Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

Özet

Ribozomlar protein sentezinde önemli bir rol oynamaktadır. Sükroz yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile Polyribosome (Polizom) fraksiyonlara ayırma, bir genom geniş bir ölçekte tek mRNA translasyon etkinliklerine doğrudan belirlenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem, şaperonlar ve sinyal molekülleri gibi ribozom-ve Polizomdan ilişkili faktörleri biyokimyasal analizi için kullanılabilir.

Özet

mRNA çevirisi gen ekspresyonunun düzenlenmesinde merkezi bir rol oynar ve memeli hücrelerinde en az enerji tüketen işlemi temsil eder. Bu duruma göre, mRNA çevirisi düzensizliği kanser dahil olmak üzere patolojik durumların bir çok önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Ribozomlar da böylece fonksiyonu ve yeni sentezlenmiş polipeptid istikrarı modüle, doğmakta olan polipeptidlerin katlanmasını kolaylaştırmak kaperonlar, ev sahibi. Ek olarak, ortaya çıkan veriler ribozom sinyal bunlar ribozom ortaya olarak yeni sentezlenmiş polipeptitlerin translasyon sonrası modifikasyonların çeşitli karıştığı molekülleri, ve / veya translasyonel makine bileşenlerinin bir repertuar için bir platform olarak hizmet göstermektedir. Burada, sükroz yoğunluk gradyan santrifüjlemesi kullanılarak ribozom damıtımı köklü bir yöntem tarif edilmektedir. In-house geliştirilen "ANOTA" algoritması ile birlikte bu yöntem sağlar diffe doğrudan tayinininbir genom ölçekte bireysel mRNA'lanmn rential çeviri. Ayrıca bu çok yönlü protokol yeni sentezlenmiş polipeptidlerinin katlama ve bozulma merkezi bir rol oynadığını, bu dahil olmak üzere, ribozom-ilişkili protein kompleksleri, işlevini incelemek amacıyla biyokimyasal çalışmalar çeşitli için kullanılabilir.

Giriş

Gen ekspresyonunu kontrol eden düzenleyici ağlar yaygın son iki yıl içinde incelenmiştir. Bir genom ölçekte sabit durum mRNA düzeylerindeki değişiklikler sözde "gen ekspresyon" profillerini belirlemek için kullanılan sayede transkripsiyonel regülasyonu, odaklanmış bu araştırma çabalarının büyük çoğunluğu. Son çalışmalar, sabit durum mRNA seviyeleri sadece gevşek bir şekilde ve böylece mRNA çevirisi de dahil olmak üzere transkripsiyon sonrası mekanizmaları, gen ifadesinin ^3,4 düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığını gösteren, proteomun ^1,2 bileşimine uygun olduğu ortaya çıkmaktadır. Gerçekten de, ~ protein seviyelerinin% 50 ölümsüzleştirilmemiş fare fibroblastlarında ⁵ mRNA çeviri seviyesinde belirlenir olduğu tahmin edilmiştir.

mRNA çeviri mRNA'ları düzenledi ribozomlar, transfer RNA'lar (tRNA'lar) eylem ve aksesuar faktörler işbirliği yoluyla proteinlere çevrilir sırasında oldukça düzenli bir süreçtirmmonly için faktörler (TF) ⁶ olarak adlandırılır. Protein sentezi memeli hücrelerinde ⁷ en fazla enerji tüketen bir süreçtir ve bu nedenle küresel mRNA kurları besin durumunu ve hücre çoğalma oranları ⁸ barındıracak şekilde ayarlanır. Global mRNA çevirisi oranları, çeşitli hücre dışı uyarımlar (örneğin, hormonlar ve büyüme faktörleri), hücre içi olaylara (örn., amino asit seviyeleri) ve stres farklı türde (örneğin, ER-stres) olan mRNA'ların havuzlarında seçici değişikliklere neden değişikliklere ek olarak (translatome) ⁶ tercüme ediliyor. Uyarıcı tipi, bir çeviri aktivitesi değil, tüm mRNA ve böylece önemli ölçüde hızlı bir hücre tepkisini ⁶ monte etmek için gerekli olan proteomun değişikliklere neden etkilenir bağlı olarak değişir. Translatome bu nitel ve nicel değişiklikleri trans-etkili faktörler arasındaki etkileşimi (aracılık düşünülmektedir örneğin öteleme makine, yardımcı faktörler ya miRNAs) ve mRNAlarının ^6,9 seçilmiş alt kümelerinde bulunan sis-elemanlarının (RNA unsur veya özellik) bileşenleri. Örneğin, seviyeleri ve / veya hız sınırlayıcı bir çeviri başlatma aktivitesindeki değişiklikler eIF4E elF2 ve seçici olarak spesifik özellikleri ⁶ 5 'UTR göre transkriptlerinin çevrilmesini modüle eden faktörler. eIF4E ve elF2 sırasıyla ^6, ribozoma mRNA ve başlatıcı tRNA alımı için gereklidir. EIF4E aktivitesinde bir artış, seçici bir siklinlerin, c-myc ve Bcl-xL ¹⁰ dahil olmak üzere, proteinleri uyararak kodlayanlar proliferasyonu ve hayatta kalma dahil olmak üzere uzun ve yüksek yapılı 5'UTRs barındıran mRNA translasyonunu güçlendirir. Buna karşılık, elF2 inaktivasyonu seçici bir şekilde olanlar gibi bir kodlama ana t olarak 5'UTRs kısa önleyici baş taraftaki açık okuma çerçevelerini (uORFs) ihtiva eden mRNA translasyonunu ayarlar iken, genel bir protein sentezi kapatılmasına yol açarAçılmış protein tepki (örneğin ATF4) arasında ranscriptional regülatörleri. Besin maddeleri, büyüme faktörleri ve hormonları, rapamisin mekanistik / hedef memeli MAPK yolağı, doğrudan fosforile eder, oysa (mTOR) yolunun, 4E bağlayıcı proteini için bastırıcılarının (4E-BP) ailesi tarafından inaktive eIF4E aktivitesini uyaran dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara karşı yanıt olarak ^6,11 eIF4E. Buna karşılık, eIF2α kinazlar (örneğin dikmek PKR, HRI ve GCN2) besin yoksunluğu, ER-stres ve virüs enfeksiyonu ^6,12 tepki olarak eIF2α düzenleyici alt birimi tarafından fosforile elF2 inhibe eder. TF'lerin aktivitesi ve / veya ifade değişiklikler, translasyon makine ve miRNAs dahil olmak üzere düzenleyici faktör diğer bileşenleri, kanser, metabolik sendromlar, nörolojik ve psikiyatrik bozukluklar, böbrek ve kalp-damar hastalıkları ^13-19 dahil olmak üzere çeşitli patolojik durumlarda gözlenmiştir. Topluca, bu veriler beni Ötelenmeli göstermektedirchanisms hücre vücut dengesinin sürdürülmesinde ve bunların kaldırılması çeşitli insan hastalıklarının etiyolojisinde rol oynadığı çok önemli bir rol oynamaktadır.

Burada, monosomes, ribozomal alt birimlere ve haberci ribonükleoprotein parçacıklar (mRNPs) için polizom ayırmak için kullanılan memeli hücrelerinde sükroz yoğunluk gradyan santrifüj ile polizom paya ayırma için bir protokolü tarif edilmektedir. Bu kötü tercüme (ışık polisomlar ile ilişkili) mRNA'lardan (ağır polisomlar ile ilişkili) verimli şekilde çevrilmiş arasında ayrımcılık sağlayan. Bu deneyde, örneğin ribozom sikloheksimid ²⁰ ve sitosolik özütler ultra-santrifüj ile% 5-50 doğrusal sakroz yoğunluk gradyanları üzerinde ayrılmıştır gibidir için uzama inhibitörleri kullanılarak, mRNA üzerinde immobilize edilir. Sukroz meyilleri daha sonraki ayırma bunlar bağlanan ribozom sayısına göre mRNA izolasyonunu sağlar. Her bir fraksiyondan ekstre RNA daha sonra belirlemek için kullanılabilirfarklı durumlar arasında degrade boyunca mRNA'lann dağılımları değişiklikler, bu sayede degrade alt üst öteleme verimi artar. Northern Blot veya kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) her fraksiyonda mRNA seviyesini tespit etmek için kullanılır.

Seçenek olarak ise, ağır polisomlann (tipik olarak en fazla 3 ribozomlar) ihtiva eden fraksiyonlar bir araya getirilmiş ve genom Polizomdan ilişkili mRNA düzeyleri mikro-dizisinin veya derin-dizilemesi kullanılarak belirlenir. Bu Polizomdan ilişkili mRNA seviyeleri sitosolik mRNA seviyeleri ²¹ etkileyen transkripsiyonel ve transkripsiyon sonrası mekanizmaları tarafından etkilenen, çeviri ek olarak olduğunu vurgulamak için büyük önem taşımaktadır. Bu nedenle, Polizomdan ilişkili mRNA'dan genom verileri kullanılarak çeviri farklılıkları belirlemek it transla üst akışında olan gen sentezleme yolundaki adımlardan etkilerinin düzeltilmesi için gerekli olantion ^21. Böyle bir düzeltme sağlamak için, sitozolik RNA ^21, belirlenen her bir numuneden Polizomdan bağlantılı RNA ve genom sabit durum mRNA seviyeleri ile paralel olarak hazırlanır. Şu anda, "çeviri verimliliği" (TE) değerleri olarak adlandırılan (Polizomdan ilişkili mRNA verileri ve sitosolik mRNA verileri arasındaki log oranı ie) genellikle bir çeviri verimliliği sitosolik mRNA düzeylerindeki değişimlerin etkilerini gidermek için kullanılmaktadır mRNA ²² Verilen. Bununla birlikte, ayırıcı çeviri tespit etmek TE puanları kullanarak nedeniyle genel olarak yapay bir korelasyon ²⁷ de ifade TE puan matematiksel bir özelliğine yanlış pozitif ve negatif bulgular önemli numaraları ile ilişkilidir. Nitekim birden laboratuarlarında veri setleri bir anket gibi sahte korelasyon translatomes ²³ değişiklikleri analiz zaman kaçınılmaz gibi görünüyor belirtti. Bu diferansiyel tr "analizi geliştirilmesini teşvik anılan eksikliklerin ²³ muzdarip değil anslation "(ANOTA) algoritması. ANOTA-analiz sırasında bir regresyon modeli sitosolik RNA seviyeleri bağımsız translasyon etkinliğinin önlemler elde etmek için kullanılır. Bu tür önlemler, daha sonra koşullar ve istatistik hesaplanır arasında karşılaştırılmıştır. Kullanıcı istatistiksel gücünü artırır ve birkaç çoğaltır ²⁴ ile yapılan çalışmalarda yanlış pozitif bulgular oluşumunu azaltan bir varyans çekme yöntemi, uygulama seçeneği vardır. Önemli ölçüde, son zamanlarda translatome içinde tedirginlikler ANOTA tarafından yakalandı gösterdi, ama TE değil puanları, proteomun ²⁵ değişiklikler ile ilişkilidir. Bu nedenle, son derece bir genom ölçekte çeviri değişikliklerin belirlenmesi için ANOTA analizi uygulanması tavsiye edilir. ANOTA algoritmasının teorik temeller önce ^21,23,26 ayrıntılı olarak ele iken, burada odak pratikte bunu uygulamak nasıl olduğunu.

hücrede mRNA için aktivitesinde değişiklikler okuyan ek olarak ve_content ">, bu ribozom ayırma protokol izole edilmesi ve biyokimyasal olarak ve fonksiyonel olarak ribozom ve Polizomdan ilişkili protein kompleksleri karakterize etmek için kullanılabilir. bu yaklaşımın başarılı bir şekilde tanımlamak için geçmişte dağıtıldıktan Yeni sentezlenmiş polipeptidler ²⁷ ve / veya translasyonel makine bileşenlerinin fosforilasyonu katılan stabilitesini düzenleyen kompleksleri. polisom ayırma yönteminin bu uygulama aynı zamanda kısaca ele alınacaktır.

Protokol

1.. Sükroz Gradyan hazırlanması

1. % 60, 100 ml GKD ₂ O. (w / v) sakaroz çözeltisi hazırlayın Çözüm fraksiyonasyon aşama (aşama 3,5) sırasında boru tıkanmasını önlemek için 0.22 um'lik bir filtreden filtre edilmelidir.
2. 200 mM HEPES (pH 7.6), 1 M KCI, 50 mM _MgCI2, 100 ug / ml sikloheksimidin, 1x proteaz inhibitör kokteyli (EDTA-serbest), 100 birim / ml RNase inhibitör: 10x sukroz gradyanlı tampon 5 ml hazırlayın.
3. Adım 1.1 'de tarif edildiği gibi hazırlanan% 60 çözeltisi kullanılarak, 40% 5 ml ve 1 x sukroz gradyanlı tamponu içinde% 50 sükroz cevap verir.
4. (Toplam 6 ultrasantrifügasyon tüpler) katman için her polyallomer ultrasantrifügasyon tüp üzerinde yarım-tam noktasını işaretlemek için degrade makinesi ile sağlanan Marker bloğunu kullanın. Bu yarım-tam noktaya ulaşıncaya kadar degrade makinesi ile sağlanan katman cihazı kullanılarak,% 5 sakkaroz çözüm ekleyin. Daha sonra, Engellere kadar altından% 50 sukroz çözeltisi eklemeiki çözelti arasındaki ace yarı-tam noktaya ulaşır. Bu (aşağıya bakınız), yüksek tekrarlanabilirliği elde etmek için gerekli olduğu gibi bileşenler, mümkün olduğu kadar benzer, böylece özel bir dikkat Bu aşama sırasında alınmalıdır.
5. Degrade makinesi ile sağlanan oranı zonlu kapakları tüpleri Mühür ve degrade makinesi üzerinde tüp tutucuya mühürlü tüpler aktarın.
6. Doğrusal bir% 5% 50 degrade elde etmek degrade makinesi çalıştırın. 6 doğrusal geçişlerini yüksek eğim açısında dönme tarafından birkaç dakika içinde oluşturulacaktır.
   Not: Sakaroz gradyanlar 6 ay için derhal kullanılır yada -80 ° C'de saklanabilir.

2.. İzolasyon ve polizom Sedimantasyon

1. Hücre tipine bağlı olarak, 1-5 15-cm Petri kutularına (~ 15 x 10 ⁶ hücre) liziz önce en az bir gün, hücrelerin tohum. Deneylerin günde hücreler,% 80 konfluent olmalıdır. Not: çeviri ve çoğalma hızları doğrudan çünkü Optimal konfluensisinin kritik⁸ orantılı ve bu nedenle polisomlann aktif çoğalan hücrelerinde analiz edilmelidir (hücrelerin düşük konfluensisinin daha fazla analiz için yeterli malzeme sağlar olmayabilir oysa yani kurları önemli ölçüde birleşen hücreleri üzerinde düşecektir). Örneğin deneyci çeviri üzerinde temas inhibisyonu etkisi okuyan ilgilenen varsa, bu kuralın istisnaları yapılabilir. Bununla birlikte, bu hücreler, translatome üzerinde istenmeyen etkilere sahip olabilir, çok uzun süre boyunca konfluent koşullarda altında tutulması gerekir.
   Transfeksiyon gerekli ise, ticari olarak temin edilebilir kitlerin çoğunun Polizom seviyelerini etkilemez. Transfeksiyon hücrelerin günde% 80-90 ortak akışlı olması gerekir, çünkü bu ~% 80 konfluent hücreler 24 saat post-transfeksiyon yaymak ve hücreleri polizom 48 saat post-transfeksiyon izole edilmesi tavsiye edilir.
2. 5 37 ° C'de ve 5 dakika için büyüme ortamı içinde 100 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda sikloheksimid hücreleri inkübeCO% _2; ve 100 ug / ml sikloheksimidin içeren buz gibi soğuk 1 x 10 ml PBS ile iki kez yıkama hücreleri. Sikloheksimid böylece ribozom çalıştırmak ²⁰ kapalı önlenmesi, mRNA üzerinde ribozomlar "donuyor" bir çeviri uzama inhibitörüdür.
3. 100 ug / ml sikloheksimidin içeren buz gibi soğuk 1 x PBS, 5 ml, yavaşça hücreler kazıma ve 50 ml'lik bir tüp içinde toplamak. Bu adım, oldukça hızlı zaman uzun bir süre için buz üzerinde hücreleri terk ederken büyük ölçüde polisom hazırlık kalitesini düşürecek yapılır önemlidir.
4. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile hücreler toplayın
5. Hipotonik tampon maddesi içinde 425 ul süpernatan ve tekrar süspansiyon hücreleri imha [(5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2.5 mM _MgCl2, 1.5 mM KCI ve 1x proteaz inhibitör kokteyli (EDTA-içermeyen)], 10 mg 5 ul ekle / CHX mi, 1 M DTT, 1 ul,% 10 Trito 25 ul ilave edildi ve ardından 5 saniye boyunca RNAse inhibitör ve vorteks 100 unitsn X-100 (nihai konsantrasyon% 0.5) ve% 10 sodyum deoksikolat 25 ul (nihai konsantrasyon% 0.5) ve 5 saniye boyunca girdap. Hafif bir deterjan koşullar nükleer zarfı bozmadan sitosolik ve endoplazmik retikulum ilişkili ribozomlar çözündürülmesi için kullanılır ise nedeniyle hücre şişmesi, hipotonik tampon maddesi, plazma membranı bozacak.
6. 7, 4 ° C'de dakikada ve yeni önceden soğutulmuş 1,5 ml tüp transfer yüzer (~ 500 | il) için 16,000 x g'de santrifüjleyin lizatları. Bir spektrofotometre kullanılarak, her numune için 260 nm'de OD'yi ölçün ve sitosolik sabit durum mRNA düzeylerini belirlemek için kullanılacak girdi olarak lizat% 10 tutun. , RNAse serbest _H2O içinde 750 ul için giriş seyreltin Trizol 750 ul ve sıvı azot içinde hızlı dondurma ekleyin.
7. Önceden soğutulmuş rotor kova sakaroz geçişlerini içeren ultrasantrifüjdeki tüpleri aktarın. Sakaroz gradyanları üstünden 500 ul çıkarın. Aynı OD (10-2 içerir, böylece lizatları ayarlayınLiziz tamponu içinde 500 ul, 260 nm'de OD 0) (adım 2.5 de tarif edilmiştir) ve her bir sükroz gradyanı üzerine yerleştirin.
   Not: Bu eleştirel Polizom hazırlıkları kalitesini artıracak gibi, hemen Yokuşta lizatlarını yüklemek önemlidir.
8. Tartılır ve ultra-santrifüj önce her bir derece dengesi.
9. SW41Ti bir rotor kullanılarak 4 ° C'de 2 saat boyunca 222,228 x g'de (36.000 rpm) santrifüjleyin.
   Not: sakaroz geçişlerini bozacak etmemek için, "düşük" fren seçeneği seçili olmalıdır.

3.. Polizom Fraksiyonu ve RNA Ekstraksiyon

1. RNaz ZAP (birkaç spreyler) içeren ılık RNAse ücretsiz su ile temizleyerek kısım toplayıcısı hazırlayın. Sadece sıcak RNAse ücretsiz su ile bu adımı tekrarlayın. UV lamba anahtarı ve yeşil ışık görünmesi için bekleyiniz.
2. Dikkatle rotor tüpleri çıkarın ve buz koyun. Bilgisayar, pompa, UV dedektör ve fraksiyon toplayıcı açın. 3 ml / dk ve fil Seti pompal bu iğne ulaşana kadar peşinde solüsyonu [% 60 (ağ / hac)% 0.02 sukroz (ağırlık / hacim) bromofenol mavisi] ile boru. Emin, en azından bir damla iğne çıkan görmek için yapmak ve hiçbir kabarcıklar pompa şırınga veya boru tanıtıldı olduğunu tespit.
3. Bir fraksiyon kolektörü içinde 2 ml tüpler yerleştirin. Analiz programı başlatın ve + / duyarlılık set - 10 MeV. 100 sn "tabanını" olarak ayarlayın.
4. Tüp dik konumda olduğundan emin yaparken UV dedektör içine her ultrasantrifujleme tüp yerleştirin. Tüp tutucu altındaki düğmeyi çevirerek iğne ile tüp delmek.
5. 1.5 ml / dk 'da pompayı ayarlamak ve (bu, her fraksiyonda ~ 750 ul neden olur) fraksiyon toplayıcı 30 saniye için zaman ayarı fraksiyonları toplayın. "Uzak konumunda" pompa koymak, pompa ve fraksiyon toplayıcı başlatın ve aynı zamanda DAQ izleyici kullanarak kaydetmeye başlayabilirsiniz. Bu sakaroz gra bir yukarı doğru yer değiştirmesini başlayacakdient ve 254 nm'deki UV absorbansı bir anda algılama. Kısa sürede kovalayan çözümün ilk damla olarak tüp toplama bir 2 ml düşüyor toplama durdurun.
6. . Csv formatında izleme kaydedin ve UV absorbans profilindeki her fraksiyonun konumlandırma belirlemek için aşağıdakileri yapın, bir elektronik tablo uygulamasında, (bir kez 3.7 tamamlanır adım):
   1. 254 nM 'de karşılık gelen değerler içeren sütunu seçin (kanal 0).
   2. Absorbansların düzgün bir çizgi dağılım grafiği oluşturun.
   3. Her bir fraksiyonun bir kısmı (30 saniye) toplama süresi olarak 5% 50% sukroz gradyanı (~ 12 mi) hacmini bölünmesi ile elde edilen 300 (değerine X ekseninin büyük ayarlanmalıdır.
7. Her fraksiyonda Trizol 750 ul ilave edin ve sıvı nitrojen içinde fraksiyonlar dondurma.
8. Üreticinin talimatlarına uygun olarak Trizol protokol kullanılarak Polizomdan ilişkili ve (2.6) sitosolik RNA izole edilir. RNA verimi artırmak için, RNA Preci devam30 dakika, -20 ° C, gece boyunca -80 ° C'de pitation.
   Not: polysomal fraksiyonları çöktürülmüş RNA miktarı açıkça görünür olmayabilir Çünkü taşıyıcı eklemek için tavsiye edilir. Trizol protokolü esnasında RNA çökeltme aşamasından önce taşıyıcı tüpe 1 ul ekle.
9. Fraksiyonları (yaklaşım 3.6 kullanılarak tarif)> 3 ribozom ile ilgili mRNA karşılık belirlemek ve bu kesirler havuzu. (2.6) toplanmış Polizomdan ilişkili ve sitozolik RNA temizleme gerçekleştirmek için RNA temizleme kiti kullanın. Mikrodizinleri veya derin-sıralama kullanarak genom mRNA düzeylerini belirlemek için bir tesis örnekleri gönderin.
   Belirli mRNA'lanmn çevirisi RT-qPCR tarafından izlenecek gerekiyorsa, bu cDNA sentez (> 3 ribozomlan veya toplam RNA içeren toplanmış fraksiyonları) RNA 500 ng kullanmanız tavsiye edilir.
   Not:> 3 ile ilişkili mRNA ribozom verimli şekilde çevrilmiş mRNA temsil eder ve yeni sentezleyebilen arasında% 80'den fazla içeren isteğe bağlı olarak ayarlanırölçekli polipeptidler ^28,29. (1-2) ışığa tekabül eden fraksiyon, ortamında (2-3) ve ağır polizom dahil (> 3) bu şekilde avantajlı olacaktır, ancak bu (koşul başına 2 vs 4) 2-kat örneklerin sayısını artacak ve Deneyin maliyeti. Gelecekte de bu derin sıralama ve mikroarray analizi maliyet azalması, ikinci bir yaklaşım tercih etmesi gerektiğini tahmin olduğunu rağmen, bu doğrulama sırasında, bireysel mRNA'lanmn dağılımı her fraksiyonunda izlenir tavsiye edilir.

MRNA Çeviri 4. Genom analizi

1. Kurulum R, BioConductor ve ANOTA paketi:
   1. R (r-project.org indirilmektedir) takın ve bir R-oturumu başlatın.
      Not: R tüm işletim sistemleri için mevcuttur ve ANOTA hepsinin üzerinde çalışacaktır.
   2. Bioconductor takın (bioconductor.org). Do tarafından başlatılan - R kod Windows R-terminali (örneğin R konsol üzerinden yorumlanıruble) R kısayolu tıklayarak. BioConductor (R-terminali) yazarak yüklenir:
      
      kaynağı ("http://bioconductor.org/biocLite.R")
      
      biocLite ()
      
   3. (R-terminali) yazarak ANOTA BioConductor paketi (ve ANOTA gerektirir qvalue paketi) yükleyin:
      
      kaynağı ("http://bioconductor.org/biocLite.R")
      
      biocLite (c ("ANOTA", "qvalue"))
   4. Paket başarıyla yüklenmiş ve (R-terminali) yazarak ANOTA kılavuzunu açmak olduğunu Testi:
      
      kütüphane ("ANOTA")
      
      skeç ("ANOTA")
      
   5. Not: ANOTA paketinde kullanılan tüm işlevleri için ek yardım ANOTA web sayfasında (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html) de kullanarak veya bulunabilir Örneğin R. içinde yardım fonksiyonu, anotaPerformQc fonksiyonu hakkında yardım almak için R-te gitmekrminal ve tipi (ANOTA paketi yüklendiğinde bu yalnızca çalıştığını unutmayın):
      
      kütüphane ("ANOTA") # ANOTA paketini yükler
      
      ? AnotaPerformQc # Bu işlev için yardım penceresi
      
2. R ithalat verileri:
   1. Ekspresyon verileri analiz için hazırlayın. Veriler, mRNA seviyelerini ölçmek için kullanılan teknik ile ilgili olarak (örneğin, normalize edilmiş ve kalite kontrol) ön işleme tabi tutulmalıdır. Log2 giriş değerleri log, dönüştürülmesi gerekir en yaygın olanıdır. Tüm Polizomdan ilişkili RNA örnekleri ve sitosolik RNA numuneleri için biri için veri ile bir tablo derlenir. İlk sütun, numune başına bir veri sütunu, ardından gen-tanımlayıcıları içermelidir; ilk satır örneklerin adlarını içermelidir. Bu tablo aynı numune sipariş ve aynı gen düzen olması önemlidir. "MyPolysomeData.txt" ve "myCytosolicData.txt" adlı sekme ile sınırlandırılmış metin dosyaları gibi dosyaları kaydedin.
   2. C1, C2, C3, D1, D2, her ikisi de myCytosolicData.txt ve myPolysomeData.txt dosyalarında D3: Bu örnekte, iki örnek sınıfları, böylece bu sırada 6 örnekleri üreten, sınıf başına 3 kez tekrarlanmış olan (kontrol veya hastalıklı) kullanılır. Iki örnek sınıflar varken ANOTA durum başına en az 3 suret gerektirir. Bu bağımsız biyolojik çoğaltır olmalıdır.
   3. Veri girişi dosyalarını (myPolysomeData.txt ve myCytosolicData.txt) içeren bir dizin oluşturun. Bu dizinden açık R. Windows / Mac, bu dizine bir R-kısayolu kopyalama ve bu kısayolu kullanarak R başlatarak yapılabilir (doğrudan çalışan da açılan menüleri kullanarak değiştirilebilir).
   4. Yeni oluşturulan dizin içinde myCode.R adında bir dosya oluşturun ve bir metin düzenleme yazılımını kullanarak açın. Bu dosyadaki kod yazın.
   5. R içine veri yüklemek için (her kod eklenmesinden sonra yeniden kaydedin bu dosyayı unutmayın) myCode.R dosyasına aşağıdaki kodu yazmak. Aşağıda adım-skod ama tüm kod dım açıklama da sadece bir kez kullanılabilir (aşağıda bakın, kod çalışır) başlangıçta ve kaynak işlevi yazılabilir:
      
      # # Bu ANOTA kütüphane yükler
      
      kütüphane (ANOTA)
      
      # # Bu R içine girdi verilerini yükler
      
      dataCyto <- as.matrix (read.table ("myCytosolicData.txt", header = DOĞRU, row.names = 1, Eylül = " t"))
      
      dataPoly <- as.matrix (read.table ("myPolysomeData.txt", header = DOĞRU, row.names = 1, Eylül = " t"))
      
   6. R terminaline doğrudan yazarak R kodu çalıştırın:
      
      kaynağı ("myCode.R")
      
   7. Veri (R-terminal içine) yazarak başarıyla yüklendiğini kontrol edin:
      kafa (dataCyto) # dataCyto tablonun üst gösterecektir
      kafa (dataPoly)
      
3. Farklı olarak tercüme genlerin tespiti:
   1. Tanımlayan bir vektör oluşturmakörnek kategoriler (bir vektör R nesne türüdür). Üç nesneler örneklerin benzer bir düzen var ki, bu vektör myPolysomeData.txt ve myCytosolicData.txt örnek düzeni yansıtmalıdır. Örnekler karşılaştırma hangi ANOTA yönlendirilmesi sırasında vektör kullanılır. MyCode.R dosyasına aşağıdakileri ekleyin:
      
      # # Suret numuneler aynı numune sınıf var unutmayın
      
      # # Açıklamaları bu vektör (yani, "C" ve "D").
      
      myPhenotypes <- C ("C", "C", "C", "D", "D", "D")
      
   2. Veri kümesinin kalite kontrol yapın. ANOTA analizi için kullanılmadan önce değerlendirilmesi gereken kaliteli bir dizi önlem vardır. Bunlar ANOTA el kitabında ayrıntılı olarak tartışılmıştır. MyCode.R dosyasına bu kodu ekleyin ve kaydedin:
      
      anotaQcOut <- anotaPerformQc (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly,phenoVec = myPhenotypes)
      
      anotaResidOut <- anotaResidOutlierTest (anotaQcObj = anotaQcOut)
      
   3. R-terminal içine yazarak kodu çalıştırın:
      
      kaynağı ("myCode.R")
      
      Bu ANOTA kılavuzunda anlatıldığı gibi incelenebilir çıkış dosyalarının bir dizi üretecektir.
      
   4. Farklı şekilde tercüme genleri tanımlamak. Numuneler onlar ("tezat" parametresini kullanarak) kullanıcı tarafından belirtilen sürece ("myPhenotypes" vektör yani) "phenoVec" parametresine verilen isimlerin alfabetik sırasına göre mukayese edilecektir. Içeride "kaynak" komutunu kullanarak dosya ve bitiş myCode.R için aşağıdaki kodu ekleyin R-terminali, yukarıda açıklandığı gibi:
      
      anotaSigOut <- anotaGetSigGenes (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly, phenoVec = myPhenotypes, anotaQcObj = anotaQcOut)
   5. AnotaGetSigGenes anlamak için yardım kullanabilirsiniz nasıl oıkış biçimlendirilmiş ve (R-terminali) yazarak karşılaştırmak için örnek kategorileri seçmek için nasıl edilir:
      
      ? AnotaGetSigGenes
      
   6. Farklı şekilde tercüme edilir Filtre ve arsa genler. AnotaPlotSigGenes fonksiyon içinde uygulanabilir ve yardım kullanarak bu tür eşikleri özel bir birleşimini kolaylaştırmak olacaktır birden eşikler vardır. Güvenilir bir şekilde analiz genleri seçmek için minSlope (-0.5), maxSlope (1.5) ve slopeP (0.01) ayarları uygulanır.
      Not: Ayrıca, RVM ^23,26,30 yanlış keşif oranı (FDR) (0.15) için geçerli ayarları ve (log2 [1,5]), örneğin farklı şekilde tercüme genleri tanımlamak için kullanılır olabilir değişiklikleri katlayın. Örneğin "selDeltaPT" gibi diğer filtreler ([1,5] log2 için selDeltaPT ayarı gibi) katı bir filtreleme için yararlı olabilir. Bu karşılaştırma (selCont argüman kullanarak) filtre edilmelidir belirtmek için de gereklidir. MyCode.R için aşağıdaki satırı ekleyerek açıklanan ayarları uygulayındosyası:
      
      anotaSigFiltered <- anotaPlotSigGenes (anotaSigObj = anotaSigOut, selContr = 1, minSlope = (-0.5), = 1.5 maxSlope, slopeP = 0.01, maxRvmPAdj = 0.15, minEff = log2 (1.5), selDeltaPT = log2 (1.5))
      
   7. Kaynak fonksiyonunu kullanarak analiz yapma R-terminal yukarıda tarif edildiği gibi. Bu aynı zamanda bir grafik çıktı üretecektir. Bu çıkışı inceleyerek analiz performansını değerlendirmek ve ayarlarında gerekli değişiklikleri tanımlamak için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır.
   8. Bir çıkış tablosu oluşturun. MyCode.R dosyasına aşağıdaki kodu ekleyin:
      
      write.table (anotaSigFiltered $ selectedRvmData, file = "MySignificantGenes.txt", Eylül = " t")
      
   9. R-terminalinde kaynak işlevini kullanarak kodu çalıştırın. Çıkan tabloda sütunlar anotaPlotSigGenes fonksiyonu için yardım açıklanmıştır.

Sonuçlar

mTOR besin durumu ¹⁹ ile küresel protein sentezi oranlarını koordinatları hücresel ağın önemli bir düğümdür. mRNA için oran-sınırlayıcı başlangıç ​​aşamasında ⁶ ağırlıklı olarak düzenlenir. Polisomlar yapan Ribozomların oranı olumlu çeviri başlangıç ​​oranları ²⁸ ile ilişkilidir. MRNA çeviri üzerine insülinin etkilerine aracılık mTOR sinyal rolünü araştırmak için polisom damıtma yöntemi uygulayarak bir örnek sunulmaktadır. Bu amaçla, MCF7 insan meme kanseri hücreleri, düşük serum içinde tutulur ve daha sonra insülin tek başına ya da aktif yer mTOR inhibitörü Torin1 ile kombinasyon halinde ile uyarılır. Sürekli düşük serumda tutuldu, uyarılmamış hücreler, bir kontrol olarak kullanılmıştır. mRNPs, monosome (80S) ve Polizom fraksiyonlar polisom ayırma yöntemi kullanılarak ayrıldı. Kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında, ilgili ensülin gradyan fraksiyonlarında absorbans bir artışa nedenpolizom için, monosome fraksiyonda absorbans bir azalma eşlik eden (Şekil 1) ile birlikte. Bu bulgular, polizom yapan ribozomların oranı bu nedenle beklendiği gibi, ensülin küresel çeviri başlatma oranlarını uyarır, belirten, kontrol hücrelerine kıyasla tedavi edilen insülin artmış olduğunu göstermektedir. Torin1 böylece mTOR sinyal nakil mekanizması ¹⁹ insülin etkisini aracılık etmede önemli bir rol oynadığını bulguları teyit edici, emme profilleri insülin etkisini (Şekil 1) tersine dönmüştür.

Gradyan hazırlık tutarsızlıklar kaçınılması mümkün olmayan bir inanç dayanarak, sorular polisom fraksiyon yöntemi ²² kullanılarak elde edilen verilerin tekrarlanabilirliği ile ilgili gündeme edilmiştir. Ampirik bu potansiyel zararlı sorunu, sitozolik ve ağır Polizomdan ilişkili RNA (4 ve daha fazla ribozomlarla ilişkili mRNA) test etmek için izole edildi 4 bağımsız biyolojik tekrarlanmış Torin1 (Şekil 2) ile kombinasyon halinde, tek başına insülin ya da insülin ile tedavi MCF7 hücreleri. Sitosolik ve her deney ağır Polizomdan ilişkili mRNA bileşimine insülinin ve Torin1 etkisi, bir mikro-dizi yaklaşım kullanarak bir genom geniş bir ölçekte belirlenmiştir. Temel bileşen analizi (PCA) uygulandı polisom bölme yönteminin tekrarlanabilirliği belirlemek için. Bu tür bir analiz, farklı koşullar de (Şekil 2) ayrılmıştır sırasında her bir durum ait örnekler sıkıca ilk iki bileşenleri içinde konumlandırılmış olduğunu gösterdi. Bu bulgular, burada açıklandığı gibi, polisom ayırma yöntemi oldukça üretilebilir ve bir genom düzeyinde çeviri niceliksel ve niteliksel değişiklikleri incelemek için, bu nedenle uygun olduğunu göstermektedir.

ad/51455/51455fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg "/>
Serum açlık insülin ve mTOR MCF7 hücrelerinde küresel çeviri üzerine sinyal etkisini gösteren Şekil 1,. Polysomal profilleri. MCF7 hücreleri, 16 saat süre ile (% 0.1 FBS içinde tutulan) besin yoksun bırakıldı ve 5 nM insülin (In), tek başına ya da tedavi edildi 4 saat için 250 nM Torin1 (Ins + Torin1) ile kombinasyon halinde kullanılabilir. Sürekli besin (% 0.1 FBS) yoksun olan Tedavi edilmeyen hücreleri, kontrol olarak kullanılmıştır. Karşılık gelen sitosolik özütler% 5-50 sakaroz gradyanları üzerinde santrifüjle çöktürülmüştür. Ücretsiz ribozomal alt birimleri (40S ve 60S), monosomes (80S) ve polisom fraksiyonlardaki ribozomların sayısı belirtilir.

Şekil 2.. P kullanılarak elde edilen genom veriolysome profil çok tekrarlanabilir. MCF7 hücreleri. Sitosolik ve Polizomdan bağlantılı RNA (> 3 ribozomlar) GeneTitan diziler (Affymetrix) kullanılarak belirlendi 4 bağımsız biyolojik çoğaltır ve genom mRNA düzeyleri elde edilmiştir, Şekil 1 'deki gibi muamele edilmiştir. PCA edilen veriler tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için kullanıldı. RNA kökenli (C = sitozolik, P = Polizomdan ilişkili) tüm tedaviler için ilk iki PCA bileşenleri (;; ctrl = kontrol Atışı = insülin T1 = Torin 1) gösterilmiştir ve çoğaltır. Aynı durum ve RNA kaynaklı örnekler yakın yüksek bir tekrarlanabilirlik göstermektedir konumlandırılır.

Tartışmalar

Bu makalede, memeli hücrelerinde bir genom ölçekte öteleme aktivitesinde nitel ve nicel değişiklikleri yakalamak için bir in-house geliştirilen analiz yöntemi ardından köklü bir Polizom fraksiyon protokol tanımlamaktadır. Bu protokol özel ilgi başarıyla tamamlanması 1) Hücre confluency dikkat edilmelidir için çoğalma hızları ve besin durumu mRNA çeviri aktivitesi ile ilişkili ve translatome bileşimini etkileyebilir olarak (hücre konfluensisinin) çoğaltır ve deneysel koşullara tutarlı olmalıdır, 2) Hızlı hücre liziz (sikloheksimid ve tamponlar içinde RNAse inhibitörlerin varlığında rağmen, hızlı liziz ve hücre ekstreleri hemen RNA bozulması ve polizom ayrılmasını önlemek için liziz sonra sukroz dereceleri üzerinde kaplanmış olmalıdır) olmalıdır, 3) Gradient hazırlanması (sağlamak yüksek veri uyarlık, sukroz geçişlerini degrade makinesi ve SPE kullanılarak hazırlanmalıdır) onları işlerken cial dikkat edilmelidir.

Translasyonel aktivitesindeki değişiklikleri okuyan ek olarak, bu protokol, ribozom-ilişkili protein komplekslerini izole etmek ve bunların fizyolojik fonksiyonları oluşturmak için kullanılabilir. Ribozom-ilişkili protein kompleksleri gradyan fraksiyonlardan immünopresipitasyon ve Western blot analizi ya da kütle spektrometresi ile analiz edilebilir ise, bu amaca yönelik olarak, düzeyleri ve çeşitli ribozom-ilişkili proteinlerin fosforilasyon durumu, TCA presipitasyonu ile belirlenebilir Western blotting ile izledi. Bu tekniğin bir eksiklik yavaş degrade fraksiyon yöntem bağlanma kinetiği hızlı bir birleşme / ayrılma içinde olsa bile sıkı bir şekilde bağlanmış protein ayrışma neden olmasıdır. Yeni sentezlenmiş polipeptidlere ilişkili faktörler tipik örneklerdir. Ribozomlar oluşturan yeni ortaya çıkan sentez polipeptidler, 3 gibi kimyasal çapraz-bağlayıcıların kullanımı ile ilişkili ribozom protein kompleksleri üzerinde hareketsiz olabilir, 3'-ditiyobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) ^31. Bu yaklaşım ortaya koydu Aktive C Kinaz 1 (Rack1) / c-Jun N-terminal kinazın (JNK) / ökaryotik için uzama faktörü için reseptör 1A2 (eEF1A2) kompleksi ²⁷ strese tepki olarak yeni sentezlenmiş polipeptidlerin bozulmasını düzenleyen. Buna ek olarak, benzer metodoloji, protein kinaz C BII (PKCbII) bu yeni sentez AKT polipeptidler fosforile eder ve düzenler, ribozomlar üzerinde meydana Rack1 ³² ve mTOR kompleksi 2 (mTORC2) bu aktivasyonu ile ribozomlara işe olduğunu gösteren çalışmalar kullanılmıştır onların istikrar ^33,34.

ANOTA analizi ile takip polisom ayırma yönteminin başlıca sınırlamaları şunlardır: hücrelerin nispeten yüksek sayıda (~ 15 x 10 ⁶ hücre) için 1) gereksinimi, 2), belirli bir mRNA molekülü üzerinde ribozom konumuyla ilgili konumsal bilgi eksikliği ve 3 Hücresel ve moleküler hetero ile ilgili) sorunlarNormal ve tümör dokular geneity. Gerekli hücre sayısı ile ilgili konular miktarlarının yüksek-bereket hücrelerinden elde edilen (örneğin HeLa hücreleri) ³⁵ ile sınırlayan hücrelerin monosomes (80S) karşılık gelen absorbans spektrumları zirveleri hizalayarak çözülebilir. , Insan dokuları gibi karmaşık sistemlerinden elde edilen gen ekspresyonunda değişikliklere yorumuna doku heterojenlik karıştırıcı etkileri ile ilgili konular ele oysa ribozom profil oluşturma tekniği (aşağıya bakınız), belirli bir mRNA molekülü üzerindeki ribozom tam konumunu belirlemek için kullanılabilir Leek ve Storey ³⁶ ile bir yayında ayrıntılı olarak.

Ribozom korumalı parçaları (RPFS) RNAse I muamele ile üretilir ve derin ^22-dizisi ile analiz edilir, burada en son profile tekniği yeni bir ribozom, geliştirilmiştir. Bu teknik, bu şekilde şimdiye kadar UNPR sağlayan, tek bir nükleotid çözünürlükte ribozom pozisyonunun belirlenmesini sağlar:ribozom biyoloji içine ecedented anlayışlar. Örneğin, ribozom profil belirli bir mRNA molekülü veya elemanların tanımlanması üzerine ribozom yoğunluğunun belirlenmesi için kullanılabilecek bu tür alternatif başlangıç ​​yerleri, non-AUG başlatma kodonu ile ve bu uORFs gibi düzenleyici elemanları olarak etki çeviri başlangıç ​​oranları. Ancak, doğru mRNA çeviri etkinliğini tahmin etmek ribozom profilleme yeteneğini kısıtlayan çeşitli metodolojik sınırlamalar vardır. Bunlar rastgele parçalanması ve RNAz ben sindirim tarafından tanıtıldı bağımsız önyargıları dahil, çeviri inhibitörleri (örneğin emetine ve Siklohekzimidsiz gibi örneğin uzama inhibitörleri çeviri başlatma sitelerinde ribozom birikmesine sebep muhtemeldir) tarafından tanıtılan önyargıları, yanlış pozitif ve yanlış negatif sonuçların çok sayıda ilişkili TE puan olarak tahmin onların yanlışlığına ile bu protein kodlama mRNA'lardan ³⁷ kaynaklanır okur. Belki de en önemlisi, oysaribozom profil belirli bir mRNA molekülü üzerinde ribozom pozisyonunun doğrudan belirlenmesini sağlar, belirli bir mRNA ile ilişkili ribozom sayısının dolaylı olarak, toplam (rastgele bölünmüş mRNA gözlenen fazla RPFS (ribozom ile ilişkili mRNA) okur frekansları normalize edilmesi ile tahmin edilmektedir mRNA). Örneğin, dört "B" mRNA molekülleri (Ba, Bb, Bc ve Bd) pozisyon 1, 2, 3 ve 4, ribozom profil oluşturma tekniğinin doğal bir dezavantajı dört ribozomlar tarafından işgal edilmiştir basit bir ortamda izin vermez Bir bütün 4 ribozomlar pozisyonlarda 1 bir Ba mRNA sadece ilişkilendirmek senaryoda, 2, 3, ve 4 ve Ba, Bb, Bc ve Bd mRNA pozisyon 1, 2 tek bir ribozom tarafından her işgal bir senaryo arasında bir ayrım , sırasıyla 3 ve 4,. Bunun aksine, polisom parçalama sırasında Polizom bütünlüğü bu şekilde ribozom tanımlanmış bir dizi (Şekil 1) ile ilişkili mRNA havuzlarının izolasyonunu sağlayan, korunur. Bu ithalatPolizom fraksiyonasyon ve ribozom profil arasındaki fark ant eski Yöntem, mRNP in mRNA karşılaştırmak için kullanılabilir ise, hafif ve ağır Polizom fraksiyonlar, ikinci yöntem olası mRNA kaynaklanır translatome değişiklikleri yakalamak başarısız olur göstermektedir ki geçiş dan ağır polisomlar için mRNP fraksiyonu kayması olanların katkısını overestimating ederken, ağır polisomlar için yanar. Anılan yöntemler arasında bu farkların biyolojik önemi gibi eIF4E duyarlı olanlar gibi mRNA'lanmn bir alt kümesi olduğunu öteleme aktivasyonunu gösteren verilerin büyük bir organ tarafından çizildi, gibi gibi diğerleri barındıran ağır polisomlar ışıktan geçiş, oysa 5'TOP elemanları, doğrudan ribozomsuz mRNA ⁶ havuzları ağır polisomlar için işe alınırlar. İlginç bir şekilde, mTOR yol eş zamanlı "eIF4E duyarlı" ve 5'TOP ¹ mRNA translasyonunu modüle ettiği gösterilmiştir1.. Nedenle, yukarıda açıklanan metodolojik farklılıklar translatome üzerinde mTOR inhibisyon etkilerini değerlendirmek için ^38,39 ve Polizom damıtılmalarının ²⁴ profilleme ribozomu kullanarak çalışmalar arasındaki sonuç belirgin uyumsuzluğuna açıklayabilir.

Sonuç olarak, polisom ayırma ve ribozom profil temel olarak, sırasıyla mRNA, mRNA üzerinde ve ribozom konumu ile ilişkili ribozom sayısı ile ilgili bilgi sağlayan tamamlayıcı yöntemlerdir. Önemlisi, bu yöntemlerin eksiklikleri ve avantajlarına rağmen, her iki prosedürler ile elde genom veri yeterince analiz ve fonksiyonel ve biyokimyasal doğrulandığı esastır kalır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Biobasic	HB0264
MgCl2	Sigma	M8266
KCl	VWR	CABDH4532
Dithiothreitol (DTT)	Biobasic	DB0058
Tris	Biobasic	TB0196
Glycoblue	Ambion	AM9515	RNA precipitation carrier
Sodium Deoxycholate	Sigma	D6750
Triton X-100	Sigma	X100
Cycloheximide	Sigma	C1988
Protease inhibitor cocktail	Roche	04693132001	Tablets (EDTA-free)
RNase inhibitor	Promega	N2515
0.45 µm Filter System 150 ml	Corning	431155
Sucrose	Sigma	S0389
RNeasy MinElute Cleanup kit	Qiagen	74204	RNA cleanup kit
Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
SW41Ti Rotor Package with accessories	Beckman Coulter	331336
Optima L100 XP ultra centrifuge	Beckman Coulter	DS-9340A
ISCO fraction collector	Brandel	FC-176-R1
Type II Detector with Chart Recorder	Brandel	UA-6	UV detector
Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump	Brandel	BR-A86-5
UA-6 Detector Cable	Brandel	60-1020-211
FC-176 Communication Cable	Brandel	FCC-176
Gradient Master Base Unit	Biocomp	108-1	Gradient Maker
Gradient Forming Attachments	Biocomp	105-914A-1R	Gradient Maker attachment
Measurement Computing 8-channel 50 kHz Data Acquisition Device	MicroDAQ	USB-1208FS	Analysis software attachment
Measurement Computing Data Acquisition Software	MicroDAQ	TracerDAQ Pro	Analysis software (Download only)
10x buffer for sucrose gradients:
200 mM HEPES (pH7.6)
1 M KCl
50 mM MgCl2
100 µg/ml cycloheximide
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)
100 units/ml RNase inhibitor
Lysis buffer
5 mM Tris-HCl (pH7.5)
2.5 mM MgCl2
1.5 mM KCl
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)]
Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text