Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Özet

Osteoklastlar vücutta ana kemik-rezorbe hücresi vardır. Çok sayıda osteoklastlar izole etmek için bir yeteneği osteoklast biyoloji anlama konusunda önemli ilerlemelere yol açmıştır. Bu protokol, yetiştirilmesi ve in vitro olarak osteoklast aktivitesi miktarının, izole edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Osteoklastlar kemik iliği monosit / makrofaj türetilen çok özel hücreler bulunmaktadır. Kemiğin organik ve inorganik matrisler hem emmek üzere onların sağlıyor bu iskeletin yeniden modellenmesini düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı anlamına gelir. Birlikte, osteoblastlar ve osteoklastlar kemik erimesini ve sağlık ve hastalık sırasında normal iskeleti korumak için birlikte hareket eden kemik oluşumunu hem içeren dinamik bağlantı işlemi için sorumludur.

Vücutta ana kemik-rezorbe hücre olarak, osteoclast farklılaşmasında ve işlev değişikliklerin vücudun derin etkilere neden olabilir. Değiştirilmiş osteoklast fonksiyonuna bağlı hastalıklar, daha yaygın olarak, aşırı osteoklastik kemik erimesi oluşumunu kırılma yatkınlık olan osteoporoz, patolojileri gözlenen nedeniyle hematopoez için kemik iliği boşluk oluşturmak için başarısızlık öldürücü yenidoğan hastalığın şiddeti değişebilir. ent "> in vitro yüksek sayılarda osteoklastlan izole etmek için bir yeteneği kemik yeniden çevriminin anlaşılması önemli gelişmeler için izin verdi ve bu hastalıklar ile mücadele yeni tedavi stratejilerinin keşif için yol açmıştır.

Burada, izole edilmesi ve osteoklastların sayıda verecek fare kemik iliğinden osteoclastların yetiştirmek için bir protokol açıklar.

Giriş

Kemik remodeling dinamik ve kemik erimesinin ¹ ile kemik oluşumu birleştirmesini kapsar. Bu sıkı düzenlenmiş süreç normal homeostasisin sırasında iskeleti korunmasından sorumlu olup, yaralanma ve hastalığa karşı.

Osteoklastlar kemik organik ve inorganik matris hem rezorbe yeteneğine sahip olan benzersiz sonunda, çok çekirdekli hücrelerdir. Osteoklastlar kemik iliği ^2-5'in monosit / makrofaj elde edilir. Osteoklast fonksiyonuna veya oluşumundaki anormallikler osteoporoz gibi yaygın durumlar dahil olmak üzere klinik durumlar, çeşitli neden olabilir.

In vitro osteoklastlan oluşturmak için yeteneği kemik biyoloji ⁶ anlayışımızda önemli ilerlemeler sağladı. Bunun bir sonucu olarak, yeni terapötik maddeler, ⁷ önemli morbidite ve mortalite sorumlu olan osteoklast ile ilgili hastalıkların tedavisi için ortaya çıkmaktadır kadar. Kemik kütlesi ve gücü homeostatik bakım kemik oluşturan osteoblast ve kemik osteoklastı ^8,9 uyumlu eylem gerektirir. Kemik homeostazı burada osteoklast aktivitesi, kemik kütlesi ve yoğunluğu ¹⁰ patojenik kaybına yol açar artış, menopoz sonrası osteoporoz da dahil olmak üzere bir dizi hastalık, değiştirilir. İnsan hastalığı, transgenik fare modelleri artmasıyla, insan kemik hastalığı ^11-13 osteoklastların rolünü deşifre için daha fazla olanak vardır.

Birçok varyasyon ^9,12,14 anlatılmış olan osteoklast kültür teknikleri için çeşitli protokoller, literatürde yer almaktadır. Xing ve arkadaşları, fare kemik iliği hücrelerinden osteoclastogenic deneylerinin açıklamasında, aşağıda tarif edilen protokole benzer bir metodoloji tarif eder. Ancak uzun kemik hasat sonrası kemik iliği hücreleri çıkarmak için, Xing vd. Α-MEM tam ortam ile ilik boşluğu yıkayın^14. Catalfamo, osteoklast fonksiyonuna hipergliseminin etkisini inceleyen ve hücreler, kemik iliği yıkama ile harekete geçirilen bir yöntem olup, en yapışmayan hücreler ¹² atılır etmektedir, 24 saat boyunca kültürlenir tarif da Boyle ve diğerleri tarafından kullanılan bir tekniktir . ⁹ Bunlar daha önce yayınlanan protokolleri tek bir kemiğin iki ucunu kesmek gerekir aynı zamanda, bir iğne batması ve değerli kemik iliği kaybı riski tanıtır kemik iliği, sıkıcı bir uygulama, kızarma uygulamasını zorunlu kılmaktadır. Biz tarif protokolü, Weischenfeldt ve diğerleri tarafından tarif makrofaj izolasyon yöntemine benzer osteoklastlar izole etmek için bir havan ve tokmak kullanımını uygular. ¹⁵

Bizim deneyim, ancak, genellikle elde edilen, osteoklast üretimi açısından değişik sonuçlar, daha önce yayınlanmış teknikleri sonuçlarını kullanarak bu osteoklast izolasyonu ve in vitro kültür içindebir yetersizlik osteoklastlan yetiştirmek için. Bu nedenle, varlığında, ilk olarak makrofajlar ve daha sonra osteoklastlar oluşturan kaplama hücrelerinin% 70-80 yaklaşık verim ile in vitro olarak çok çekirdekli osteoklastlar çok sayıda üretmek üzere fare kemik iliği tutarlı izolasyonu sağlayan bir protokol tasarladılar osteoklast indüksiyon medya.

Protokol

NOT: Etik deyimi: omurgalı hayvanları da içeren tüm araştırmalar Laboratuvar Hayvan Bakım Stanford İdari Paneli (APLAC) tarafından onaylanan uyarınca protokoller yapıldı.

1. Hazırlık

1. Ticari olarak temin edilebilen yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı, 10 ml, 50 ml konik bir tüp içinde oda sıcaklığına gelmeye (polisükroz ve sodyum Diatrizoate içeren, 1,077 gr / ml'lik bir yoğunluğa ayarlanır) izin verin.
2. Akış sitometrik hazırlayın (FACS) 1x Fosfat tamponlu tuz (PBS) ve% 2 fetal buzağı serumu (FCS) ile tampon. 50 ml'lik bir şişe almak ve yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı aşama esnasında kullanım için, oda sıcaklığında, bu kısım korumak.
3. Izolasyon prosedürü sırasında izole doku ve hücreleri korumak için hazır bir kova buz var.

2. Kültür Medya hazırlayın

1. Bazal ortam hazırlayın: MEM (Minimal Essential Medium), fenol kırmızısı (500 mi), glutamat (1x) olmadan FCS (10x), 10,000 birim / ml penisilinn, (1x).
2. 0.22 mikron filtre ile bazal ortamı Filtre.
3. Kemik iliği makrofaj indüksiyon ortamı hazırlayın:
   1. Aşama 2.1'de üretilmiş olan bazal ortam, 50 ml alın.
   2. 10 ⁷ M nihai konsantrasyonda prostaglandin E2 (PGE2, Bay 352,465 g / mol) ilave edin.
   3. 10 ng / ml'de makrofaj-koloni uyarı faktörü (M-CSF) ekleyin.
   4. Medya uyarıcı kemik iliği makrofaj nihai çözüm filtre etmeyin.
4. Osteoklast indüksiyon ortamı hazırlayın:
   1. Aşama 2.1'de üretilmiş olan bazal ortam, 50 ml alın.
   2. Ekle 10 ⁷ M nihai konsantrasyonda Prostaglandin E2 (PGE2, Bay 352,465 g / Mol)
   3. 10 ng / ml'de makrofaj-koloni uyarı faktörü (M-CSF) ekleyin.
   4. 10 ng / ml'de RANKL ekleyin.
   5. Osteoklast indüksiyon ortamı nihai çözüm filtre etmeyin.

3. Kemik İliği İzolasyonu

1. Bir C57BL / 6 fare öldürülürservikal dislokasyon karbondioksit inhalasyonu yöntemi kullanılarak.
   NOT: Kemirgenler uygun teknik, donanım ve maddeleri kullanılarak eğitilmiş personel tarafından ötenazi gerekir.
2. Pozisyonu bir diseksiyon gemide fare güvenli ve% 70 alkol ile sprey ve.
3. Femur, fibula, humerusu ve omurga ayır.
   1. Yatar pozisyonda fare ile başlayın. Dikey alt ekstremite boyunca bir kesi yapmak ve yumuşak doku ekleri bölünmesi ile femur ve tibia uzunluğu boyunca diseksiyon ile başlar. Son olarak, iskelet tamamen kemikleri ücretsiz diz ve kalça eklemi kemikleri yerinden.
   2. Humerus izole etmek için üst ekstremite uzunluğu boyunca bir kesi yapmaya devam edin. Yumuşak doku kapsül eki diseksiyon ile omuz ve dirsek eklemleri de humerus yerinden.
   3. Fare eğilimli yatıyor böylece nihayet, üzerinde fareyi çevirin. Orta hatta, omurganın uzunluğu boyunca bir cilt kesi yapmak. Paravertebral yumuşak gözlemlemekparavertebral yumuşak doku kütle içinden kesme omurganın kemiksi kenarı boyunca omurga ve insizyon her tarafında dokusu gibi. Bir makas kullanma, boyun üssünde omurga boyunca yatay bir kesim yapmak ve yumuşak doku eki omurgayı kurtararak omurga, kuyruk ekleme hemen yakınına, sonunda.
4. Kemikler hasat edildikten sonra, buz üzerinde FACS tampon saklayın.
5. Kemiklerden kas ve yumuşak doku temizlemek için kağıt mendil kullanın.
6. FACS tamponu, 3 ml olan bir havan ve tokmak kullanarak içine temizlenmiş kemikleri yerleştirin.
7. Havanda hafifçe kemikleri Crush.
8. 70 mikron hücre süzgecinden geçirilmesiyle 50 ml konik tüp içine kan lekeli sıvısı ve transferi kapalı aspirat.
9. 5 mi FACS ezilmiş kemiğe tampon ve daha fazla ezmek ekleyin. Yine, bir pipet kullanılarak, sıvıyı çıkarın ve 70 mikron süzgecinden 50 ml'lik konik tüpe aktarın.
10. Tipik olarak, kemik TWI ezmekTaze FACS tampon çözeltisi içinde üç kez, sıvı kırmızı leke duruma gelene kadar, bir havan, taze FACS tampon ilave 5 ml ekleyerek, her zaman kullanarak ce.
11. Hücre topağı elde etmek için 4 ° C'de 5 dakika süreyle 200 x g'de kemik iliği çözeltisi santrifüjleyin.

Kemik İliği Hücrelerinin 4. dereceli ayırma

1. FACS tamponu, 10 ml supernatant ve tekrar süspansiyon aspire (oda sıcaklığında muhafaza edilen).
2. Ticari olarak temin edilebilen yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı (RT) 10 ml içeren 50 ml'lik konik bir tüp.
3. Yoğunluk gradyan hücre ayırma medya üzerine kemik iliği çözüm Katman. Yavaş yavaş elektrikli pipet kullanarak bunu. Açı pipet konik tüpün üstüne yakın iç yüzeyine karşı ucu ve yaklaşık 30 ° konik tüp eğin. Yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı rahatsız etmeyecek şekilde pipet üzerinde yavaş hız ayarını kullanarak, yavaşça kemik iliği çözüm sınırdışı.
   NOT: Sonuçta orada olacakİki çözümleri (hücresel çözüm ve yoğunluk gradyan hücre ayırma medya çözümü) arasında açık bir tanımı olabilir.
4. Bir RT santrifüj kullanılarak, 15 dakika boyunca 200 x g'de dengeli bir santrifüjde yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı ve hücre çözeltisi santrifüj. Buna ek olarak, yoğunluk gradyanlı bir hücre ayırma ortamı gradyanı kullanılarak, yeterli faz ayrımını sağlamak için santrifüj üzerine hızlanma ve yavaşlama çıkarın.
5. Santrifüj işleminden sonra, söz konusu kemik iliği hücreleri içeren parçalı orta tabaka aspire.
6. Yeni bir konik tüp içine bu hücreleri aktarın. Hücreleri yıkamak için (buz üzerinde tutulur), ek FACS tampon 20 ml ilave edilir.
7. 4 ° C'de 5 dakika süreyle 200 x g'de santrifüjleyin bir hücre tanesinin elde edildi.
8. Bir hemositometre kullanılarak hücre sayımı için izin vermek için ortam uyarıcı makrofaj 1 ml nihai hücre topağı tekrar.

5. Hücre Sayım

1. Hücre çözeltisine 10 ul alın ve karıştırıntripan mavisi 10 ul. Yük elde edilen karışımı 10 ul bir hemositometrede üzerine püskürtüldüğü ve çözeltinin ml'si başına hücre sayısı elde edilir.

6. Hücre Kültürleme

1. 24 oyuklu plakanın her oyuğuna makrofaj uyarıcı ortam 2 ml yerleştirin.
2. Her kuyuya 200.000 hücreleri ekleyin.
   NOT: Bizim tecrübelerimize göre, hücre-kaplama yoğunluk osteoklastlann vitro kültürlenmesinde yeterli için en önemli gerekliliklerden biridir.
3. Yavaşça, 37 ° C'de normal bir inkübatör plaka yeri ve çalkalayın.
4. 3 gün boyunca ortamı değiştirmek etmeyin.
5. Makrofaj uyarıcı medyada 3 gün sonra, osteoklast medya ortamı değiştirmek.
6. Bundan sonra, noktası, büyük, çok çekirdekli osteoklastlar kültür plaka üzerinde görünür olmalıdır hangi 5-7 gün, günlük ortamı değiştirmek.

7. Boyama ile Tartratın Dirençli Asit Fosfataz (TRAP)

1. In vitro cul 5-7 gün sonraTüre, iyi kültürden ortamı aspire.
2. 1x PBS ile üç kez hafifçe kuyuları yıkayın.
3. % 4 paraformaldehit çözeltisi ekleyerek hücreleri düzeltmek ve 4 ° C'de 1 saat bekletin.
4. Bu süre boyunca, 37 ° C'ye kadar ön ısıtma ile (ticari olarak temin edilebilir), TRAP leke hazırlar.
5. Paraformaldehid içinde 1 saat sonra, paraformaldehid aspire ve 1 x PBS ile hafifçe 3 kez yıkayın.
6. Plakanın her oyuğuna önceden ısıtılmış TRAP leke 1 ml ilave edilir lekelenmesine.
7. Işıktan korunan, 1 saat boyunca 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde plaka koyun.
8. 1 saat sonra, TRAP leke aspire.
9. Önceden ısıtılmış deiyonize su ile gözler 3 kez yıkayın.
10. 1-2 dakika Gill'ın Hematoksilin (DİKKAT) ile kuyu Counterstain.
11. Parlak bir alan mikroskobu kullanarak görüntü osteoklastlar.
12. Leke yeterli bir renk yoğunluğu kadar deiyonize su ile kuyu yıkayın çekirdekler blu görünür tipik zaman, elde edilirör.

8. Osteoklast Rezorpsiyon Deneyi

1. Kemik alt-tabaka ya da bir inorganik kristal şeklinde kalsiyum fosfat kaplama ya ile önceden kaplanmış olan bir ticari olarak temin edilebilir 24 oyuklu polistiren kültür kaplarına kullanın.
2. Her bir kuyuya makrofaj uyarıcı ortam 2 ml yerleştirin.
3. Her bir oyuğa aşama 2 sonunda elde edilen 200,000 yeni izole edilmiş kemik iliği hücreleri ekleyin.
4. Yavaşça 3 gün boyunca 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde konulmadan önce, plakayı çalkalayın.
5. 3. günde, osteoklast farklılaşma medya ortamı değiştirmek.
6. 5-7 gün osteoklast farklılaşma medya ile günlük medya değişiklikleri gerçekleştirin.

Osteoclast Resorpsiyon Faaliyet 9. Quantification

1. Aşağıda açıklandığı gibi, mineralize alt-tabaka üzerinde osteoklast farklılaştırma ortamı içinde in vitro kültürü 5-7 gün sonra, resorpti oluşturmak osteoklastların yeteneğini değerlendirmek için, mineralli yüzeyini analizçukurları, osteoklastik aktivitenin bir göstergesi.
2. Erimesi tahlil plaka aspire medya ve her iyi% 10 çamaşır suyu çözeltisi 100 ul ekleyin.
3. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 10 çamaşır suyu solüsyonu ile hücreleri inkübe edin.
4. Damıtılmış su ile gözler 3 kez yıkayın.
5. Kalan suyu aspire ve plaka fazla suyu silkeleyin ve 3-5 saat kurumaya bırakın.
6. Piyasada mevcut Von Kossa boyama kiti ile plaka Counterstain un-rezorbe alt tabakanın kolay görünüm için izin.
7. Rezorbe yüzeyinin temsili parçaların görüntülerini çekmek için parlak bir alan mikroskobu kullanın.
8. Görüntü analiz yazılımı kullanılarak, osteoklastik kemik erimesini aktivitesinin ölçümü için izin vermek için rezorbe yüzeyinin yüzdesi hesaplanır.

Sonuçlar

Bu yöntemin amacı, kolay bir hafta içinde, tipik olarak, in vitro olarak, osteoklastların sayıda izole edildi. Osteoklastların sayıda başarıyla izolasyonu, tartrat-dirençli asit fosfataz lekeleme (Şekil 1A) kullanılarak teyit edilmiştir. Büyük osteoklastlar çok çekirdekli (genellikle ≥ 3 çekirdekleri) ile büyük mor hücreler olarak görülür. Bu protokolü kullanarak, osteoklast ortalama olarak 30 kadar çekirdeklerin (Şekil 1B) ile osteoklastlan i...

Tartışmalar

Kolayca in vitro osteoklastlann sayıda izole ve yetiştirmek için bir yetenek kemik biyoloji ve osteoklast-aracılı hastalıkların anlayışı ilerletmek için yardımcı sorumlu olmuştur. Son zamanlarda osteoklast formasyonu, farklılaşma ve canlılık ^16-18 başlıca düzenleyicisi olarak tespit edilmiştir zaman, bu yol RANKL ayırdedilebilmesidir.

Kemik iliği osteoclastların in vitro kültürü ekim yoğunluğu büyük ölçüde bağımlı olan bizim ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM, no glutamine, no phenol red	Gibco	51200-038
M-CSF, recombinant mouse	Gibco	PMC2044
Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed)	R&D Systems	462-TEC-010
Prostaglandin E2	Sigma-Aldrich
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit	Sigma-Aldrich	387A
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates	Corning Life Sciences	3987