Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım<em&gt; Drosophila</emGen ekspresyon analizi için&gt; Dokular

Özet

Drosophila dokusu sık sık hücre tipleri heterojen bir karışım içerir. Belirli bir doku, spesifik hücre tiplerinde gen ekspresyonunu incelemek için, çekirdekler, genetik olarak etiketlendi ve daha sonra bir afinite dayalı bir yaklaşım kullanılarak izole edilebilir. İzole edilmiş çekirdek bu gen ekspresyon analizi ve kromatin immüno olarak alt uygulamalar için kullanılabilir.

Özet

Drosophila melanogaster embriyonik ve larva dokular genellikle bu dokularda gen ekspresyon analizi karmaşık hücre türleri arasında yüksek ölçüde heterojen bir karışımı içerir. Bu nedenle, Drosophila dokulardan hücreye spesifik gen ekspresyon profillerini analiz etmek için, yüksek saflıkta ve bu transkripsiyon profil ve kromatin immüno olarak alt uygulamalar için yeterli bir verimde özel hücre tiplerini izole etmek için gerekli olabilir. Bununla birlikte, bu dokularda spesifik hücre tipleri nadir nüfusu ile birleştiğinde örneğin merkezi sinir sistemi gibi dokularda düzensiz hücre morfolojisi, ayırma lazer mikro-kesim ve floresans ile aktive edilmiş hücre gibi hücre izolasyonu için geleneksel yöntemlerle (FACS) zorluklar oluşturabilir . Burada, etiketlenmiş çekirdeklerin afinite bazlı izolasyon yerine, tüm hücreleri kullanılarak hücre spesifik gen ekspresyon profillerini karakterize için alternatif bir yaklaşım tarif edilmektedir. Belirli c çekirdeklerilgi ell tür genetik olarak Gal4/UAS ikili sentezleme sistemi kullanılarak bir çekirdek zarı-lokalize EGFP etiket ile etiketlenir. Bu EGFP-etiketli çekirdekleri manyetik boncuklara bağlanmış olan GFP karşı antikorlar kullanılarak izole edilebilir. Bu protokol açıklanan yaklaşım, bu hücre tipleri, toplam hücre popülasyonunun en az% 2 edilmiş olsa dahi, yüksek saflıkta Drosophila larva, merkezi sinir sisteminde ve ekspresyon analizi için yeterli seviyelerde özel hücre tiplerinden çekirdeklerinin tutarlı izolasyonu sağlar doku. Bu yaklaşım, Drosophila embriyonik ve belirli Gal4 sürücüleri kullanarak larva hücre tipleri çok çeşitli çekirdek izole etmek için kullanılabilir, ve FACS veya lazer mikro-kesim için uygun değildir hücre tiplerinden olan çekirdek izole edilmesi için faydalı olabilir.

Giriş

Gibi, merkezi sinir sistemi gibi dokularda Drosophila hücre tipleri karmaşık bir karışımını içerir. Bu nedenle, Drosophila dokulardan hücreye spesifik gen ekspresyon profillerini analiz etmek için, bu alt uygulamaları sağlamak için yeterli miktarlarda spesifik hücrelere homojen bir popülasyonu izole etmek için ilk olarak gereklidir. Dokulara hücreleri izole etmek için yöntemler lazer mikrodiseksiyon ve bütün hücre sınıflandırması (FACS) floresan-aktive edilmiş hücre içerir. FACS ^1-3 gen ekspresyonu ve kromatin için Drosophila embriyolardan ve Caenorhabditis elegans hücreler ve çekirdekler izole etmek için kullanılmış olsa da, FACS ve lazer mikrodiseksiyon yüksek harmanlanmış hücre tipleri ya da içeren hücreler ile birlikte içeren dokularda başarılı bir şekilde gerçekleştirmek zor olabilir nöronlar gibi düzensiz morfolojisi. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, çok hücrelere göre çekirdek, özel hücre tipleri izole edilmiştir ve daha sonra gen için kullanılabilire ekspresyon profili. Önemli olarak, nükleer RNA numuneleri kullanılarak mikro-dizi-bazlı mRNA ifadesi analiz, toplam RNA ^{4, 5} kullanılarak gerçekleştirilmiştir genel olarak benzer sonuçlar göstermektedir. Ayrıca, nükleer RNA kullanılarak gen ekspresyon analizi başarılı bir şekilde C de dahil olmak üzere bir çok mikroorganizma gen ifadesini incelemek için kullanılmıştır elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila ve insanlar ^{4, 5, 2, 3.}

Yakın zamanda çeşitli yaklaşımlar gen ekspresyon analizi ve / veya kromatin immüno için uygun olan Drosophila dokulardan etiketli çekirdeklerinin özel popülasyonlarının izole edilmesi için anlatılmıştır. Immünopresipitasyon (bit çipli) yöntemi için dokuya özel kromatin toplu izolasyonu nükleer lokalize GFP ^2'nin hücre türüne özgü ifade bazında sabit bir çekirdek izole etmek için FACS kullanır. Bu yaklaşım, su olmuşturccessfully Drosophila embriyoların ^2'nin mezodermden izole edilmiş çekirdeklerin Kromatin immüno-çökeltmesi kullanılarak histon modifikasyon ve transkripsiyon faktörlerinin dağılımı analiz etmek için kullanılır. Bununla birlikte, FACS-bazlı yaklaşımlar nedeniyle alt uygulamalar için uygun numaraları elde etmek için gerekli olan yüksek sıralama zaman bir karışık nüfusun sadece küçük bir kısmını oluşturan etiketli çekirdek izole edilmesi için daha az uygun olabilir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, birkaç grup özel bir hücre tipinde belirli bir epitop ile etiketlenir çekirdek saflaştırılması için afinite bazlı izolasyon teknikleri kullandık. Arabidopsis thaliana ^{6, 7} kullanılmak için geliştirilmiş, özel hücre tipleri (bozulmamış) yöntemi etiketli çekirdeklerin son izolasyonu Drosophila ⁸ kullanılmak üzere adapte edilmiştir. Bu yöntemde, in vivo biyotinilasyon için bir substrat olan bir çekirdek zarı füzyon proteini olup coexpresspesifik hücre tiplerinde Escherichia coli biotin ligazı BirA ile sed. Biotin-etiketli çekirdekler ardından streptavidin bazlı afinite izolasyonu kullanarak karışık popülasyonlardan saflaştırılabilir. Bu yaklaşımı kullanarak, çekirdek çekirdek zarı başarılı bir füzyon proteini, bir mezoderm özgü arttırıcı ⁸ kontrolü altında eksprese edildiği, Drosophila embriyoların mezodermden etiketlenmiş ve izole edilmiştir. Yazarlar ayrıca, Gal4 düzenleyici dizi, UAS ⁹ kontrolü altında, herhangi bir hücre tipinde ifade edilebilir çekirdek zarı füzyon proteinlerini oluşturulur. Bu yaklaşım, hızlı bir şekilde karışık nüfusu etiketli çekirdeklerinin alt kümelerini izole edilmesi yeteneğine sahiptir, ama üç farklı transjenik yapıları gerektirir ve bu nedenle de, özellikle genetik uygulamalar için uygun olabilir. Son zamanlarda, bir yaklaşım SUN (S AD1 ve UN C-84), nükleer zarfın iç zarına lokalize etki alanı içeren proteinler ile etiketlendi edildiği tarif edilmiştirfloresan proteinleri ve Gal4/UAS sisteminin ¹⁰ kontrolü altında ifade edilmiştir. Çekirdekler nükleer zarfın dış zar kaldırmak için iyonik olmayan deterjanın varlığında, izole edilir ve anti-GFP antikorları bağlanmış manyetik boncuklar kullanılarak afiniteyle saflaştırıldı. Bu yaklaşım, Drosophila ¹⁰ yetişkin beyin içinde spesifik sinir hücresi alt tiplerinin etiketli çekirdeklerin küçük popülasyonlarının izole edilmesi için kullanılmıştır.

Burada, Drosophila larva dokudan hücrelerin karışık bir nüfusu etiketli çekirdeklerin izolasyonu için bir protokolü tarif edilmektedir. Bu yöntem, bağımsız bir şekilde, geliştirilmiş, ancak Henry vd. ¹⁰ Birinci tarafından açıklanan yaklaşım benzer olan, çekirdek karışık popülasyonlarında etiketli çekirdeklerin daha sonra izole edilmesini kolaylaştırmak için, sadece Drosophila melanogaster, spesifik hücre tiplerinde ifade edilen bir floresan etiket ile etiketlenmiş afinite-temelli bir yaklaşım kullanarak. Çekirdekler etiketlemek için,KASH (K larsicht / A nc-1 / S yne h omology) etki kullanılmıştır. KASH etki perinükleer alanı ¹¹ içinde SUN etki alanı içeren proteinleri ile etkileşim yoluyla kısmen nükleer zarfın dış membran, lokalize bir transmembran etki alanıdır. Bunların N-terminal etki alanları, örneğin sitoplazma içinde ^12-14, aktin ya da mikro tüpler gibi hücre iskeleti proteinleri ile etkileşim sırasında Drosophila Msp-300 ve Klarsicht gibi proteinlerin C-terminal KASH etki, dış nükleer membran proteinleri için, bu tutturur. Konstruktlar hangi Drosophila Msp-300 KASH etki pUAST-attB vektörü ^{15, 16} 'de Gal4 düzenleyici dizi, UAS kontrolü altında, EGFP C-terminine kaynaştırılmıştır üretilmiştir. PhiC31 siteye özgü entegrasyon kullanılarak, transjenik sinekler oluşturulan UAS-EGFP :: Msp-300 ^KASH transgen kromozomu üzerindeki attP2 lokus olarak sokulmuştur hangi3L ^17. UAS-EGFP :: Msp-300 ^KASH uçan, ilgi konusu bir hücre tipinde dış çekirdek zar üzerinde EGFP hedeflenen eksprese edilmesine yol açan, özel bir hücre tipinde ifade Gal4 sürücü sinek ile çaprazlanabilir. Etiketli çekirdekleri daha sonra manyetik boncuklara bağlanmış GFP karşı antikorlar kullanarak karışık hücre popülasyonlarından saflaştırılabilir. Bu yaklaşımda, iyonik olmayan deterjanın kullanımı EGFP etiket dış çekirdek zarının sitoplazmik yanı lokalize olduğu için gerekli olan ve bu nedenle, antikorlar için erişilebilir değildir.

Aşağıda tarif edilen protokol saflık ve izole edilmiş verimi çekirdeklerin ölçmek için, Drosophila larva dokularda spesifik hücre tiplerinden EGFP etiketli çekirdek zenginleştirmek / izole etmek ve (kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu için uygun nükleer RNA çıkarmak için kullanılabilir qRT -PCR) gen ekspresyon analizi. Çekirdeklerin izolasyonu ve afiniteyle saflaştırma (tissu hariçdiseksiyon e) en az bir saat içinde gerçekleştirilebilir. Sonuçlar glial çekirdekleri başarıyla larva optik lob ve göz hayali diskten izole edilir ve daha sonra gen ekspresyon analizi için kullanılabileceğini gösteren sunulmaktadır. Bu yaklaşım, hedef hücreler, genel nüfusun% 5'ten az teşkil eden embriyonik ve larva dokularından etiketli çekirdeklerin izolasyon / zenginleştirilmesi için yararlı olacağı tahmin edilmektedir. Bu çalışmada oluşturulan tüm Drosophila hisse senetleri ve plazmalar istek üzerine yazarlarda mevcuttur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1.. EGFP üretimi ve karakterizasyonu :: KASH Drosophila

1. Çapraz Gal4 sürücü Msp-300 ^KASH uçar UAS-EGFP'nin :: uçar. Alternatif olarak, sürücü ve Gal4 UAS-EGFP :: Msp-300 ^KASH transgeni taşıyan yeniden birleştirici hem de sinekler standart genetik teknikleri kullanılarak oluşturulabilir. Döl sayıda gerekmektedir, bu ikinci bir yaklaşım, avantajlıdır.
2. Standart mikroskopi teknikleri kullanarak EGFP :: KASH işaretleyicinin ekspresyonunu karakterize eder. Not: EGFP ekspresyonu ya da bütün larvaları, kesilmiş, sabitlenmiş Drosophila dokularda standart mikroskopi teknikleri ile gözlenebilir, ve bir antikorun kullanımını gerektirmez.
   1. EGFP ifade modelini belirleyecektir :: flöresanlı bir diseksiyon mikroskobu altında tüm organizma içinde KASH işaretleyici (Malzemeler PDF bakınız). Not: Şekil 1 'de gösterilen Repo-GAL4 sürücü, sergi n sürücüleri dahil olmak üzere birçok Gal4,Ancak tükürük bezi gibi diğer larva dokularda ifade onspecific kalıpları (Sonuçlar bakınız).
   2. Konfokal mikroskopi kullanılarak ilgilenilen kesilir dokusundaki EGFP :: KASH ekspresyon modelini analiz edin.
      1. EGFP lokalizasyonunu :: DNA'ya KASH etiket göreli görselleştirmek için 0.1 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda DAPI kullanılarak, nihai konsantrasyonu% 4 ve leke DNA de formaldehit kullanılarak, ilgi konusu doku tespit edin.
      2. Ilgi dokusunun büyüklüğüne bağlı 40X / 1.30 immersiyon yağı hedefi veya 20X / 0.75 immersiyon yağı hedefi, kullanarak görüntü kazanır. Aşağıdaki uyarım / emisyon şartlar görüntü elde etmek için kullanılabilir: 408 nm nm/425-475 (DAPI), 488 nm / 525-550 nm (GFP).

2. Drosophila Larvaların Dokular Çekirdeği izole

1. Larva doku diseksiyonu ve sonraki çekirdekler izolasyon ekipmanları hazırlayın. NotBütün dechorionated embriyoları, aynı zamanda eğer istenirse başlangıç ​​maddesi olarak kullanılabilir. Bu ilgi, hücre tipi, hayali disk gibi belirli bir dokuda mevcut ise yerine tüm larvalara göre kısmen kesilmiş, larva dokularından kullanılması önerilir. Bu spesifik olmayan bağlanma azaltır, ve aynı zamanda hedef olmayan hücrelerde bir Gal4 sürücüsü ifade neden olabilir sorunları ortadan kaldırır.
   1. (Malzeme PDF görmek) keskin forseps iki çift hazırlayın, bir silikonlu 9-sıra cam plaka (Malzeme PDF görmek) ve PBT (1x PBS, pH 7.4;% 0.1 Tween-20).
   2. Manyetik boncuk GFP antikor Prebind. Bu adım diseksiyonu başlamadan önce başlanmalıdır. Yıkama tamponunun 400 ul (Malzemeler PDF bakınız, Roche) manyetik boncuk 10 ul (Invitrogen, malzemeler PDF) ve GFP antikor 2 ug ekle (1 x PBS, pH 7.4, 2.5 mM _MgCI2) 1.5 ml bir tüp içinde . Gerektiğinde kullanılan boncuk ve antikor miktarı, sam hedefin miktarına göre optimize edilebilirple ve tanelere antikorun bağlanma afinitesi.
   3. , Oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca rotasyon ile boncuk ve antikorun inkübe edin.
   4. Manyetik rafa boncuklar ve antikor ihtiva eden 1.5 ml bir tüp (Malzeme PDF bakınız) yerleştirin ve boncuklar yaklaşık 1-2 dakika boyunca, manyetik bağlamaya olanak sağlar. Ilişkisiz antikor içeren süpernatantı ve 1 ml pipet kullanarak yıkama tamponu. Boncuklar mıknatıs bitişik tarafında 1.5 ml tüpün duvarına bağlı kalacaktır.
   5. Bölüm 2.1.4 'de tarif edildiği gibi her yıkama tampon içinde, 1 ml ile iki kez boncuk durulayın. Manyetik raftan 1.5 ml tüp çıkarın ve boncuk karıştırın ve her yıkama adımında yıkama tamponu kısaca ters.
   6. Adım 2.7 ile devam etmek için hazır olana kadar yıkama tamponu içinde antikor-bağlı boncuk saklayın. Boncuklar protokol herhangi bir aşamasında kurumasına izin verilmemelidir.
2. PBT, larva dokularından inceleyin ve etmek için parçalandı dokular aktarmak9-iyi bir yemeğin biri iyi. Tipik haliyle, 100, üçüncü instar larvaları arasındaki optik lob ve göz hayali diskin diseksiyon çekirdekleri ayrılmasından sonra, aşağı doğru gen ekspresyon analizi için yeterli malzeme sağlar.
3. Nükleer ekstre tamponu içinde izole edilmiş doku durulayın (10 mM HEPES-KOH, pH 7.5; 2.5 mM _MgCI2, 10 mM KCI), 1.5 ml bir tüp içinde. Taze nükleer ekstre tamponu içeren 1 ml buz üzerinde (Malzemeler PDF bakınız), 1 ml Dounce homojenizatörü içine izole edilmiş larva dokuları aktarın. 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bu RNA izolasyonu çekirdekleri aşağıdaki ekstre edilecek ise, proteaz inhibitörlerinin eklemek gerekli değildir.
4. Gevşek havan tokmağı ile 20 darbeleri doku bozabilir ve daha sonra hücreler, şişmeye imkan vermek için 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe örnek. Sıkı havan tokmağı ile 15 vuruş kullanılarak hücrelerden çekirdek ekstrakte edin. Gevşek ve sıkı bir havan elleri ile dokunuşların sayısı farklı dokular ve hücre tipleri için optimize edilmesi gerekmektedir, aşırı homojen hale getirme neden olabiliryetersiz homojenleştirme dokudan tüm çekirdeklerin ayıklamak olmaz ise, çekirdek makaslanmış.
5. Nükleer homojenizasyon tampon maddesi ile prerinsed edilmiş bir 40 mikron gözenek boyutlu süzgeç (Malzemeler PDF bakınız) sayesinde, hücreler ve hücre artıklarının içeren Homojenat, filtre. Yeni bir tüp içinde, süzüldü Homojenat toplayın.
6. Çekirdekler verim, çekirdekleri bütünlüğünü belirlemek için, ve izolasyon çekirdeklerin önce hedef genlerin transkript seviyelerini belirlemek için bir sonraki analiz için ön izolasyon örnekleri toplayın.
   1. Bir pipet kullanarak yeni bir 1.5 ml tüp aktarın süzüldü homojenat 50 ul. Bu, ön yalıtım örneğidir. Trizol tepkin 500 ul ekleyin sonradan RNA izolasyonu (adım 3.1) -20 ° C'de, karıştırmak için invert ve mağaza (Malzeme PDF, DİKKAT bakınız).
   2. Yeni bir 1.5 ml tüp aktarın süzüldü homojenat 20 ul.
      1. 0.1 ug / ml 'lik bir son konsantrasyona DAPI ekleyin ve inc10 dakika boyunca buz üzerinde Ubate örneği.
      2. Bir poli-lisin kaplı lamel DAPI ile boyanmış çekirdek transferi ve bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Net oje kullanarak lamel kapatılmalıdır.
      3. Çekirdekler bütünlük ve floresan mikroskop kullanılarak ilgi GFP-etiketli çekirdeklerin varlığı kontrol edin. Not: Bu, çekirdekleri gidermek için, veya bunların slaytlar (24 saat içinde) hazırlanması Aşağıdaki oldukça hızlı bir şekilde analiz edilir ise GFP için leke için gerekli değildir.
   3. Yeni bir 1.5 ml tüp aktarın süzüldü homojenat 10 ul yıkama tamponu ve 90 ul (1 x PBS, pH 7.4, 2.5 mM _MgCI2) ekleyin. 0.1 ug / ml 'lik bir son konsantrasyona DAPI ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. 10X hava objektif altında Epifloresans kullanarak DAPI-pozitif çekirdeklerin saymak Hemasitometre kullanarak ön-izolasyon numunesinde çekirdekleri verimi belirlemek.
7. Manyetik bir rafa (bölüm 2.1.6 hazırlandı) antikor-bağlı boncuklar ihtiva eden 1.5 ml tüp yerleştirinve bölüm 2.1.4 'de tarif edildiği gibi, manyetik boncuklar, en az 2 dakika boyunca mıknatısın bağlamak için izin verir. 1 ml pipet kullanarak antikora bağlı boncuklardan yıkama tamponunu çıkarın ve 1 ml bir pipet kullanılarak 1.5 ml tüp aşama 2.5 'ten süzüldü Homojenat ekleyin.
8. Hafifçe karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin ve uçtan uca fazla çalkalama ile 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Mümkünse, bu çekirdeklerin topaklanma neden olabilir bu yana tüp içinde kabarcıklar kaçının.
9. Manyetik bir rafa antikor-bağlı boncuklar ve Homojenat ihtiva eden 1.5 ml tüp yerleştirin ve bölüm 2.1.4 'de tarif edildiği gibi, manyetik boncuklar, en az 2 dakika boyunca mıknatısın bağlamak için izin verir. 1 ml pipet kullanarak, bağlanmamış çekirdekleri fraksiyonu içeren Homojenat çıkarın.
10. Yıkama 3x 1 ml her tampon örnek yıkayın. Tarif edildiği gibi boncuklar, bağlı çekirdek içeren 1.5 ml tüp çıkarın ve raftan yıkama tamponu ile pek çok kez çevrilerek karıştırılmıştır, daha sonra manyetik rafa tüp yerleştirmekadımda 2.9 ve 1 ml pipet kullanarak süpernatant kaldırmak.
11. Hedef çekirdeklerine bağlı olması boncuklar, yıkama tampon 150 ul ekle. Bu post-izolasyon örneğidir. Mikroskopi analizi ve sonraki RNA ekstraksiyonu için numune hazırlayın.
    1. Yeni bir 1.5 ml tüp ve DAPI ile leke transfer sonrası izolasyon örnek 20 ul ve bölüm 2.6.2 tarif edildiği gibi analiz edin. GFP + / + ve DAPI GFP-/DAPI + sonrası izolasyon numunedeki zenginleştirilmiş GFP + çekirdeklerin saflığını belirlemek için manyetik boncuk tarafından yakalanan çekirdek sayısı.
    2. , Post-izolasyon numunenin geri kalanına Trizol reaktifi 1 ml ilave edilir karıştırmak için ters ve saklamak daha sonra RNA izolasyonu (adım 3.1) -20 ° C 'de. Not: Trizol numuneler gerektiğinde -20 ° C'de birkaç hafta saklanabilir Bu, Trizol reaktif maddesi kullanılarak önce RNA ekstre manyetik boncuk çekirdek elüt edilmesi için gerekli değildir because Boncuklar daha sonra RNA izolasyonu karışmaz.

3. Larva Dokular İzole Çekirdeğin içinde Transkript Düzeyleri belirleyin

1. Aşağıdaki modifikasyonlarla (Malzemeler PDF bakınız) Trizol tabanlı RNA ekstraksiyonu için tarif edilen standart protokol kullanılarak bölümleri 2.6.1 ve 2.11.2 'de hazırlanan ön izolasyon ve sonrası izolasyon RNA örneklerinden izole:
   1. RNA pelet ile presipitasyondan sonra, pelet RNase-içermeyen su içinde 19.2 ul ve RNASecure tepkin 0.8 ul (bkz. Malzeme PDF) ekleyin ve RNaz'larına inaktive etmek için 20 dakika boyunca 60 ° C'de inkübe edin.
2. Üreticinin protokolü takip QubitR 2.0 florometre kullanılarak bu tür Qubit RNA deney kiti gibi bir floresan-RNA bağlayıcı boya (Malzemeler PDF bakınız) RNA konsantrasyonunun belirlenmesi.
3. Örneğin EpiScr gibi bir ters transkriptaz kullanılarak amplifiye cDNA sentezlemeipt üreticinin talimatlarına Transcriptase kiti ve oligodT Ters primerleri. Not: Genellikle, RNA 50-100 ng birden fazla gen ekspresyonu analiz gerçekleştirmek için yeterli cDNA oluşturur. Önceden izolasyonu ve post-RNA izolasyon eşdeğer miktarları cDNA oluşturmak için kullanılmalıdır.
4. Bu 10-kat önce, gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) analizi seyreltilmesi için 20 ul cDNA numunesine nükleaz içermeyen su içinde 180 ul ekleyin. Sulandırılmamış cDNA örnekleri qPCR inhibe çünkü bu seyreltme, önemli bir adımdır.
5. Polimeraz ve dNTP, 4 pmol ileri her biri ile bir QPCR ana karışım hazırlanarak, ters primer, 20 ul nihai reaksiyon hacmi için steril su ile oluşur.
   1. Ilgilenilen bir hücre tipinde eksprese beklenmektedir genleri hedef ve doku toplanmış edildiği gelişim aşamasında QPCR için primerler dizayn. Bir intron span astar tasarımı mümkünse, o kadar genomik vecDNA PCR ürünleri ayırt edilebilir. Not: Hedef hücre tipinin gen ekspresyon profili bilinmiyorsa, etiketli çekirdekler popülasyonunda spesifik olarak ifade edilmelidir eGFP karşı primerler, belirli bir hücre tipi ve dokusunda (Tablo 1) için protokol optimize etmek için kullanılabilir.
6. Bütün dokusundan hazırlanan cDNA'dan bir seyreltme serisi ile karşılaştırma ile ön izolasyon ve sonrası izolasyon örneklerde, ilgi konusu her genin nispi transkript seviyelerini belirlemek. Hedef genlerin transkript seviyeleri, Rpl32 (ya da tercihen çok sayıda referans genler) gibi bir referans genine normalize edilmesi gerekmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Repo-GAL4 sürücü (Bloomington stok no 7415) özel olarak bir gelişme ¹⁸ çeşitli aşamalarında Drosophila sinir sistemindeki glial hücrelerde ifade edilir. Sinekler stabil standart genetik teknikler kullanılarak repo-GAL4 sürücünün kontrolü altında UAS-EGFP :: Msp-300 ^KASH ifade eden üretildi. EGFP ifade deseni :: KASH transgen Bu sinekler karakterize etmek için, üçüncü instar larvaları arasındaki kesilerek optik lob ve göz hayali disk GFP ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol, Drosophila embriyonik ya da larva dokularda karma hücre popülasyonlarından, özellikle etiketli ya da yüksek ölçüde çekirdek izole zenginleştirmek için kullanılabilir. Bu protokolü kullanarak, çekirdekler, yaklaşık 1 saat içinde kesilmiş dokularından izole edilebilir. İzole edilmiş çekirdeklerin saflığı ve verimi deneysel her hücre tipi için belirlenmelidir. Çünkü numunede mevcut boncukların hemasitometre kullanarak protokol sonrası izolasyon aşamasında boncuk-bağl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)	Developmental Studies Hybridoma Bank	mAB24B10
Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)	Roche	11814460001	This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.
2x Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX	MidSci	BEQPCR-R
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)	Biotium	40011
Dounce Homogenizer (1 ml)	VWR	62400-595
Dumont #5 Tweezers, 11 cm	World Precision Instruments	14095
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation	Invitrogen	10003D	This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.
EpiScript Reverse Transcriptase	Epicentre	ERT12910K	http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf
Falcon cell strainers, 40 μm pore size	VWR	21008-949	Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.
Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)	Millipore	LSKMAGS08
Mini tube rotator	Genemate	H-6700
Qubit starter kit	Life Technologies	Q32871	Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ
RNAsecure (Ambion)	Life Technologies	AM7010	The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.
RT-PCR machine Thermal Cycler	BioRad	CFX Connect Thermal Cycler
Siliconized 9-well glass plate	Hampton Research	HR3-134
Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440-460 nm) excitation + yellow barrier	Nightsea		This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)
StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand	Nikon	SMZ 745
Thermal Cycler	BioRad	T100
Trizol reagent	Life Technologies	15596018	CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf
Tween 20	Amresco	0777-1L