Farelerde spontan metastatik renal hücreli karsinom (MRCC) modelleme ardından nefrektomi

Özet

Spontan metastatik renal hücre karsinomu (RCC), hastalığın ilerlemesine modelleri klinik olarak anlamlı bir ortamda tedavi değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu protokol, kadavradan böbrek tümör hücre implantasyonu, uygun nefrektomi için farklı prosedürler gösterir ve nihayet metastatik yükü ve lokalizasyon görsel ve biyolüminesens puanlama için bir otopsi rehber özetliyor.

Özet

Renal hücreli karsinom (RCC) yeni deneysel tedavilerin gelişmiş test için önemli zorluklardan biri sadakatle erken ve geç evre metastatik hastalık ilerlemesini özetlemek modellerinin geliştirilmesidir. Tipik tümör implantasyonu modelleri ektopik veya kadavradan primer tümör implantasyonu kullanmak, ancak birkaç klinik ayarını taklit sistemik spontan metastatik hastalığı vardır. Bu protokol RCC hastalığın ilerlemesi hastalara benzer aşamaları geliştirmek için önemli adımlar açıklanır. İlk olarak, ortotopik tümör hücre implantasyonu göstermek için bir genetik olarak özdeş bir modelde yüksek düzeyde metastatik fare tümör hücre hattı kullanır. Yöntem sızıntı ve erken yayılmasını önlemek için Matrigel ile birlikte hücreler ile alt kapsül boşluğa yüzeysel ve iç implantasyonu içerir. Sonraki kritik öncesi ve ameliyat sonrası bakım ile fare, tümör taşıyan böbrek (nefrektomi) eksizyonu için prosedürler açıklanmaktadır. Son olarak, izlemek ve değerlendirmek için gerekli adımları özetliyorMikro-ve de biyolüminesens görüntüleme dahil olmak üzere makro-metastatik hastalık ilerlemesi, sistemik hastalık dağılımı puan için ayrıntılı görsel otopsi kılavuzu sağlar. Bu protokol açıklamanın amacı, gelecekteki tedavi test öngörü değerini artırmak için klinik olarak ilgili metastatik RCC modelleri yaygın kullanımını kolaylaştırmaktır.

Giriş

Renal hücreli karsinom (RCC) olan hastalarda mortalitenin önemli nedeni genellikle böbrek büyüyen bir primer tümörün cerrahi olarak çıkarılması sonrası ortaya sistemik metastatik hastalıktır. Bununla birlikte, farelerde deneysel terapötik değerlendirilmesi, çok az klinik öncesi modellerde tümör metastatik hastalığı, ve daha az hala sadakatle lokalize bir büyüme, cerrahi ve spontan mikro metastatik başlaması ve ilerlemesi ^1-3 klinik aşamaları özetlemek. Test Bu boşluk bazen hayvan modellerinde görülen çarpıcı bir anti-tümör etkileri her zaman hastaların ⁴ benzer başarılı tedavisi tercüme değil, yeni tedavilerin değerlendirilmesinde giderek daha önemli hale gelmiştir. Sonuçlarında tür farklılıklar lokalize ektopik veya kadavradan primer tümör modelleri ve geç evre metastatik hastalık ^5-7 arasında ayırıcı ilaç etkilerlere kaynaklanıyor olabilir. RCC durumunda, sadece bir kaç çalışma kurulmuş istihdam var, birgenellikle tümör taşıyan böbrekleri vardı taklit eden hastalar tamamen veya kısmen ^2,3 kaldırıldı spontan tekrarlayan hastalığı vardır Nimal protokolleri. Fare modeli test Bu eksiklik için nedenleri değişir. İlk olarak, yüksek maliyet ve hayvan tümör hücre seçimi ve metastaz potansiyeli doğal değişkenlik vardır. (Örneğin, bir insan hücre hattı türetme ^8-10 açıklamasına bakınız), örneğin, insan böbrek hücre çizgileri nadiren metastaz eğilimindedir ve ortotopik primer implantasyon ve sürekli olarak yaymak ve uzak bir lezyon meydana türevlerini elde etmek için metastatik seçimi birden fazla tur seçilmelidir . Tersine, bağışıklığı yeterli bir model fare hücreleri agresif olarak davranma eğilimi gösterirler, ve düşük hücre sayıları hemen sistemik yayılmasını ³ azaltmak için Matrigel ile enjekte edilmelidir. İkincisi, teknik doğru implantasyonu, cerrahi rezeksiyon (nefrektomi) performans ve izleme güçlüğü (ve miktarlarının ayarlanması) spontan metastatic büyüme zor olabilir ve (ayrıntılar için Tartışma) Bu tekniğin uygulanması sırasında birçok kritik değişkenler dikkate gerekir. Bu protokolün amacı ortotopik implantasyon, rezeksiyon (nefrektomi), ve spontan metastatik RCC hastalığın izlenmesi temel adımları (yanı sıra potansiyel tuzaklar) tanımlamak ve standart (ve daha yaygın) için bir rehber sunmak için bilimsel laboratuvarlar arasında kullanmaktır Bu deneysel terapötik etkinliğini değerlendirmek.

Protokol

1.. Ortotopik Böbrek Tümör İmplantasyonu

1. Hücre Kültürü
   1. Önce kadavradan implantasyon için,% 75 confluency bir tek tabaka olarak fare renca ^LUC hücreleri büyür.
   2. % 5 FBS ihtiva eden ortam, 1000 rpm'de santrifüj hücreler, 5 dakika boyunca 4 ° C'de, PBS içinde yıkamak için 3 kez tekrar, tripsinizasyon ve yeniden süspansiyona alınmasından sonra. Daha sonra, 5 x 10 ⁴ renca ^LUC / 5 ul serum içermeyen ortam içinde bir konsantrasyona serumsuz ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
      Not: varyant veya kullanılan hücre çizgisi bağlı olarak hücreler, implantasyondan sonra oldukça agresif fare hücre büyümesini ve yayılmasını yavaş matrigel ve serum barındırmayan ortam içinde bir 1:1 oranında yeniden süspanse edilebilir.
2. Cerrahi ve hücre implantasyonu
   Not: Tüm hayvan çalışmaları, bir Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) p uygun olarak gerçekleştirildi, deneysel son nokta bakım ve belirlenmesi de dahil olmak üzere, burada tarifotokol Roswell Park Kanser Enstitüsü tarafından onaylanmıştır.
   1. Izofluran (% 2-3) kullanılarak, bir Balb / C fare anestezisi. Ayak tutam ve yeterli anesthetization sağlamak refleksi kontrol edin. Kurumasını önlemek için gözlere veteriner merhem sürün. Sağ lateral pozisyonda fare yerleştirin ve ön ve hind-bacak arasında sol tarafını tıraş. Aseptik kesi alanı hazırlamak için dorsal lomber bölge boyunca alkol ve iyot uygulayın.
   2. Son kaburga ve kalça eklem arasında uzunlamasına yönde bir 1 cm cilt insizyonu başlatmak için cerrahi makas kullanın. Bir künt diseksiyon makas kullanarak deri altında bağ dokusu gevşetin. Karın duvarında uzunlamasına yönde 0.5 cm kesi yapmak için cerrahi makas kullanın. Hafifçe açık yara etrafında aşağı itmek için kavisli bir forseps kullanın - bu böbrek exteriorize ve enjeksiyon öncesinde organ nazik immobilizasyonu için izin verecektir.
   3. Hazırlanan hücre karışımı ile 5 ul Hamilton şırıngası yerleştirin. Sub-kapsül implantasyonu içinsürgünler, implantasyon iki yöntem kullanılabilir:
      1. Yüzeysel: eğimli kenar up ile böbrek kapsülü altında uzunlamasına odaklı böbrek, insert iğneye (ama parankimi yukarıda) paralel yayınlanıyor. Iğne yerleştirildikten sonra, küçük beyaz kabarcık formları kadar tüm hücreleri enjekte. Yavaş yavaş kapsül iğne çıkarılır ve derhal sızıntıyı emer ve hücre yayılmasını önlemek için steril pamuk uçlu bir aplikatör ile enjeksiyon üzerinde leke.
      2. Dahili: iğne görünür (ama delinmesiyle değil) kadar eğimli kenar up ve son implantasyon sitesine böbrek karşısında yanından başlayan, böbreğin iç kısmından alt kapsül boşluk iğne takın. Beyaz kabarcık formları ve sürüntü enjeksiyon sitesi herhangi bir sızıntıyı önlemek için kadar tüm hücreleri enjekte edilir.
   4. Yavaşça vücut boşluğuna böbrek dönmek. Emilebilir 5-0 Vicryl dikiş kullanılarak karın vücut duvarı kapatın. Tamamlandığında, birlikte deri tabakası çekin ve w 2-3 koyunklipleri ound. Sağlamak klipleri sağlam ve eşit hiçbir yara pozlama sağlamak için aralıklı vardır. Önceki iyileşme için% 0.9 NaCl 500 ul ve deri altından, bir 25 G iğne kullanılarak Buprenorfin (0.01 mg / ml) 100 ul yönetmek. Rutin klip yerleştirme ve istikrar izlemek, ve 10 gün sonra kaldırın.

2.. Nefrektomi / İlköğretim Tümör Temizleme

1. Bölme (yukarıda) 1.2.1 ve 1.2.2 'de tarif edildiği gibi fare Anestezi, hareketsizleştirme, kazıma, ve böbrek maruz için aynı protokol takip edin.
2. Yavaşça kuyruk ucundan bağlantı yağ dokusu ve böbrek kranial ucundan adrenal bezi kaldırarak böbrek izole etmek için forseps ikinci bir çift kullanın. Yavaşça böbrek tutmakta iken, bir üreter etrafında çift düğüm, renal arter ve ven yapmak için emilebilir 5-0 vicryl kullanın. Yavaş yavaş, güvenli ve daha sonra böbrek kaldırmak için düğüm yukarıdaki kesti. Hemen kan kaybı, ya da orada herhangi bir işaret yetersiz beklemeye riski iseüreter, arter ve ven sütür, sonra düğüm yukarıda kesmek için makas yerine cauterizer kullanın.
3. Böbrek çıkarıldıktan sonra, bağlı arterden herhangi bir kanama açısından dikkatle kontrol edin ve gerekirse cauterizer kullanın. 5-0 Vicryl kullanılarak abdominal gövde duvarını kapatın. Birlikte deri tabakası çekin ve 1.2.4 de tarif edildiği gibi, aşağıdaki önlemleri 2-3 yara klipleri yerleştirin. Yakından kanama sıkıntı belirtileri, ya da sınırlı hareketlilik cerrahisini takiben günlük hayvan izlemek. Güvenle hayvan için kurumsal yönergeleri izleyin.

3.. Endpoint de Metastatik Gelişmesini ve Yerelleştirme İzleme

1. Metastatik hastalık ölçümü: biyoluminesen izleme
   1. Daha önce lusiferaz ile transfekte hücreler kullanılarak metastazı, izleme ve görüntüleme sistemi, Xenogen IVIS ^11,12 kullanılarak nicelleştirilmiştir için Jüpiter açıklanan metodoloji bakınız.
2. Metastatik dağılımını karşılaştırmalı değerlendirilmesi için görsel otopsi kılavuzution
   1. Vs sıkıntı belirtileri, zor nefes alma, kilo kaybı, gibi noktalar kullanılarak kurumsal kurallarına göre hayvanların Kurban
      Not: spontan metastatik hastalık son derece değişken ve hızlı olabilir gibi hayvanların yakın takibi önemlidir.
   2. Alt çene için göğüs boşluğuna kadar devam üretranın üzerinde bir kesi başlatmak için cerrahi makas kullanın. Karın duvarının kas cilt ayırmak için kör uçlu makas kullanın.
   3. Kollar ve bacaklar boyunca kesiler başlatın. Peel cilt uzakta. Yakından cilt fasya ve nodüller için karın duvarı incelemek, daha sonra yüzeysel lenf düğümleri: inguinal, brakiyal, aksiller ve yüzeysel servikal.
   4. Karın duvarında bir kesi yapmak ve diyaframa kadar sağ ve sol yan kenarlarında kesilmiş. Bir yatay kesim ile iç organları çıplak karın duvarının ön kısmını kaldırın.
   5. Iç organlar f rahatsız görünümünü inceleyinya fena halde önemli tümörler. Ayrıca, mide ve bağırsak içeriklerini not edin; onlar boş olup olmadığını, fare yemek mümkün olmayabilir. Içeriği karanlık ise, bu üst / alt gastrointestinal sistem kanaması kanıt gösterebilir.
   6. Görsel olarak, her fare grubu için toplam puan tayin, tümör varlığında ya da yokluğunda her bir organ skoru (grup başına 4 hayvan Şekil 1D-i de örnek olarak kullanılmıştır.)
      Notlar: 1), lenf nodu büyümesi mutlaka bir tümör büyümesi olduğu anlamına gelmez; Bu, büyük ölçüde boyutlu, çok sağlam ve bir beyazımsı renkli ise, büyük olasılıkla bir metastatik nodül olduğunu. 2) Karında aşırı sütlü veya bulanık sıvı assit gösterir. Asit, özellikle karaciğer ve mide lob arasındaki karın organları üzerinde katı madde birikimleri içerebilir. 3) gibi akciğer gibi organlar için, birden fazla nodül (örneğin ¹³ bakınız) mevcut ve bireysel hayvanlar arasındaki karşılaştırmalar için sayılır olabilir.
   7. Dikkatli bir fışkırtma şişeden çıkarmadan ve PBS ile yıkama yoluyla karaciğer, dalak, böbrekler ve pankreas: Bireysel karın organlarının brüt tümörler veya anormallikleri tespit.
   8. Karın organları çıkarıldıktan sonra, lomber, sakral, renal ve mezenterik lenf nodu dahil abdominal lenf düğümleri, inceleyin.
   9. Metastatik yayılım delil diyafram değerlendirin.
      Not: diyafram geniş yaymak yorucu veya nefes kaybı yol açan, onun kasılma kaybetmesine neden olabilir.
   10. Diyaframı çıkarın ve akciğer ve kalp maruz ön kısmını kaldırarak, göğüs boşluğunda iki yanal kesiler yapmak.
   11. Nazikçe tutup kaldırma yemek borusu ve kalp üzerinde trakea keserek akciğer ve kalp çıkarın. Nodüller için dokuları değerlendirin. Kalbini sıkıştırın. Yaylı tutarlılık eksikliği tümör mevcut gösterebilir.
   12. Kafatası ile doğrusal olarak kesmek için, cerrahi makas kullanın. Yavaşça t kadar kafatası küçük parçalarını çıkartıno bütün beyin maruz kalmaktadır. Görünür nodül veya anormallikleri renklenmeler için beyin boyunca bakın.

Sonuçlar

Şekil 1A, bu protokol, özetle detaylı olarak açıklanan yöntemi gösteren bir şematik göstermektedir. Birçok önemli faktör, her adım için kabul edilmelidir. Örneğin, basamak 1'de bu böbrek içine alt kapsül tümör hücre implantasyonu için iki yöntem gösterilmektedir. Tümör hücreleri iğne dikkatli çıkarılması ve swabbing fazla kaçan sıvı (Şekil 1B-i) ile önlenir sızıntı ile hücrelerin lokalize yerleşimini teyit küçük beyaz kabarcık ile alt k...

Tartışmalar

Bu protokolün amacı, implantasyon / rezeksiyon teknikleri tanımlamak için bir sinjeneik tümör fare modeli kullanılarak klinik olarak ilgili spontan metastatik hastalık değerlendirmektir. Şu anda, yeni deneysel tedaviler değerlendiren klinik öncesi çalışmaların çoğunluğu metastatik hastalık çalışma dahil değildir ve sadece birkaç primer tümör büyümesi, cerrahi rezeksiyon ve nihai spontan metastatik yayılma aşamaları özetlemek. Bugüne kadar, genetiği fare modelleri (GEMMs) spontan renal ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine	Corning	10-013-CV
FBS	Invitrogen	10437-028
0.25% Trypsin EDTA	Corning	25-053-CL
1x DPBS without Calcium & Magnesium	Corning	21-031-CV
Matrigel	BD Biosciences	354234	must be kept on ice
Artifical tears-lubricant opthalmic ointment	Akorn Animal Health	17478-162-35
Pocket pro pet trimmer	Braintree scientific	CLP9931B
Alcohol swab	VWR	326895
Betadine solution swab	VWR	67618-152-01
MICRO DISSECTING sissors straight,blunt - 25 mm blades - 4.5"	Southpointe surgical	RS-5982
Iris Forceps, serrated, curved, 10 cm long	Kent scientific	INS15915	need two of these
10 µl Hamilton syringe	Hamilton	7635-01
30 G, 45 degree, RN needle	Hamilton	7803-07
Sterile cotton tipped appicator	VWR	10805-144
High temperature cautery kit	Kent scientific	INS500392
5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle	Ethicon	J834
Reflex clip applier for 7 mm clips	Kent scientific	INS500343
Reflex clips, 7 mm, non-sterile	Kent scientific	INS500344
Removing forceps, 12 cm long	Kent scientific	INS500347
0.9% Sodium Chloride	Baxter Healthcare	2B1322
Buprenorphine 0.01 mg/ml
25 G 5/8" needle	VWR	BD305122
1 ml syringe w/out needle	VWR	BD309659
D-Luciferin	Gold Bio technology	LUCK-1G