JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA) ile bir araya PCR zebrafish genotip için hızlı ve etkili bir yöntem olarak gösterilmiştir.

Özet

Zebra balığı, geliştirme eğitimi hastalık modelleme ve uyuşturucu taraması gerçekleştirmek için güçlü bir omurgalı model sistem. En son genetik araçlar çeşitli mutasyonlar neden olan ve transgenik çizgiler üretmek için çeşitli stratejiler de dahil olmak üzere, getirilmiştir. Bununla birlikte, büyük ölçekli tarama zaman alıcı ve emek yoğun olan geleneksel genotipleme yöntemleri ile sınırlıdır. Burada yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA) ile birlikte PCR ile Zebrafish genotipleri analiz etmek için bir tekniği açıklar. Bu yaklaşım, kirlenme eserler düşük riski, hızlı, hassas ve ucuzdur. HRMA ile PCR ile genotipleme yüksek verimli tarama protokolleri de dahil olmak üzere, embriyo veya yetişkin balıklar için kullanılabilir.

Giriş

Zebrafish (Br.rerio) yaygın gelişimi ve hastalığın modelleme çalışmaları için kullanılan bir omurgalı bir model sistem. Son zamanlarda çok sayıda transgenik ve mutasyon zebrabalıkları teknolojileri geliştirilmiştir. Genellikle Tol2 transpozon sistemi 1 göre hızlı transgenesis teknikleri, birden fazla DNA fragmanı düzeneği 2 için gelişmiş klonlama seçenekleri ile kombine edilmiştir. Çinko-Parmak nükleazlar (ZFNs) ve transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (TALENS) zebra balığı 3,4 hem somatik hem de germlin hücrelerinde mahalleri hedeflemek üzere kullanılmıştır. Bu teknikler, etkili bir şekilde yüksek frekanslı mutasyon oluşturulması ve germ-hattı iletim 3,4 olan, genetik olarak modifiye edilmiş hayvanlar oluşturabilir.

Bu ilerlemelere rağmen, zebrabalıkları geleneksel genotip teknikleri mütajeni ve Transgenesis araçlarının tam gücünü sınırlamak. PCR bazen KISITLAMAL ile birlikte, jel elektroforezi, ardındann enzim sindirimi, yaygın genom değişiklik tespit etmek için kullanılır, ancak zaman alıcı ve küçük eklemeleri veya silmeleri tanımlamak için daha az hassas olmasıdır. TaqMan probu tahliller yüksek başlangıç ​​maliyetleri ve dikkatli optimizasyon gerektirir. PCR ürünlerinin dizileme birkaç gün sürebilir ve büyük ölçekli tarama için pratik değildir yapabilirsiniz. RFLP (RFLP) analizi sadece kısıtlama enzimi tanıma siteleri, sınırlı etkileyen SNP ayırt edebilir.

Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA), kapalı-tüp post-PCR analiz yöntemi, hızlı, hassas, ucuz ve örneklerin çok sayıda tarama için müsait bir yeni geliştirilen bir yöntemdir. HRMA SNP, mutasyonlar ve transgenlerin 5-7 tespit etmek için kullanılabilir. HRMA çift sarmallı DNA 'ların termik denatürasyona göre ve her bir PCR amplikonu karakteristik benzersiz bir ayrışma (erime) 5 vardır. Numuneler nedeniyle t ayrımcılık olabiliro Farklı nükleotid bileşim olup, GC içeriği veya uzunluğu, tipik olarak, bir floresan boya ile kombinasyon halinde, sadece çift sarmallı DNA 8 bağlar. Böylece, HRMA farklı erime eğrisi özelliklerine göre farklı genotipleri ayırt edebilir. HRMA düşük maliyetli reaktifler kullanır ve bir tek aşamalı post-PCR işlemi olduğu için, yüksek verimli stratejileri için kullanılabilir. HRMA böylece analiz aşağıdaki PCR amplikonları diğer uygulamalar için de kullanılabilir, yıkıcı olmayan bir. HRMA hücre çizgileri, fare ve insan da dahil olmak üzere pek çok, 9-11 organizmalar ve sistemleri, uygulanmıştır. Kullanımı son çinko parmak nükleazlara (ZFNs) ve TALENS 6,12,13 neden mutasyonları tespit etmek için zebrabalıkları tarif edilmiştir.

Bu yazıda, (Şekil 1), embriyonik ve yetişkin zebrabalıkları PCR tabanlı HRMA gerçekleştirmek için nasıl açıklar. Bu protokol si de dahil olmak üzere, SNP, transgenlerin ve mutasyonları tespit etmek için uygundurngle temel-çift değişiklikler, eklemeler veya silmeler.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1.. DNA hazırlanması

  1. 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCl pH 8.3,% 0.3 Tween 20,% 0.3 NP-40: DNA lizis tamponu hazırlayın. Kullanım 12 günde 1 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar proteinaz K ilave taze.
  2. Doku toplama:
    1. Yetişkin balık yüzgeç klibi için:
      1. Balık anestezisi: 0.004% MS-222 (tricaine) çözümü de balık yerleştirin. Solungaç hareketi yavaşlatır kadar bekleyin.
      2. 5-10 Kimwipes bir yığın balık koymak ve steril bir jilet ile kuyruk yüzgecinin, yaklaşık 2-3 mm, küçük bir parça kesti.
      3. Hızla geri kazanımı için temiz su ile etiketlenmiş bir tankta balık yer, özenle fin klip içerecek tankı ve ilgili tüpü hem etiket. Su değiştirin ve her gün balık yemi.
      4. Steril bir pipet ucu ile kanat klibi almak ve 100 ul DNA liziz tamponu ile dolu bir tüp içine aktarın.
      5. Pipet atmak ve bir kesici kabın içine jilet atmak.
    2. Embriyo kuyruk klibi için:
      1. % 0.004 MS-222 (tricaine) çözelti içine embriyolar yerleştirin. 2 dk bekleyin.
      2. Bir tahlil mikroskobu altında forseps ile kuyruk bir parça kesin.
      3. 30 ul DNA liziz tamponu ile dolu bir etiketli tüp içine kuyruk koyun.
      4. Hızla 100 ul% 4 paraformaldehid içeren bir tüp içine embriyo koydu.
      5. Embriyo ve bunlara karşılık gelen kuyruk tüpleri ile Etiket tüpler.
      6. Tespit için 4 ° C sıcaklıkta gece boyunca embriyolar ile tüpleri saklayın.
      7. Kirlenmeyi en aza indirmek için her bir embriyonun arasında Milli-Q su ve Kimwipes kullanarak forseps temizleyin.
    3. Bütün embriyo için:
      1. % 0.004 MS-222 (tricaine) çözelti içine embriyolar yerleştirin. 2 dk bekleyin.
      2. DNA, 100 ul lizis tamponu ile doldurulmuş bir tüp içinde 1-5 embriyolar koyun. Dechorionation gerekli değildir.
  3. DNA sindirim
    55 ° C'de doku (fin veya kuyruk klipleri ya da embriyolar) ile inkübegecede 12 4 saat kadar için.
  4. Proteinase K inaktive
    15 dakika 12 boyunca 95 ° C'ye kadar ısı boruları. DNA PCR için hemen kullanılabilir veya en fazla 3 ay boyunca -20 ° C'de saklanmalıdır.

2. PCR

  1. Tasarım Primerler elle veya primer tasarım yazılımı (örneğin Lightscanner Primer Tasarım Yazılımı-Biofire) tarafından. HRMA için PCR ürünleri genellikle 50-200 bp, SNP tespiti için daha küçük PCR ürünleri, tipik haliyle, 50-80 bp olması gerekir.
  2. PCR
    1. 96 kuyucuklu veya 384 oyuklu bir plaka içerisinde PCR reaksiyonu yapın.
    2. 10 ul toplam hacim kullanın: 4 ul LightScanner ana karışımı (0.1 U sıcak başlangıç ​​Taq-polimeraz AB, tampon, 0.2 mM dNTPler, 2 mM magnezyum klorür ve 1x floresan çift bükümlü DNA-bağlama boya); 5 pmol her bir primer, ve yetişkin kuyruk fin ya da embriyonik kuyruk 13 3 ul genomik DNA ekstre 1 ul genomik DNA şablonu.
    3. 30 ul mineral yağ ile kapak örnekleri.
    4. Optik-şeffaf yapışkan conta ile kapak plakası.
    5. PCR çevrim koşulları tipik şartlar 95 ° C'de 5 dakika ve 10 saniye 30 döngü için 95 ° C olan optimize, 60 ° C'de 25 saniye, 72 ° C'de 30 saniye, 30 saniye boyunca 95 ° C ile biten ve soğutuldu 15 ° C.
    6. Mağaza PCR 4 ° C'de plakalar veya HRMA doğrudan devam etmektedir.
    7. PCR'nin ilk duruma getirilmesi sırasında, agaroz jel elektroforez kullanılarak boyutu analizi ile teyit eden PCR ürünü ve PCR ürününün dizilimi yolu ile değerlendirildiler.

3. HRMA

  1. Isı plakaları
    1. Bir eriyik analiz sisteminde plaka koyun.
    2. (LightScanner Yazılım Çağrı-IT 2.0) yazılımını açın.
    3. 60-95 ° C arasında ısı plakaları
    4. Yeni bir veri depolama dosyası oluşturun.
  2. HRMA verileri analiz (Şekil 2).
    Analiz pek çok aşamadan sonra mümkündür. Bu veri m en yaygın olarak kullanılan bir dizi göstermektediranipulations.
    1. Alt Küme ayarı
      Altkümesini sekmesini tıklatın. Örnekleri ile kuyu seçin.
    2. Normalleştirme
      1. Sol paneldeki Normale sekmesini seçin. Floresan varyans ortadan kaldırmak için, elle öncesi (başlangıç) olarak paralel çift çizgi konumlandırmak ve sonrası (son)-eriyik bölgeleri (Şekil 2C, ok uçları) gösterildiği gibi ve 1 ve 0 tüm örneklerin eritmek ve post-eriyik floresan sinyalleri normalleştirmek sırasıyla 14.
      2. Erime bölgesi öncesi ve sonrası eriyik hatları arasındaki bölgede, ama seçilmemiş böylece hatlarının konumlandırma ayarlayın. Genel olarak, Aşağı Min ve Aşağı Max (ve Yukarı Min ve Üst Max) sıcaklık hatları birbirinden yaklaşık 1 ° C konulmalıdır.
      3. Normalleştirilmesi için sıcaklık pozisyonlar seçin tüm örnekler (eritmek bölge ve en az ya da post-eritme bölgesi için bir (% 0) floresan için maksimum veya tam (% 100) sahip olacak şekilde floresan kutuplu olarak en iyi olarakmak). Normalizasyon erime noktası ve 0 en az floresan de erime noktasından daha sonra yakın bir yatay çizgi kadar uzanır 1 en yüksek floresan da yakın bir yatay bir çizgi ile sonuçlanacaktır, 1 üzerinde veya 0 ° C'nin altındaki floresan seviyeleri olmamalıdır . Örneğin, Şekil 2C'de, 79-80 ° C'lik sıcaklık aralıkları kullanılarak önceden eritilmesi eğrileri normalize
    3. Gruplama / Kümelenme
      Erime sıcaklığı (Şekil 2C, yeşil kutu) dayalı genotipleri ayırt. Gruplamasını seçin.
      1. Gruplama bölümünde Standartları seçim listesinden Autogroup seçin.
      2. Gruplama bölümünde Hassasiyet seçim listesinden sırasıyla tek geçişler veya çoklu geçişler ile profiller eritmek için Normal veya Yüksek seçeneğini seçin.
      3. Seç ComputeGruplama bölümünde gruplar.
      4. Dosya menüsüne gidin ve sonuçları kaydetmek için Kaydet'i tıklatın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Protokol (iş akış diyagramı Şekil 1 'de gösterilmiştir), birkaç gün boyunca tek bir gün boyunca gerçekleştirilen ya da kademeleri içinde ayrılabilir. DNA ekstraksiyon PCR amplikonların eriyik ve analiz takip eder. Amplikonun eriyik için sıcaklıklar büyüklüğü ve GC-içeriğine bağlıdır, ancak genellikle başlangıç ​​ve 50 ˚ C ve 95 ° C ˚ uç sıcaklıkları (Şekil 2A ve 2B) uygundur. Eriyik gerçekleştirildiğinde, floresan erime ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

HRMA ile birlikte PCR Zebra balığı genotiplendirebilmek güçlü bir teknolojidir. Bu yaklaşımın avantajı, hız, sağlamlık, ve hatta nokta mutasyonları tespit etmek için hassasiyet vardır. Tüm protokol, fin-klip için eritilerek eğri analizi, tek bir kişi tarafından daha az sekiz saat içinde gerçekleştirilebilir. Buna ek olarak, teknik, yüksek miktarda madde taraması için müsait olan, etidyum bromid kullanımını gerektirmeyen ve kirlenme sorunları en aza indirir ve her PCR analizi adımları i?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Biz tavsiye ve teknik yardım için Blaschke, Grunwald ve Wittwer laboratuarları üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma JLB için PCMC Vakfı, NIH R01 MH092256 ve DP2'deki MH100008 ve Dimes Vakfı araştırma bursu # 1-FY13-425, Mart, tarafından desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
100 Reaction LightScanner Master MixBioFireHRLS-ASY-0002www.biofiredx.com
Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT PlatesBio-Rad LaboratoriesHSP9665www.bio-rad.com
Microseal 'B' Adhesive SealsBio-Rad LaboratoriesMSB1001www.bio-rad.com
96-well LightScanner InstrumentBioFireLSCN-ASY-0040www.biofiredx.com
LightScanner Software with Call-IT 2.0BioFirewww.biofiredx.com
High-resolution Melting Analysis 2.0BioFirewww.biofiredx.com
LightScanner Primer Design SoftwareBioFirewww.biofiredx.com
Vector NTI SoftwareInvitrogenwww.invitrogen.com
Tricaine
Paraformaldehyde

Referanslar

  1. Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  2. Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  3. Sander, J. D., Cade, L., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
  4. Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
  5. Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).
  6. Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), (2012).
  7. Liew, M., Pryor, R., et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).
  8. Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes. Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).
  9. Carrillo, J., Martínez, P., et al. High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita. Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).
  10. Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping. PloS one. 7 (9), (2012).
  11. Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method. J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).
  12. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  13. Xing, L., Hoshijima, K., et al. Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding. PloS one. 7 (8), (2012).
  14. Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns. BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).
  15. Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).
  16. Wittwer, C. T. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen. Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).
  17. Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples. BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).
  18. Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Temel ProtokolSay 84genotiplendirmey ksek z n rl kl erime analizi HRMAPCRzebra balmutasyontransgenler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır