Whole Sırasının NGS Analiz için bir transpozaz tabanlı Technology tarafından gDNA Zenginleştirme<em&gt; BRCA1</em&gt;<em&gt; BRCA2</emDNA Hasarı Onarım ilgilendim&gt; ve 9 Genler

Özet

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

Özet

Yeni Nesil dizileme yaygın kullanımı kanser araştırmaları ve tanı için yeni yollar açtı. NGS büyük kanser yeni miktarlarda veri ve özellikle kanser genetiğini getirecektir. Mevcut bilgi ve gelecekteki keşifler gerekli kansere genetik yatkınlık rol olabilir genlerin büyük bir dizi çalışma yapacak. Bu amaçla, DNA hasarı tamir katılan 11 komple genlerin çalışma NextEra bir tasarım geliştirildi. Bu protokol güvenle, aynı anda 24 hastada 11 genler (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 ve TP53) promoterinden 3'-UTRsine incelemek için geliştirilmiştir. Transposaz teknoloji ve gDNA zenginleştirme dayanan bu protokol, çoklama, örnek genetik tanı sayesinde zaman açısından büyük bir avantaj sağlar. Bu protokol, güvenli bir şekilde, kan gDNA kullanılabilir.

Giriş

2010 yılında, (esas kadın) yaklaşık 1.5 milyon kişi meme kanseri gelişmiş. Bu vakaların% 5-10 kalıtsal olduğu tahmin edilmektedir. Kalıtsal meme ve yumurtalık kanserlerinde ¹ katılan neredeyse 20 yıl önce, BRCA1 ve BRCA2 tespit edilmiştir. 15 yıl öncesine kadar, BRCA1 ve BRCA2 kodlama bölgeleri, meme ve yumurtalık kanseri genetik yatkınlık belirlemek için dizilenmiştir. BRCA1 ve BRCA2 değişiklikler, bu bölgelerin yapılan analiz, etkin taraması için yeterli olmadığını göstermektedir seçilen ailesine ^2'nin 10-20% olarak tespit edilir. Son zamanlarda, BRCA1 ve BRCA2 olmayan kodlama dizileri (promotör, intronlu 3-'UTR) analizi yeni mutasyonlar / çeşitleri meme kanseri ^3-6 daha yüksek bir risk ile bağlantılı olabileceğini vurguladı.

BRCA1 ve BRCA2 proteinleri (homolog rekombinasyon tamir katılmaktadırlarSayısız partnerle ⁷ tamamlanır HHR). BRCA1 veya BRCA2 değişiklikler DNA onarımı kusurları neden olurken, diğer ortaklar da meme kanseri riskini etkileyebilir. Bu hipotez BRIP1 beri ⁸ valide edilmiş görünüyor ve PALB2 ⁹ sırasıyla, serviks ve meme kanseri üzerinde kanıtlanmış bir etkisi var. Buna ek olarak, diğer iki "orta riskli" meme kanseri yatkınlık genleri, ATM ve CHEK2, ayrıca rutin ¹⁰ incelenebilir.

Bu çalışmalardan elde ardından, biz aynı anda nispeten çok kolay ve kullanan 24 hastada 11 genleri (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 ve TP53) analiz etmek için bir protokol geliştirmeye karar verdi orta çıktı aygıtında zenginleştirme ve sıralama ile transposaz teknolojisine dayalı hızlı protokol,. TeşekkürlerBu teknik için, 2500 bp'lik bir intronik bölgeleri dahil verildiği RAP80, (: 176,381,588-176,390,180 CHR5) hariç olmak üzere, 3'-UTR sonuna promotörün başlangıç ​​aşamasında tam genleri dizildi. Bu 2.734 problar ile çalışıldı yaklaşık 1.000.300 bp toplam temsil eder. Genellikle, BRCA1 ve BRCA2 egzonik dizileri az 20 hasta için 1.5 ay ihtiyaç Sanger dizileme ile analiz edilmektedir. Mevcut protokol (Şekil 1) ile, aynı zamanda, fazla 75 hasta için 11 tam genler analiz edilebilir.

Protokol

GDNA'sından 1. Değerlendirme (genomik DNA) Verim

1. Taze kütüphane hazırlanmasından önce gDNA ekstre niceliğini. (GDNA verim değerlendirmesi için bir spektrofotometre kullanmaktan kaçının) sağlam gDNA ölçmek için florometrik verim değerlendirme yöntemi kullanın. (260/280 nm) oranını ölçmek ve NOT 1.8 arasında ve 2. o olduğundan emin: gDNA'sından 50 ng deney için gereklidir.

2. gDNA Zenginleştirme: 1. Gün, Sabah

1. Başlamadan Önce
   1. DNA zenginleştirme kiti DNA tamponu (TD) ve buz üzerinde DNA enzim (TDE1) çözümleri çözülme, (Malzeme / Ekipman bkz: İçindekiler). En az 30 dakika kullanılmadan önce saflaştırılması manyetik boncuklar getirmek ve hedef (ST) dur, oda sıcaklığında (RT) tamponu. Numune ile kaplama, ul doğrudan 96 oyuklu bir plakaya / 2-2,5 ng 1 gDNA örneğin 20 ul ekle. ÖNEMLİ: protokolü (bilinen dizisi varyasyon numune) doğrulamak için bir pozitif kontrol kullanın.
2. Tagmentation
   1. Mix tüm iyice 5x tersini reaktifleri ve aşağı doğru döndürün kısaca. Oda sıcaklığında, TDE1 tamponu her oyuğa gDNA 50 ng (20 ul) ihtiva eden ve daha sonra 5 ul TD tamponu 25 ul ekle. Yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle, 50 ul pipet ayarlayın.
   2. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca bir yapıştırıcı film ve santrifüj ile kapak plakası. Sonra, bir PCR plakasını (100 ° C'de ısıtılmış kapağını) yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: 5 dakika 55 ° C ve sınırsız bir süre için 10 ° C.
   3. Bu kuluçka sırasında kullanılacak dizin tanımlamak için Deney Manager yazılımı ile örnek levha hazırlanır.
3. Arıtma Tagmentation
   NOT: Bu adım önemlidir. Çok dikkatli olun.
   1. Arıtma manyetik boncuk ve ST tamponu çökelti olmaması için kontrol edin. Çökeltiler varsa, elinde çözümler ısınmak. Buz üzerinde yeniden süspansiyon haline çözülme tamponu (RSB).
   2. Oda sıcaklığında, girdap ST çözeltisi ve eklemeIçeren her bir numune için 15 ul. Yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle, 65 ul pipet ayarlayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca plaka ve santrifüj örtün.
   3. Her bir çukura önceden karıştırılmış olan arıtma manyetik boncuk 52 ul ekle. Nazikçe, 117 ul pipet ayarlayın yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca plaka ve santrifüj örtün.
   4. Yapışkan filmi çıkarın. Oda sıcaklığında 2 dakika için bir manyetik stand üzerine 96-yuvalı plaka koyun. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun.
   5. (24, numuneler için, 8 ml etanol damıtılmış su ilave 2 ml) taze% 80 etanol çözeltisi hazırlayın. Çıkarın ve boncuk rahatsız değil süpernatant özen atın.
   6. Manyetik stand üzerinde plaka tutarken, boncuk bozmadan, her bir oyuğa taze hazırlanmış% 80 etanol içinde 200 ul ve en az 30 saniye boyunca plaka inkübeoda sıcaklığında karıştırılmıştır. Süpernatantı atın ve bu yıkandıkları ikinci kez tekrarlayın. Etanol sağlamak kaldırıldı. 10 dakika boyunca ya da etanol buharlaşana kadar oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
   7. Manyetik stand plakasını çıkarın ve RSB tampon 22.5 ul ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle, 22.5 ul pipet ayarlayın. Manyetik stand üzerine 96-yuvalı plakayı ve 2 dakika süreyle inkübe edilir. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun. Yavaşça yeni bir 96 oyuklu bir plaka içerisinde süpernatan 20 ul transfer.
      Not: İsteğe bağlı olarak, bir fragman analizi kullanılarak tagmented numunelerin boyutunu belirler. Bunun yerine, yukarıda belirtilen adımları, yüksek çözünürlüklü akrilamit jel elektroforezi kullanın. Fragments 150 bp ve 1000 bp arasında olmalıdır.
4. ^1. PCR Büyütülmesi
   1. Buz üzerinde polimeraz (LP-PMM), Endeks 1 astar ve Dizin 2 astar çözümler içeren çözülme PCR master mix. Kombinasyon o eşleştirDeney Yöneticisi örnek levha ile f indeksleri. Çoklama için, her numune için 1 göstergesi (i7, N7xx) 'den farklı i7 hazırlar.
   2. Her iyi, yavaşça, LP-PMM 20 ul, Index 1 5 ul ve 50 ul pipet ayarlayın Endeksi 2. 5 ul ekleyin yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle. Yapışkan bir microseal film ile plaka örtün. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca santrifüjleyin.
   3. Bir PCR plakası (kapak 100 ° C'de ısıtılmıştır) ve programı 1 (Tablo 1) koyun.
      NOT: yordam bu noktada durdu olabilir ve reaksiyonlar termalcycler veya 2 ila 8 ° C arasında 2 gün boyunca gün saklanır.

3. gDNA Zenginleştirme: 1. Gün, Öğleden Sonra

1. Başlamadan Önce
   1. Çözülme oligolar (CSO), yakalama hedef tamponu 1 (NCT1), ve buz üzerinde RSB çözümleri. En az 30 dakika kullanılmadan önce, oda sıcaklığına kadar arıtma manyetik boncuklar getir.
2. PCR Saflaştırma
   1. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca, aşama 2.4 plakayı santrifüjleyin.
   2. Oda sıcaklığında, her bir oyuğa karışık arıtma manyetik boncuk 45 ul ekle. Nazikçe, 95 ul pipet ayarlayın yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında, 2 dakika için bir manyetik stand üzerine 96-yuvalı plaka koyun.
   3. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun. (24, numuneler için, 8 ml etanol damıtılmış su ilave 2 ml) taze% 80 etanol çözeltisi hazırlayın. Pelet rahatsız etmemek için süpernatant özen göstererek atın.
   4. Manyetik stand üzerinde plaka tutarken, boncuk bozmadan, her bir oyuğa taze hazırlanmış% 80 etanol içinde 200 ul ilave edildi ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca inkübe edin. Süpernatantı atın ve bu yıkandıkları ikinci kez tekrarlayın. Etanol sağlamak kaldırıldı. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
   5. Manyetik stand plakasını çıkarın ve RSB tampon 40 ul ekleyin. Boruyu ayarlama40 ul tte, hafifçe aşağı 10x bütün hacim yukarı ve pipetle.
   6. Manyetik stand üzerine 96-yuvalı plakayı ve 2 dakika süreyle inkübe edilir. Süpernatant tamamen net görünmelidir. Yavaşça yeni bir 96 oyuklu bir plakaya süpernatan 38 ul transfer.
   7. Bir florimetrik yöntem ile her bir numunenin verimini belirler. Değerlendirilen verimleri 30 ve 50 ng / ul arasında ise protokolün bu ilk bölümü doğrulanmış olacaktır.
3. ^1. Melezleme
   1. Yeni 96-kuyulu bir levhadaki her numunenin 500 ng karıştırılarak, bu aşamada, havuz başına 12 kadar numune havuzda toplayın. Her bir havuzun nihai hacim 40 ul aşmaz emin olun.
      Not: (: ısıtma DNA düşmesine neden olarak da 30 ° C 'de, DNA konsantrasyonu, ısıtma ile değiştirilemez Dikkat) eğer ihtiyaç duyulursa, oda sıcaklığında bir vakum yoğunlaştırıcı cihazı kullanılarak havuzları düşürür. Ekleyerek RSB çözeltisi ile 40 ul son ses seviyesini ayarlayın.
   2. İyice karıştırınNCT1 çözeltisi. Toplanmış DNA numunelerinin ihtiva eden her bir göze 40 ul için NCT1 50 ul ve 10 ul CSO ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle 100 ul pipet ayarlayın. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca plaka ve santrifüj Seal.
   3. Bir PCR plakası (kapak 100 ° C'de ısıtılmıştır) ve programı 2 (Tablo 1) koyun.

4. gDNA Zenginleştirme: 2. Gün, Sabah

1. Başlamadan Önce
   1. DNA zenginleştirme kiti çözülme (Malzeme / Ekipman bkz: İçindekiler) 2 NaOH, elüsyon tamponu 1 ET2, streptavidin manyetik boncuk (SMB), yıkama solüsyonu 1 (WS1), yıkama hedef (HP3), hedef elüsyon tamponu 1 (ET1) Çözelti 2 (WS2), bir yıkama solüsyonu, 3 (WS3), oda sıcaklığında STK ve NCT1 çözümleri.
2. ^1. Hibridizasyon Yıkama
   1. 20 ° C'de 280 x g'de santrifüj PCR ve 1 dakikadan 96 oyuklu plaka çıkarın. Çok dikkatli bir şekild yapışkan kapağını çıkarınLly.
   2. Yeni MIDI 96 oyuklu plakaya plaka 100 ul reaksiyon karışımı aktarın ve de girdap oluşturularak karıştırıldı, SMB çözeltisi 250 ul. Yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle 350 ul pipet ayarlayın. Plaka sızdırmaz şekilde kapatılır ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
   3. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca santrifüj, yapışkan contayı ve 2 dakika boyunca manyetik bir stand üzerine levhayı. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun. Süpernatantı atın ve manyetik stand plakasını çıkarın.
   4. De ihtiva eden boncuklar içine iyice karıştırıldı, WS1 çözeltisi 200 ul ilave edin. Kabarcıklar / köpük oluşumunun önüne aşağıya 15x bütün hacim yukarı ve 200 ul pipet ayarlayın ve yavaşça pipetle.
   5. 2 dakika süreyle manyetik standında plakası yerleştirin. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun. Süpernatantı atın ve manyetik stand plakasını çıkarın.
   6. Conta kuyu içine iyice karıştırılmış WS2 çözeltisi 200 uladencilik boncuk. 200 ul pipet ayarlayın ve yavaşça bütün hacim yukarı pipet ve aşağı 15x kabarcıklar / köpük oluşumunu engeller.
   7. 2 dakika süreyle manyetik standında plakası yerleştirin. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun. Süpernatantı atın ve manyetik stand plakasını çıkarın.
   8. Boncuklar içeren kuyu içine iyice karıştırılmış WS2 çözeltisi 200 ul ilave edin. 200 ul pipet ayarlayın ve yavaşça yukarı ve aşağı 15x tüm hacmi pipetle.
   9. Yeni bir 96-çukurlu plaka içindeki bütün hacmini aktarın. Plaka sızdırmaz şekilde kapatılır ve bir PCR (kapak 100 ° C'de ısıtılmıştır) levhayı yerleştirin. 30 dakika boyunca 42 ° C'de bir ısıl başlatın.
   10. Imediately 2 dakika boyunca manyetik bir stand üzerine levhayı. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun. Mühür çıkarın ve hemen tüm süpernatant atın. Ardından, manyetik stand plakasını çıkarın.
   11. Boncuklar içeren kuyu içine WS2 200 ul ilave edin. 200 pipet ayarlayınul ve yavaşça bütün hacim yukarı pipet ve aşağı 15x kabarcıklar / köpük oluşumunu engeller. Plaka sızdırmaz şekilde kapatılır ve bir PCR (kapak 100 ° C'de ısıtılmıştır) levhayı yerleştirin. 30 dakika boyunca 42 ° C'de bir ısıl başlatın.
   12. Hemen 2 dakika süreyle manyetik standında plakasını yerleştirin. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun. Mühür çıkarın ve hemen tüm süpernatant atın. Ardından, manyetik stand plakasını çıkarın.
   13. Boncuklar içeren kuyu içine iyice karıştırılmış WS3 çözeltisi 200 ul ilave edin. 200 ul pipet ayarlayın ve yavaşça yukarı ve aşağı 15x tüm hacmi pipetle.
   14. 2 dakika süreyle manyetik standında plakası yerleştirin. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun. Tüm Süpernatantı atın ve manyetik stand plakasını çıkarın.
   15. WS3 ikinci kez yıkayın tekrarlayın.
   16. Süpernatant çıkardıktan sonra, kalan süpernatant aşağı çekmek için plaka ve kısaca santrifüj mühür. Üzerindeki plakayı2 dakika süreyle manyetik standı. Artık süpernatant atın.
   17. 0.2 ml tüp içinde, ET1 28.5 ul ve HP3 çözümler 1,5 ul karıştırın. Bu karışım daha havuzlar hazırlanır ise, hazırlanan saysının bu miktarlar çarpma, 1 havuz içindir.
   18. Manyetik stand plakasını çıkarın. Yukarıda hazırlanan karışımı 23 ul ekle. 23 ul pipet ayarlayın ve yavaşça yukarı ve aşağı 15x tüm hacmi pipetle. Plaka sızdırmaz şekilde kapatılır ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bırakın. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca santrifüjleyin.
   19. 2 dakika süreyle manyetik standında plakası yerleştirin. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun. Yapışkan filmi çıkarın ve yeni bir 96 oyuklu plakaya süpernatan 21 ul transfer.
   20. Her bir oyuğa ET2 solüsyonu 4 ul ekleyin. 25 ul pipet ayarlayın ve yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipet ve plaka mühür.
       Not: bu noktada işlemi durdurulabilir ve reaksiyonlar, -15 ° C 'de 7 güne kadar depolanabilir. Plakası donmuş ise, tamamen ^2. melezleştirilmesine başlamadan önce eritin.
3. ^2. Hibridizasyon
   1. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca plaka santrifüjleyin. Yapışkan filmi çıkarın ve kütüphanenin 25 ul NCT1 50 ul, 10 ul CSO ve PCR sınıf su 15 ul ekle. 100 ul pipet ayarlayın ve yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle.
   2. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca plaka ve santrifüj Seal.
   3. Bir PCR plakası (kapak 100 ° C'de ısıtılmıştır) ve programı 2 (Tablo 1) koyun.

5. gDNA Zenginleştirme: 2. Gün, Öğleden Sonra

1. Başlamadan Önce
   1. Çözülme ET1, ET2, SMB, WS1 WS2, WS3 ve melezleme yıkama RT'de HP3 çözümleri. DNA zenginleştirme kiti, PCR amplifikasyonu için buz üzerinde PCR master mix içeren polimeraz (TC-PMM), PCR primer kokteyl (PPC), ve RSB çözüm çözülme.
2. ^2. Hibridizasyon Yıkama
   1. ^1. melezleme yıkama - 4.2 tam olarak aynı protokolü uygulayın.
3. PCR Amplifikasyonu
   1. Yeni bir 96 oyuklu bir plaka içerisinde, Aşama 5.2 ve TC-PMM 25 ul, PPC 5 ul elüsyon 20 ul karıştırın. 50 ul pipet ayarlayın ve yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca plaka ve santrifüj Seal.
   2. Bir PCR plakası (kapak 100 ° C'de ısıtılmıştır) ve programı 3 (Tablo 1) koyun.

6. gDNA Zenginleştirme: 3. Gün

1. Başlamadan Önce
   1. Buz üzerinde çözülme RSB çözeltisi. En az 30 dakika kullanılmadan önce, oda sıcaklığına kadar arıtma manyetik boncuklar getir.
2. PCR Saflaştırma
   1. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca aşama 5.3 plakayı santrifüj ve yapışkan kapağını çıkarın.
   2. Oda sıcaklığında, p 90 ulreviously her çukura arıtma manyetik boncuklar karıştırılır. Yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle, 140 ul pipet ayarlayın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca manyetik bir stand üzerine 96-yuvalı plaka koyun. Süpernatant tamamen net göründüğünden emin olun.
   3. (2 numuneler için 800 ul etanol damıtılmış su, 200 ul) taze% 80 etanol çözeltisi hazırlayın. Pelet rahatsız etmemek için süpernatant özen göstererek atın.
   4. Manyetik stand üzerinde plaka tutarken, boncuk bozmadan, her bir oyuğa taze hazırlanmış% 80 etanol içinde 200 ul ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca inkübe edin. Süpernatantı atın ve bu yıkandıkları bir kez daha tekrarlayın. Etanol sağlamak kaldırıldı. Plaka manyetik standdayken 15 dakika boyunca ya da etanol buharlaşana kadar oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
   5. Manyetik stand plakasını çıkarın ve RSB tampon 30 ul ekleyin. T pipetle yavaşça 30 ul pipet ayarlayın veO bütün hacim yukarı ve aşağı 10x. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca inkübe edin.
   6. Manyetik stand üzerine 96-yuvalı plakayı ve 5 dakika için ya da yüzer madde tamamen berrak görünene kadar inkübe edilir. Yavaşça yeni bir 96 oyuklu plaka (: TCY plaka tipi) içine süpernatan 28 ul transfer.
      Not: Prosedür, bu aşamada durdurulabilir ve reaksiyonlar, 7 güne kadar -15 ° C'de saklanır.
3. Kütüphane Doğrulama ve Ölçümü
   1. Bir fragman analizi kullanılarak Kütüphanenin kalitesinin belirlenmesi. Yüksek çözünürlüklü akrilamit jel elektroforezi yukarıda belirtilen adımları değiştirmek için kullanılabilecek, ancak tavsiye edilmez. Fragments 150 bp ve 1000 bp arasında olmalıdır.
      Tavsiye: NOT sıralama sırasında kümelerin en iyi sayısını elde etmek için qPCR kütüphane niceliğini.
   2. Bir referans olarak, doğrulanmış bir kitaplık (2 mM) kullanılmaktadır. Ilk kütüphane hazırlanıyorsa, sequenc kalibrasyonu için sağlanan faj Phix DNA'sı (10 nM) kullanımıCihazı ing.
   3. , 20 ° C'de 7 puan elde etmek üzere, pozitif kontrol seri dilüsyonları hazırlayın 16, 8, 6, 4, 2 ve EBT olarak 01:00 (EB elüsyon tamponu +% 0.1 Tween 20). 1/1000 ve 1 / 2,000 de ilgi kütüphane sulandırmak. Her nokta, üç nüsha olarak analiz edilmelidir.
   4. , De 1 için QPCR ana karışımı (2 x) ihtiva eden SYBR Green 10 ul, ileri primeri, 0.2 ul (10 uM, AATGATACGGCGACCACCGAGAT), ters primer, 0.2 ul (ikinci kuyu sayısı ile çarpın hacim) aşağıdaki karışımı hazırlayın (10 uM, CAAGCAGAAGACGGCATACGA) ve 7.6 ul PCR sınıf su.
   5. Karıştırma işleminden sonra, pozitif kontrol ve kütüphane sulandırmalarından her biri göz ve 2 ul içine, 96 oyuklu bir plaka içerisinde karışımı 18 ul depose. 20 ° C'de 280 x g'de 1 dakika boyunca plaka ve santrifüj Seal. Sonra, bir kantitatif PCR termalcycler ve çalıştırma programı 4 (Tablo 1) tabak yerleştirin.
   6. Her l verim elde etmek için klasik mutlak miktar olarak analiz sonuçlarıibrary. QPCR avantajı, sadece akış hücresi ile etkileşim DNA miktarını belirler olmasıdır.
      Not: nedeniyle, reaktiflerin bir DNA mimetik moleküllerinin varlığında DNA fluorimetric miktarının kullanmayın. Bu ölçme yöntemi kütüphane verim abartma ve dolayısıyla kümelenme puan hafife olacaktır.
4. Ardışık başlatılması
   1. Elüsyon tamponu (EB) 30 ul'lik bir nihai hacim içinde 4 nM'de her bir kütüphane seyreltin ve tüm kitaplıkları havuzu ve iyice karıştırın.
   2. EB tamponu taze 0.2 N NaOH çözeltisi hazırlayın ve bir araya kütüphaneler 10 ul Bu NaOH çözeltisi, 10 ul karıştırın. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında tam 5 dakika inkübe edin.
   3. 5 dakika sonra hemen (dizileme kartuştan) Melezleştirme tampon 980 ul ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra, hibridizasyon tamponu 600 ul ile bu karışımdan 400 ul karıştırın. İyice karıştırın ve 8 bir enjeksiyon için 300 döngü kartuşunun (2 x 150) içine 600 ul transferpM'den herhangi biridir. Başlat sıralama.

7. Veri Analizi

1. Cihaz verileri işlendikten sonra, yeni bir bilgisayara .bam ve .vcf dosyaları aktarmak.
   NOT: transposase parçalanma ayak izleri içermektedir. Sonuç olarak, yazılım otomatik olarak bu verileri düzeltir.
2. Cihaz analizi ile elde edilen çeşitli varyasyonlar toplayın.
3. Üreticinin talimatlarını izleyerek başka bir yazılım (Alamut) ile ihraç dosyaları (.bam, .vcf) analiz. Sonra, iki analizde elde genetik varyasyonlar karşılaştırın. Sadece varyasyonlar iki sayılırlar algılanır.

Tablo 1. PCR koşulları

Programı	Sıcaklık	Zaman	Num. Tekrarlama
1	72 ° C	3 dakika	1
	98 ° C	30 saniye	1
	98 ° C	10 sn	10
	60 ° C	30 saniye
	72 ° C	30 saniye
	72 ° C	5 dakika	1
	10 ° C	sınırsız
2	95 ° C	10 dakika	1
	93 ° C	1 dakika	1
	91 ° C	1 dakika	1
	89 ° C	1 dakika	1
	87 ° C	1 dakika	1
	85 ° C	1 dakika	1
	83 ° C	1 dakika	1
	81 ° C	1 dakika	1
	79 ° C	1 dakika	1
	77 ° C	1 dakika	1
	75 ° C	1 dakika	1
	71 ° C	1 dakika	1
	69 ° C	1 dakika	1
	67 ° C	1 dakika	1
	65 ° C	1 dakika	1
	63 ° C	1 dakika	1
	61 ° C	1 dakika	1
	59 ° C	1 dakika	1
	58 ° C	1 dakika	16-18 saat
3	98 ° C	30 saniye	1
	98 ° C	10 sn	10
	60 ° C	30 saniye
	72 ° C	30 saniye
	72 ° C	5 dakika	1
	10 ° C	sınırsız
4	95 ° C	10 dakika	1
	95 ° C	15 san	40
	60 ° C	1 dakika

Sonuçlar

Örnek QC Sonuçlar

Hedef genlerin sekansları belirlemek için bu yöntemin özelliği gDNA (Şekil 2A) ve kalitesi tagmentation aşamasının kalitesine bağlıdır. Tagmentation (Şekil 2B, üst panel) yeterli değilse, sıralama tatmin edici olmayacaktır. Yukarıda zikredildiği gibi, tagmentation saflaştırmadan sonra, 300 bp civarında gDNA parçalarının çoğunluğu (Şekil 2B, alt panel) ile yaklaşık 1,000 bp'ye kadar olan 150...

Tartışmalar

NGS cihazların ve teknolojilerin yaygın kullanımı kanser ve genetik bozuklukların çalışmada yeni fırsatlar sunmuştur. Tüm genom sekanslaması ya da RNA sıralamasına ek olarak, çok sayıda hasta için seçilen gDNA dizilerinin büyük bir miktarda analizi aynı anda tan büyük potansiyel sunmaktadır. Burada, bir orta verim sıralama cihazı (Malzeme / Ekipman Tablo) ile eş zamanlı olarak 24 hastada 11 tam genlerin çalışma NextEra teknolojisini kullanarak (talep üzerine mevcuttur) belirli bir tasarı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
MiSeq	Illumina	SY-410-1001	Sequencing/medium throughput device
Nextera Enrichment kit	Illumina	FC-123-1208	Transposase based technology
300 cycle cartridge	Illumina	15033624
AMPure beads	Beckman Coulter	A63881	Magnetic purification beads
Magnetic stand	Alpaqua	A32782
96-well Plates	Life Technologies	4306737
MIDI 96-well plates	Biorad	AB0859
Microseal A	Biorad	MSA-5001	This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment
MiSeq	Illumina		Provided with the sequencing device Experiment Manager software Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Manufacturer website tool