Fare Beyin Çeşitli Bölgelerinde Telomeraz Aktivite: Radyoaktif olmayan Telomeraz Amplifikasyon Protokolü tekrarlayın (TRAP) Deneyi

Özet

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

Özet

Telomeraz, bir ribonükleoprotein, telomer uzunluğu muhafaza ve dolayısıyla genomik bütünlüğü, çoğalmasını ve ömrünü teşvik sorumludur. Nöronlar gibi mitotik olmayan, son derece aktif hücreler için hayatta kalan olası önemini göstermektedir, ilave olarak, telomeraz gibi oksidatif stresten mitokondri korur ve apoptoza direnç kazandırmaktadır. Daha önce çeşitli fare beyin bölgelerinde telomeraz aktivitesi ve ekspresyonunu artırmak ve oksidatif stres motor nöronlar hücreleri korumak için yeni telomeraz aktivatörlerinin yeteneğini gösterdi. Bu sonuçlar telomeraz çeşitli lezyonlar gelen nöronların korunması dahil olduğu görüşünü güçlendirmektedir. Beyinde telomeraz rolünü vurgulamak amacıyla, burada erkek ve dişi fare beyninde telomeraz aktivitesini ve yaş olan bağımlılığını karşılaştırın. TRAP yönteminin çeşitli dokular veya hücre hatlarında telomeraz aktivitesini tespit etmek için standart bir yöntemdir. Burada analı göstermekCHAPS kullanılarak protein çıkarımı ile denatüre edici olmayan fare beyninin üç bölgede telomeraz aktivitesi sis, standart TRAP modifikasyonu ile, ardından tampon lisis.

Bu 2-aşamalı bir deneyde, endojen telomeraz TTAGGG 6 bp'lik bir tekrar (telomeraz reaksiyonu) ekleyerek belirli bir alt-tabaka, telomeraz (TH primer) ilerlemektedir. Telomeraz reaksiyonu ürünleri 6 bp'lik fazlalıklarının bir DNA merdiveni oluşturarak bir PCR tepkimesi ile yükseltilir. DNA merdiveni analizi son derece hassas bir nükleik asit boyası ile boyandı, ardından% 4.5 yüksek çözünürlüklü agaroz jel elektroforezi ile yapılır.

^32P DNA tespiti ve DNA merdiveni çözülmesi için poliakrilamid jel elektroforez için radyoaktif dCTP etiketlenmiş kullanabilecektir geleneksel TRAP ile karşılaştırıldığında, bu protokol, fare beyninin telomeraz aktivitesini değerlendirmek yeteneğini göstermek için TRAP tasarruf toksik olmayan bir zaman sunar telomeras farklılıkları tespitÇeşitli dişi ve erkek fare beyin bölgesinde aktiviteye sahiptir.

Giriş

Telomeraz telomeraz bir ribonükleoprotein oluşan ters transkriptaz (TERT), telomeraz katalitik alt birimi, ve bir RNA bileşen (TERC) 'dir. Telomeraz kanonik rolü, bu nedenle genomik bütünlüğü ve hücre proliferasyonunu ¹ teşvik telomerik uçlarına tekrar dizileri (TTAGGG) eklenerek telomerlerin uygun uzunluğunun korumaktır. Bu çeşitli zarar verici madde ² ile uyarılan apoptoza karşı direnç kazandıran, yani başka roller de, hücrelerde TERT atfedilmiştir oksidatif stres ³ insan mezenkimal kök hücrelerini koruyan ve pozitif RNA TIA1 ile olan ilişkisi ile tam olarak farklılaşmış nöronların hayatta kalma yanlısı bir rol oynar granüller ^4.

Enzim ekspresyonu ve aktivitesi düzeyleri sıkı Bölünmeyen hücreler ^5,6 olarak düzenlenmiş olsa da, TERT, ifade edilen ve daha çok somatik bölünen hücreleri ve kanser tiplerinin çoğunda aktif bir biçimde gösterilmiştir. Çalışmalar r göstermiştirTERT mRNA, erişkin ⁷ içine daha düşük düzeyde muhafaza edilirken Odent beyin, telomeraz aktivitesi, doğum sonrası 10. günde fark edilemez hale gelecektir. Diğer çalışmalar yetişkin alt-ventriküler bölge, koku ampul, hipokampus içinde telomeraz aktivitesini gösterdi ve yetişkin beyincik ve kortekste ^8. , Enjekte edilen fareler SOD1 transjenik amiyotrofik lateral skleroz hastalığının başlamasını ve ilerlemesini yavaşlattığı - Yakın zamanda beyin ve omurilik telomeraz ekspresyonunu ve aktivitesini de artırır yeni bileşikler, N-metil-D-aspartat (NMDA) nöro-koruyucu etkiler üretmiştir göstermiştir fare ve bu farelerin ⁹ omurilikteki motor nöronların hayatta kalma artmıştır. Tam nöronlarda ve beyinde telomeraz pro survival rolünü anlamak için, beynin farklı bölgelerinde telomeraz aktivitesinin tespit edilmesi için basit, hızlı ve nispeten hassas bir analiz geliştirmek için gereklidir.

Telomerik rEPEAT amplifıkasyon protokolü (TRAP) sıraları düzenlenmiştir telomeraz aktivitesi kanonik ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) birleştiren bir iyi bilinen hassas bir deneydir. Bu deneyde, telomeraz TTAGGG telomeraz substrata TH ters primeri kullanılarak 6 baz çifti (bp) DNA merdiveni oluşturur PCR amplifikasyonu takiben (TH astar) oligonükleotid, tekrar ekler -. ACX ^32P dCTP etiketli en tespit etmek için kullanılır PCR ürünlerinin, düşük miktarda. DNA merdiveni dizileme poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile çözümlenir. Her iki DNA bantların yoğunluğu ve DNA merdiven uzunluğu, aktif enzim moleküllerinin miktarını ve işlem kapasitesi, sırasıyla ¹⁰ yansıtmaktadır.

Bu geleneksel tahlil bazı önemli zorluklar tutar: (gecede her iki durumda) sıralama PAGE ve jel çalışan zaman tüketimi ve radyoaktif ürünün filmi pozlama işlemek için büyük ve sert radyoaktif maddelere maruz kalma tehlikesi.

Bu protokol, gelişmiş bir radyoaktif olmayan bir agaroz mini jel bazlı bir deney sağlar. DNA, 6 bp'lik bir basamağı% 4.5 yüksek çözünürlüklü agaroz jel kullanılarak çözümlenir ve algılama son derece hassas bir nükleik asit leke kullanılarak başarılabilir. Agaroz mini yüksek çözünürlük jel ve duyarlı nükleik asit leke kullanılarak kombinasyonu, analizi kullanımı kolay sunar radyoaktiviteye maruz tehlikesini bertaraf eder ve önemli bir kaç saate kadar 3 gün genel deney süresini kısaltır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvan deneyleri Ben-Gurion Üniversitesi'nde (IL-39-08-2010) hayvan deneyleri için etik kurul tarafından onaylandı.

1. Fare Beyin Protein Ekstraksiyonu

1. Her bir buz üzerinde 5 mi Ringer çözeltisi ve yeri içeren tüplerde 15 ml 3 tüpleri hazırlayın.
2. (DİKKAT - kimyasal kaput kullanmak) İsofloran anestezi kullanarak fare Kurban servikal dislokasyon ve hemen dekapitasyon 10-20 sn.
3. Kafatası beyin çıkarın ve beyin dokusunda hasar görmesini önlemek için buz gibi soğuk Ringer solüsyonu ile bir kaç saniye için durulayın.
4. Cerrahi bıçak kullanılarak, frontal korteks beyincik (CR) ve sapı (BS) ayırır. Sonra, beyin sapından beyincik ayırmak ve frontal korteks, frontal lobu (FL) kesilmiş; frontal lob koku ampulü çıkarın. Belirlenen, 15 ml tüpler içinde 3 beyin bölgelerinin yerleştirin.
5. Her bir tüp içinde doku homojenize edilir. Fr EkleESH, buz soğukluğundaki Ringer solüsyonu, her bir tüp, 800 xg da 7 dakika için aynı hacim ve santrifüj içerir.
6. Süpernatantı ve her tüp CHAPS lizis tamponu 100 ul ekleyin. , Bir 21 G iğne ile bir 1 ml şırınga ile çözelti, birkaç kez (~ 10) geçirilerek, iyice karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
7. 13,000 x g'de 30 dakika boyunca yeni bir mikro santrifüj tüpüne ve santrifüj tüpünün her aktarın. Yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır ve süpernatan, önceden belirlenmiş bir yöntem kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. -80 ° C'de 10 ul alikolar içinde protein muhafaza edilir.

Araçların, Reaksiyon Çözümleri ve Protein Sulandırma Hesaplamaları 2. TUZAK Testi Hazırlık

1. Protein ekstresi seyreltilerde ve telomeraz reaksiyon tamponu için etiketli mikro-santrifüj tüplerine uygun sayıda hazırlayın. Kontaminasyonu önlemek için filtre ipuçlarını kullanarak protokoldeki tüm pipetlenmesini gerçekleştirin.
2. TRAP Reaksiyon karışımı 10x TS astar, dNTP'ler, Ultra saf su ve protein ekstreleri (reaktif ve reaktif konsantrasyonları için malzeme tabloya bakınız): buz aşağıdaki çözümleri çözülme.
3. Ultra saf su (Ultra saf su) ile 1 mg / ml nihai konsantrasyona kadar bir protein ekstresi çözeltisi ile seyreltilir.

3. Reaksiyon Telomeraz

1. Bir mikro santrifüj tüpüne aşağıdakiler eklenerek telomeraz reaksiyonu karışımı hazırlayın: 2 ul TRAP karışımı (10x), 1 ul TS primer (0.1 ug), 1 ul dNTPs (10 mM) ve 15 ul UPW. Çoklu örnekler için, numuneler, artı 1 sayısına göre yukarıda sözü edilen birimler çarpın.
2. Her reaksiyon tüpüne, reaksiyon karışımı 19 ul ve 20 ul son hacim için, her bir tüpe seyreltilmiş protein ekstresi (1 ug protein) 1 ul.
3. 45 dakika süre ile, 30 ° C'de önceden ısıtılmış bir su banyosu içinde, reaksiyon tüpleri yerleştirin.

4. PCR Reaksiyonu:

1. Onbeş milACX astar, Titanyum Taq Buffer, UPW: n telomeraz reaksiyon sonundan önce, aşağıdaki çözümleri eritin.
2. 2.5 ul Titanyum Taq Buffer (10x), 1 ul ACX astar (0.1 ug), 2 ul (IC kullanıldığında 1 ul) UPW ve 0.5 ul Titanyum Taq Polimeraz: mikro-santrifüj tüpüne aşağıdaki ekleyerek PCR reaksiyon karışımı hazırlayın (50x). Çoklu örnekler için, numuneler artı 2 sayısına göre yukarıda sözü edilen birimler çarpın.
3. PCR 6 ul her bir PCR tüpü 26 ul karıştırmak ve bir son hacim için her bir tüpe telomeraz reaksiyonu (20 ul), tüm birimi ekleyin.
4. Bir PCR termo döngü cihazı için PCR tüpleri yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın:
   - 90 ° C - 2 dk.
   - 94 ° C - 30 san. *
   - 60 ° C - 30 san. *
   - 72 ° C -. 45 sn *
   - 72 ° C - 2 dk.
   -20 ° C'de muhafaza PCR ürünleri.
   * = 34 devir

5. Agaroz Mini-gel Hazırlama, Örnekleri Koşu ve Jel Boyama

1. 25 ml soğuk tampon maddesi elektroforezi (TBE) ve tampon solüsyonu 2-4 kez hacminin yavaş yavaş yüksek çözünürlüklü (HR) agaroz toz halinde 1,125 g çözelti hızlı bir şekilde karıştırılır iken serpmek, bir cam kaba, bir karıştırma çubuğu ilave edin . Karıştırma çubuğu çıkarın, havalandırma için küçük bir delik plastik bir şal ve delgi ile beher kaplayın. Daha sonra 3 dakika boyunca "düşük" güç mikrodalga beher ısıtın ve "Yüksek" güç anahtarı ve dökülmesini neden değil itina ile kısa bakliyat çözüm ısıtın. Isıtılarak oluşturulan köpük, birkaç saniye sonra, büyük kabarcıklar haline gelir ve kaybolur, agaroz hazır olduğuna dikkat edin.
2. Jel, oda sıcaklığında katılaşan sonra jel, kullanımdan önce 4 ° C'de 20 dakika boyunca soğuk izin yatay mini jel cihazına jel döküm.
3. 25 TUZAK numune ul (20 ul TRAP PCR ürünlerinin ve 5 ul 6x jel yükleme boyası) ile her şerit yerleştirin ve 11 çalıştırmak4 ° C soğuk oda içinde 3 saat boyunca 0 V.
4. 15 ul 10,000X nükleik asit leke, 0.1 M NaCl (0.29 g) ile 50 ml iki defa destillenmiş su (DDW) stok çözeltisi eklenerek çalışma çözeltisi nükleik asit lekesi 3x hazırlayın. Nazik çalkalama ile 20 dakika boyunca jel Leke.
5. TRAP merdiven DNA bantları görmek için 302 nm dalga boyunda UV transilluminator kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Tüm hücre protein için 1 ve 3 aylık yaş 3, CD-1 erkek ve 3, CD-1 erkek fareler türetilen, frontal lob (FL), beyin sapı (BS), serebellum (CR) hazırlanmıştır modifiye TRAP tahlil ve radyoaktif TRAP eski 2 aylık yaşta 3 CD-1 erkek fareler. Telomeraz aktivitesi modifiye TRAP deneyi kullanılarak ayıkla 1 mcg proteinler tespit ve 2 mcg proteinler radyoaktif TRAP için ayıklamak edildi. Radyoaktif TRAP ile ve modifiye TRAP ile telomeraz aktivitesinin tespiti 1C genel DNA merdiveni

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

PCR 4 ile telomeraz reaksiyonu 3) telomeraz reaksiyon ürünlerinin amplifikasyonu - beyin dokusu 2) spesifik bölgelerinden 1) proteinlerinin ekstre Telomeraz suretiyle, primer uzaması TS: TRAP ile fare beyin telomeraz aktivitesi analizi 4 ana adımdan oluşur yüksek çözünürlüklü agaroz jel kullanılarak, PCR-ürünlerinin) ayrılması.

DNA merdiveni ve PAGE PCR ürünleri ayırma hassas bir şekilde tespit radyoaktif dCTP 'lerin kullanımı: Bu değiştirilmiş TRAP yönteminin...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRAP Mix (10x)			Made manually, mix the following in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from Sigma). Aliquots are frozen at -20 °C.
Ringer's solution			Made manually, mix the following in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous.
Isoflurane	Minrad INC.	NDC 60307-110-10	Handle with care in a chemical hood
dNTPs (10 mM)	Sigma	D7295
TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3')	Sigma		DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration
ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3')	Sigma		DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration
Titanium Taq Polymerase/Buffer	Clontech	S1792/S1793
High Resolution agarose	Sigma	A4718	Any high quality high-resolution agarose may be sutible
Mini-gel apparatus	Bio-Rad	170-4466
Nucleic Acid Stain (GEL-RED)	Biotium	41003
IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3')	Sigma		DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration
CHAPS lysis buffer	Cell Signaling Technology	9852S	Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1 mM
Ultra Pure Water (UPW)	Biological Industries	01-866-1B
CD-1 mice	HARLAN Laboratories INC.