif yerleştirin. Eğer gerekirse, polimer ve çanak (Şekil 1C) ve cam arasındaki temas zorlamak için PDMS üstüne hafifçe basın metalik forseps kullanır.
11. 65 ° C de fo fırında çipi inkübebağlama güçlendirmek için r 1 saat.

2. Mikrokanallarda Kaplama

1. 1 dakika boyunca 300 mTor hava plazma tarafından tüm yapıyı etkinleştirin. Bu, bir sonraki aşamada da kanal içine sıvının girişini teşvik edecektir.
2. Su içinde 10 ug / ml 'de hızlı bir fibronektin ile çipin giriş delikleri doldurun. PEG gibi diğer alt-tabakalar kanal duvarlarına hücre yapışmasını değiştirmek için kullanılabilir. Sıvı yapının tamamı yayılır dikkat ediniz. Bu kolaylıkla normal ışık altında ya da düzenli bir aydınlık alan mikroskobu kullanarak gözle kontrol edilebilir.
   NOT: difüzyon zor olan çok küçük yapılarda, kanallardaki sıvı girişi, en az 15 dakika boyunca bir vakum çan kavanoz yapıyı yerleştirerek zorlanabilir. Fluoresan alt-tabakalarını kullanılabilecek kaplama verimliliğini (Şekil 2) kontrol etmek için.
3. Fibronektin adsorpsiyonu ya da başka kaplama subst izin vermek için, oda sıcaklığında 1 saat inkübe edinkanalların duvarlarına hızı.
4. Bu yapıların nonbound tabakayı uzaklaştırmak için PBS ile 3 kez yıkayın.
5. Yıkama işleminden sonra, Protokol 3 geçin veya sonraki bir kullanım (24 saat maksimum) 4 ° C'de çipi saklayın.

3. Hücre Yükleniyor

1. Plaka PBS çıkarın ve hücre ortamı ile mikrosistem doldurun. Ortam ile kanal doyurmak için 1 saat boyunca inkübe olsun.
   NOT: molekül inhibitörleri gibi ilaçları içeren deneyler için, doğru konsantrasyonda ilaç ihtiva eden bir ortam maddesi ile kanal Preincubate için tavsiye edilir. Ayrıca, bazı ilaçlar, etkin konsantrasyonunu azaltan PDMS yapısında çözünür olma eğilimindedir. Bazı çözümler bu sorunu ^11-12 karşı ileri sürülmüştür.
2. Yüzer DC'ler çıkarın ve kültür ortamı ile yıkama ile, yarı-yapışkan hücreleri iyileşir. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
   NOT: çekirdeği görüntüleme için, Hoechst 33342 boyama in tarafından önceden elde edilebilirtam ortam içinde 200 ng / ml 'de boya ile 30 dakika boyunca 2 x 10 ⁶ hücre cubating. Protokolü devam etmeden önce boyanın fazlasının ayrılması için santrifüj ile iki kez yıkanır.
3. 5 dakika (zaman ve hız hücre türüne bağlı olarak farklı olabilir) esnasında 300 xg'de hücreleri Santrifüj ve orta atın. 20 x 10 ⁶ hücre / ml 'lik bir konsantrasyon elde etmek için topağı seyreltin.
4. Plakadan ortamın fazlalığını çıkarın ve bir mikropipet kullanılarak PDMS yapısındaki giriş delikleri boşaltın. Her giriş deliği 1 x 10 ⁵ hücre bir miktarda ulaşmak için hücre çözümü 5 ul girdileri doldurun.
   NOT: Yüksek hücre yoğunluğu kanalları hücrelerin temas lehine için gereklidir. Düşük hücre yoğunluğu kanal ve deney hatası içinde hücre sayısı düşük neden olabilir.
5. Inkübatör içinde 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin mikroçip. Deney çanak tam ortam 2 ml ilave edilir.
   NOT: Bütün PDMS yapısı b gerekire deney sırasında hücrelerin kurumayı önlemek amacıyla kapalı. 2 ml yeterli değilse, tamamen PDMS yapısı karşılamak için daha fazla orta ekleyin.

4. Görüntüleme

1. Mikroskop altında plakaları yerleştirmeden önce bir objektif temizleme beziyle yemekleri dış alt yüzeyini temizleyin.
2. Hücrelerin çok sayıda geçiş analiz etmek için, bir _CO2 ve ısı donanımlı video mikroskop 10X büyütme ve geniş alan aydınlatma (Şekil 3) kullanın. Hücre izleme kolaylaştırmak için, Hoechst boyama ve UV ışığı (adım 3.2) de kullanılabilir. Göç aynı zamanda göç sırasında hücresel yapıların daha yüksek çözünürlük elde etmek için konfokal mikroskopi kullanılarak analiz olabilir.
3. 10X de zaman atlamalı mikroskobu için, beklenen hücre hızında (5 mm / dk 'lık bir hız ile göç eden dendritik hücreler tipik olarak 2 dakika)' e uygun bir zaman frekansı seçin.
   Not: Burada açıklanan protokol n yaparot hücre göçü parametrelerin analizini içerir. Birkaç puan time-lapse film bilgileri ayıklamak için nasıl devam için okuyuculara tavsiye tartışma listelenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Her bir deneyde, PDMS yüzey çalışmanın ilgi uyarlanmış bir molekül ile kaplanır. Önce ve (adım 2.4) yıkandıktan sonra bir flüoresan molekül, PLL-PEG-g, kaplanmış Şekil 2, kanal Şekil. Böyle bir deney, kanallardaki kaplamanın homojenliği kontrol sağlar.

Hücre Yükleme işleminden sonra, bir video mikroskobu hücre göçü takip gerçekleştirilebilir. Şekil 3A, DC hücreleri izlemek için uygun bir yoğunlukta mikro g...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada tek deneylerde hücre sayıda göç özelliklerini incelemek için bir yöntem olarak mikro oluşan bir cihaz tarif etmektedir. Bu deneysel sistem endojen göçmen hücreler tarafından dokularda bulunan sınırlı çevresel kısıtlamalar taklit eder. Ancak, tek bir boyutta göç zorlayarak, otomatik hücre izleme ve measurables çıkarılması (Şekil 5) kolaylaştırır. Aynı zamanda cihaz floresan mikroskobu ile uyumlu olduğunu ve bu nedenle hücre motilitesini farklı aşamalarında

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diameter 2.5 mm
Glass-bottom dish	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC 32 G	For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254