Farelerde Nöropatik Ağrı Siyatik Sinir cuffing Modeli

Özet

Nöropatik ağrı somatosensory sistemini etkileyen bir yara ya da hastalık, bir sonucudur. Farelerde nöropatik ağrı "ağzı model" siyatik sinirin ana dal etrafında bir polietilen manşetin implantasyon oluşur. Mekanik alodinia von Frey filamentleri kullanılarak test edilir.

Özet

Nöropatik ağrı, bir yara ya da somatosensory sistemini etkileyen bir hastalığın bir sonucu olarak ortaya çıkar. Yaralı duyu nöronlarının ve merkezi sinir sistemi içinde, tüm yol boyunca nosiseptif uyumsuz değişiklikler bu sendrom ile sonuçlanır. Genellikle kronik ve tedavi etmek zordur. Nöropatik ağrı ve tedavileri incelemek için, farklı model kemirgenlerde geliştirilmiştir. Bu modeller dolayısıyla periferik sinir yaralanmaları, merkezi yaralanmaları, ve metabolik-enfeksiyöz veya kemoterapi-ilişkili nöropatiler üreten, bilinen etiyolojilerden türetmek. Periferik sinir yaralanması kemirgen modelleri genellikle kolay erişim ve arka pençe nosiseptif testleri verir siyatik siniri hedef. Bu modeller, bir sıkıştırma ve / veya bir bölümüne dayanır. Burada, farelerde nöropatik ağrı "ağzı model" için ayrıntılı bir cerrahi prosedür tarif edilmektedir. Bu modelde, standart uzunlukta (2 mm) bir PE-20 polietilen bir boru ağzı tek taraflı isiyatik sinirin ana dal etrafında mplanted. Bu, uzun süreli mekanik allodini indükler, yani., Von Frey filamentleri kullanılarak değerlendirilebilir bir normal olarak nosiseptif uyarıcı bir nosiseptif tepki. Ayrıntılı cerrahi ve test prosedürleri yanı sıra, nöropatik ağrının duyusal ve anxiodepressive yönleri çalışma için nöropatik ağrı mekanizmasının, çalışma ve nöropatik ağrı tedavisi için, bu çalışma modelin ilgi de tartışılmıştır.

Giriş

Nöropatik ağrı genellikle kroniktir ve bir yara ya da somatosensory sistemini etkileyen bir hastalığın bir sonucu olarak ortaya çıkar. Merkezi sinir sistemi içinde yaralı duyu nöronlarında ve tüm yol boyunca nosiseptif uyumsuz değişiklikler bu kompleks sendromu katılabilir. Çeşitli modelleri, nöropatik ağrı ve tedavileri ^1-3 okuyan kemirgenler geliştirilmiştir.

Diyabette gözlenen polinöropati, periferik sinirler, merkezi yaralanmalar, trigeminal nevralji, kemoterapi, post-herpetik nevralji, vb ardışık nöropatilere için yaralanmaları taklit bilinen etiyolojilerin, nöropatik ağrı amaç modellere dayalı Farklı modeller kemirgenlerde periferik sinir yaralanması siyatik sinir odaklanın. Bu modeller, bir sıkıştırma ve / veya bu sinirin bir bölüm bağlıdır. Nitekim, siyatik sinir göreli kolay ameliyat tanıyor ve pençe çekme refleksleri dayalı testler için izin verir. Mokronik sinir sıkışmasının dels örneğin şunlardır: kronik sıkışma yaralanması (CCI) ^{4,5, 6-9} okşuyorlardı siyatik siniri, kısmi siyatik sinir ligasyonu (PSL) ^10, spinal sinir ligasyon (SNL) ^11, ya da ortak peroneal sinir ligasyonu ^12. "Kurtulmuş sinir hasarı" (SNI) olarak adlandırılan modeller de yaygın olarak kullanılmaktadır. Üçüncü şube ^13-15 bozulmadan Onlar, sıkı ligasyonu ve siyatik sinirin üç terminal dalların üzerinden iki axotomy oluşmaktadır. Siyatik siniri hedef nöropatik ağrı çeşitli modelleri, yaralı arka pençe üzerinde kronik mekanik alodinya (normal olmayan nosiseptif uyaran bir nosiseptif yanıt) sonuçlanabilir.

Burada, farelerde nöropatik ağrı "ağzı model" için ayrıntılı bir cerrahi prosedür tarif edilmektedir. Bu siyatik sinir ^6-9 ana dalı etrafına bir polietilen manşetin implantasyon oluşur. Thvon Frey filaman e kullanımı da tarif edilmektedir. Bu filamanlar, bu modelde mevcut olan bir uzun süreli bir nosiseptif belirtisidir mekanik alodinia değerlendirmesi izin verir.

Protokol

Protokoller "Comité d'éthique en matière d'deney animale de Strasbourg" (CREMEAS) tarafından onaylanmıştır.

Paw Çekilme eşiklerinin 1.. Baseline Ölçme

1. Fareler, test prosedürleri başlatmadan önce 2 hafta, en az 10 gün boyunca hayvan tesislere ortama alışmalarına izin verin.
2. Von Frey test set-up ve 4. bölümünde açıklanan von Frey prosedüre fareler alıştırmak.
3. Ameliyattan önce, bölüm 4.3 'de tarif edildiği gibi von Frey filamentleri ile mekanik pençe çekme eşikleri değerlendirir. Not: En az üç istikrarlı ardışık değerleri pençe çekme eşikleri elde edilinceye kadar ayrı günlerde işlemi tekrarlayın.
4. Bu gruplar, ilk olarak pençe geri çekme eşikleri arasında farklılık yok ki, farklı deney grupları için fareler atama.

Manşet İMPLANTASYONU 2. Cerrahi Prosedürüzerinde

1. Hayvan tartılır. Not: fare vücut ağırlığı aşağıda tarif manşon yerleştirme işlemi için 20 g üzerinde olması gerekir.
2. Ketamin (17 mg / ml) ve anestezi yaklaşık 45 dakika içerir% 0.9 NaCl, ksilazin (2.5 mg / ml) içeren bir karışım, 4 ml / kg 'lık bir intraperitoneal enjeksiyon ile hayvan anestezisi.
3. Cımbız ile bir arka pençe sıkarak pençe reflekslerinin olmadığını kontrol ediniz ve hayvan tam anestezi olduğundan emin olmak için göz reflekslerinin olmadığını kontrol ediniz.
4. Bir elektrik makinesini kullanarak, kalça diz sağ bacak tıraş.
5. Bir pamuk uçlu çubuk ile gözlere koruyucu göz sıvı jeli uygulayın.
6. Onun sol tarafında hayvan koyun ve küçük bir yastık üzerinde sağ arka bacağı yerleştirin ve yapışkan bant ile yastık sağ arka bacağını korumak.
7. Gazlı bez veya pamuk uçlu çubuk kullanarak klorheksidin ve% 70 etanol ile ameliyat alanında dezenfekte.
8. Işaret parmağı femur bulmak ve yapmak bir, yaklaşık 0.5 cm'lik bir kesi, femur femur ve yaklaşık 1.5 mm anterior paraleldir.
9. İki Otoklavlanmış sopalarla femur yakın kasları ayrı. Notlar: kas kesmeyin. Normalde, kas tabakaları, herhangi bir kanama olmadan kolayca ayırmak ve siyatik sinir sonra görülebilir. Kanama durumunda, kan emmek için steril pamuk uçlu bezi kullanın.
10. Ana dalı ortaya çıkarmak için, siyatik sinirin altında iki otoklava çubukları yerleştirin ve steril fizyolojik solüsyon (% 0.9 NaCl) ile sinir hidrat.
11. Bölünmüş PE-20 polietilen boru (manşet) sivri uçlu bir çelik sopa yardımıyla ve bulldog kelepçe ile, 0.38 mm ID / 1.09 mm OD, ve önceden hazırlanmış steril 2 mm bölümünü tutun.
    1. Hafifçe açılacaktır, manşet içine sivri çelik çubuk yerleştirin.
    2. Manşon yanal açıklığa kullanarak, manşet bir ucunda Bulldog yerleştirin ve manşet paraleldir. O tarafından manşet yapacak, böylece bulldog (180 °) döndürünyan açıklığa terstir tarafı. Bulldog kapatın ve sivri çelik sopa kaldırın. Not: rotasyon tutan-on manşet yerleştirilmesi için optimize edilmiş bir pozisyonda, bulldog kelepçe de kısmen açık manşet korumak için yardımcı oluyor izin vermek için yapılır. Bu model ile Bulldog kelepçenin büyüklüğü prosedürün Bu aşama için kritik öneme sahiptir.
12. Ikinci bir deneyci sinir altında iki sopa tutun ve yavaşça yaklaşık 4 mm uzunluğunda siyatik sinirin bir bölümüne erişimini kolaylaştırmak için sopa ayrı var.
13. Kalça proksimal sinirin parçası etrafında bulldog uzak olan manşet kısmını takarak başlayarak, siyatik sinirin ana dal etrafında 2 mm manşeti takın.
14. Tüpün sıkma şeklinde veya değiştirmeden, pense ile iki uzak tarafta basınç uygulayarak yavaşça manşeti kapatın. Doğru kapalı olduğundan emin olmak için manşet çevirin.
15. Tıraşlı cilt tabakası zekâ dikinh cerrahi knot.
16. Temiz bir evde kafes içinde sol tarafta fare yerleştirin. Fare uyanık kadar ısı lambası altında tutun.
17. Ilave su ve ev kafes doğrudan biraz yemek yer.

Sham Kontrolleri için 3. Cerrahi Prosedür

1. Adımları 2,15-2,17 ile izleyin, 2.9 adım adım 2.1, yukarıda tarif edildiği gibi aynı ameliyat prosedürü uygulayın. Sahte kontroller için 2.14 sadece endişe manşet ekleme adımlarını 2.10 atlarsanız.

4.. Von Frey testi

1. Düz paslanmaz çelik (1 mx 50 cm, perforasyon sınırları arasında 2.5 mm ile 5 mm daire delikler) arasında yüksek bir delikli plaka, açık delikli bireysel kutuları (7 cm x 9 cm x 7 cm) 'de farelerin yerleştirin. Not: En fazla 12 farenin eşzamanlı Bu set-up test edilebilir. Operated hayvanlar ameliyattan bir gün sonra test edilebilir. Ancak, kurtarma 3 gün gözlenen cerrahi sonrası aşırı duyarlılık azaltmak için tavsiye edilirsahte kontrolleri.
2. Hayvanlar testten önce 15 dakika boyunca ortama alışmalarına izin verin.
3. Artan kuvvetleri bir dizi, her bir arka pençenin plantar yüzeyine von Frey filamentleri uygulanır. Notlar: von Frey filamanları kalibre çaplarda plastik kıllar bulunmaktadır. Bunlar, 5 cm uzunluğunda ve elle tutulan aplikatörler sabitlenir. Filament uygulamanın hızı, bükme ve uygulama süresi derecesi bu test ³ ile elde edilen eşik değerleri etkileyebilir. Farelerde, bu prosedür ile, en sık kullanılan filamanlar 0.16, 0.4, 0.6, 1, 1.4, 2, 4, 6, 8, ve 10 gr arasındadır.
   1. Filaman sadece eğilir kadar sol pençenin plantar yüzeyine seçilen filament uygulanır. Yordam 3-5 kez arka arkaya tekrarlayın ve sonra sağ ayağının için aynı şeyi. Filaman her iki ayak üzerinde test edilmiştir, bir sonraki hayvan test edin. Notlar: daha duyarlı olabilir pençe yanal sınırları kaçının. Beklenen yanıt bir pençeçekilme, ani kaçınma veya yalama. En az üç beklenen tepkiler beş çalışmaların dışında dikkat edilmesi halinde olumlu yanıtı düşünün. Belirli bir pençe her zaman üç kez test edilmiş, ancak dördüncü ve beşinci denemeler yapılır sadece 1 veya 2 yanıt (lar) ilk üç testler sırasında gözlemlenen () idi edilir. C57BL/6J fareler olarak, 1.4 g filament ile, operasyon öncesi testleri başlar. Ameliyattan sonra, 0.4 g filament ile testler başlar. Olumlu bir yanıt ilk test filament ile gözlenir, adım 4.3.2 (yerine, daha yüksek) daha düşük güç bir filaman test edin.
   2. 4.3.1 prosedüre göre sonraki hayvanlara aynı filament uygulanır. Tüm hayvanlar test edildikten sonra, daha fazla kuvvet sonraki filament ile ilk hayvan yeniden başlar. Tüm fareler olumlu bir yanıt vermek kadar işlemi tekrarlayın. Notlar: Test Her hayvan iki ardışık filamentler olumlu bir yanıt vermek kadar. Pençe zekâ gibi olumlu yanıt verdi alt filamanın gram değerini düşününBu hayvan için hdrawal eşik.

Sonuçlar

± SEM olarak veriler ifade edilir. İstatistiksel analizler varyans çok faktörlü analizi (ANOVA) veya deney tasarımına uygun olarak çiftlenmemiş t-testi kullanılarak yapıldı. Bu analizler için, Sham ve Manşet cerrahi grupları yanı sıra ilaç tedavileri vs tuzlu arası grup faktörler olarak kabul edildi. Uygun olduğunda, tekrar ölçmek analizler zaman süreci verileri için kullanılmıştır. Post-hoc karşılaştırmalar Duncan testi kullanılarak yapıldı. İstatistiksel anlamlılık p <0.05 olarak kabul edildi.

, Yukarıda tarif edilen prosedürler kullanılarak zaman, bir ipsilateral alodinya olarak manşon implantasyon sonuçları Şekil 1 'de gösterildiği gibi. Fare test prosedürüne alışmış sonra, von Frey testi pençe çekme eşikleri için değerler, zaman içinde stabil olan ve Sham hayvanlarda gösterildiği gibi, tek başına cerrahi prosedürün etkilenmez. Ancak olmalıdırbir geçiş ameliyat sonrası alodinia genellikle Sham farelerde gözlenebilir kaydetti. Örneğin allodini mevcut olduğunda, pençe geri çekme tepkisi bir kaç gün sonra, ameliyat sonrası başlangıç ​​değerine geri döner. Manşet farelerde, ipsilateral alodini ilk gün sonrası cerrahi zaten mevcut ve fazla 2 ay süreyle muhafaza edilir (bkz. 9 ve Şekil 1; F8, 344 = 29.5, p <0.001). Yukarıda tarif edildiği gibi bu von Frey testi ile ölçüldüğünde, manşet kaynaklı alodinia C57BL/6J fareler ipsilateral kalır, ancak diğer durumlarda karşı taraftaki pençe allodini bir varlığı da ⁸ gözlenebilir. Taban için mutlak değerler, C57BL/6J fareler, 4 ve 6 g arasında, genellikle, ancak test protokolü bu değerleri etkileyebilir.

Trisiklik antidepresanlar, nöropatik ağrı için klinik birinci basamak tedaviler arasındadır. Bu modelde, trisiklik antidepresan ilaç nortriptilin (5 mg / kg, karın içinden, günde iki kez) rŞekil 2'de gösterildiği gibi, tedavi yaklaşık 2 hafta sonra nöropatik allodini elieves (F7, 91 = 15.3, p <0.001, post-hoc (CuffNor = Sham)> CuffSal p <0.001 gün 29-34). Bu dozda, antidepresan akut analjezik hareket ^16,17 görülmektedir. Bu tür ilaçları kullanan hastalarda mevcut süreli ağrı kesici taklit etmek, fareler sonrasında değil sabah ilaç verilmesinden önce test edilebilir. Böyle bir prosedür tedavi, önceki gün ile astarlanmalıdır uzun süreli etkisinin değerlendirilmesini sağlar. Bu durumda, bu nöropatik alodinia bir uzun süreli rahatlama gözlemlemek için tedavi 1-2 hafta gereklidir. Tedavi kesildiğinde, bir nüks genellikle 3-4 gün ¹⁸ içinde görülmektedir. Bazı antidepresanlar yanında, gabapentinoids nöropatik ağrı için diğer ilk tercih tedaviler vardır. Gabapentin Bu modelde ¹⁶ bir akut ve geçici bir analjezik etkiye sahip, ama aynı zamanda bir gecikmeli ve lon görüntüler g-süreli (Şekil 3, p <0.001), ilacın verilmesinden önce her gün hayvan test ederken antialodinik eylemi. Bu eylem antidepresan ilaçlar ile daha hızlıdır.

Istikrarlı bir temel (baz grafik üzerinde alanına 0 temsil edilir) ürün elde edilene kadar, farelerde nöropatik ağrı manşet modelinde Şekil 1. Mekanik pençe çekme eşikleri. Yetişkin erkek C57BL/6J fareler, von Frey prosedüre alıştırılmıştır. Her iki pençeleri test edilmiştir. Alçaltılmış pençe çekme eşikleri (grup başına n = 10) ile gösteriyordu Cuff farenin ipsilateral mekanik allodini görüntüler.

tp_upload/51608/51608fig2.jpg "/>
Bir trisiklik antidepresan Şekil 2.. Gecikmeli antialodinik etki. Iki hafta ameliyat sonrası sonra, farenin grup başına% 0.9 NaCI ya da 5 mg / kg nortriptilin hidroklorür (n = 5 ya da 6 ya da birlikte günde iki kez (sabah ve akşam) intraperitoneal tedavi .) Von Frey testi sabah tedavi öncesi yapıldı. Bu işlem ile, nortriptilin gecikmiş bir antialodinik etki tedavi yaklaşık 12 günü gerektirir, görülmektedir.

Bir gabapentinoid Şekil 3. Antiallodinik action. Üç hafta ameliyat sonrası sonra, farenin% 0.9 NaCI ya da 10 mg / kg gabapentin (grup başına n = 5) ya da günde iki kez (sabah ve akşam) intraperitoneal tedavi. Von Frey testi sabah tedavi önce yapıldıment. Bu işlem ile, gabapentinin bir geciktirilmiş ve kalıcı bir antialodinik etki görülmektedir. Veri tedavi başlamadan önce ve tedavi 6. gününde sunulmaktadır.

Tartışmalar

"Ağzı" modeli, ilk olarak siyatik sinir çevresine birden çok ⁶ ağızlarının implantasyonu ile standart ve tekrarlanabilir kronik sıkışma yaralanması elde etmek için farelerde geliştirilmiştir. Daha sonra bazı araştırma grupları yine birden manşet ekleme ^19-22 kullanmak bile, tek bir manşet ^7,8 implant için güncellenmiştir. Daha sonra transgenik hayvanlar kullanma imkanı açılmış farelere ^9,23, uyarlanmıştır. Manşet, genellikle 2 mm uzunluğunda, ancak diğer uzunlukları aynı zamanda sıçanlarda ²² kullanılmıştır. Polietilen boru türlere bağlıdır: farelerde ⁹ PE-20, ve farelerde ^{PE-60, 24,25} ya da PE-90 ^7,8,26,27.

Mekanik alodinia von Frey saçları ile ölçülür. Bu testte, pençe çekme eşikleri için mutlak değerler, hayvanın ya da ^{3, 28,} bükme filamanın süresi üzerine üzerinde durduğu yüzeye bağlı olabilir, ancak bu faktörlerin yoknöropatik alodinia algılama etkiler.

"Manşet" model nöropatik ağrı mekanizmalarının çalışması için ilgi. Bu miyelinli ve miyelinsiz lifler ^6,29, ve duyusal nöronlar, birincil afferentlerinden ve spinal nöronların ^{19,21,22,30-35} fonksiyonel değişiklikler morfolojik değişiklikleri incelemek için kullanılmıştır. Bu glial aktivasyon ve nöronal anyon degrade merkezi bir kayma aktivite ve spinal nosiseptif nöronların yanıtları ve nöropatik alodinya ^24,36-38 değişikliklere katılmak gösteri izin verdi. Opioid reseptörlerinin ^16,42-45 ve nikotinik reseptörlerin ⁴⁶ glutamat reseptörlerinin ^7,39-41 gibi bir etkisi de, bu modelde incelenmiştir.

Modelin bir diğer ilgi nöropatik ağrı, yani., Gabapentinoids ve antidepresanlar mevcut tedavilere olan yanıttır. Benzer klinik gözlemler: gabapentinoids a hem de gösterilecekn, yüksek dozda akut kısa süreli analjezik işlemi ve uygun bir dozda inhibitörleri akut ağrı kesici etkisi muamele, trisiklik antidepresanlar, seçici serotonin ve noradrenalin geri alım birkaç gün sonra gözlemlenmiştir ama giderici gecikmeli sürekli göstermek bir gecikmeli sürekli hareket giderici 1-2 hafta tedavi ve seçici serotonin geri alım inhibitörü olan fluoksetin gerektirir hareket ¹⁶ etkisizdir. Model hastalar ^48-51 sınamak için yeni tedavi hedefleri ortaya çıkarabilir, bu bakımlarla ^{16-18,44,45,47} altında yatan moleküler mekanizmayı incelemek uygun olur.

Son olarak, model aynı zamanda, nöropatik ağrının anxiodepressive sonuçlarından çalışma sağlar. Klinik olarak, bu sonuçların nöropatik ağrı hastalarının yaklaşık üçte etkileyebilir ancak klinik öncesi daha az ağrı duyusal açıdan daha incelenmiştir. Bu modelde, anksiyete ve depresyon gibi bir zamana bağlı gelişimisive gibi fenotipleri mevcut ⁵² ve ilgili mekanizma böylece ele alınabilir.

Nöropatik ağrı, bu fare modelinde standart manşet ve işlemleri mekanik alodini için düşük bir değişkenlik neden olur. Genetik olarak tadil edilmiş hayvanlar ^{17,18,44-47,52,} uzun süreli allodini kullanımı olasılığı, klinik olarak kullanılan tedavilere yanıt ve anxiodepressive semptomların zamana bağlı gelişimi, çeşitli yönlerini çalışma için bu model daha uygun hale getirmek ve Zaten araştırma bu alanda değerli bilgiler getirdi nöropatik ağrı ve tedavileri sonuçları.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
PE-20 polyethylene tubing	Harvard Apparatus	PY2-59-8323	Splitted before surgery
Ketamine	Centravet	IMA004
Xylazine HCl	Sigma	X1251	Freshly prepared before surgery
Ocry-gel	Centravet
Pliers	FST	11003-12	52.5 mm straight
Bulldog clamp	FST	p130 18038-45
Perforated plate	CTTM
von Frey filaments	Bioseb	NC-12775