Doku Dejenerasyonu / Yenilenme ve Kanser Araştırmaları Murin İndüklenebilir Telomeraz allelleri kullanılması

Özet

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

Özet

Telomer yaşlanma sırasında doku dejenerasyonu neden köklü sürücüler genom bütünlüğü ve ilişkili DNA hasarı sinyalizasyon ve kontrol noktası tepkilerin kaybı olan disfonksiyonu kaynaklı. Insidans oranları büyük ölçüde yaş arttıkça kanser, kısa telomer uzunlukları ve yüksek telomeraz aktivitesi ile karakterize edilir. Yaşlanma ve kanser telomer disfonksiyonu ve telomeraz reaktivasyonu rollerini incelemek için, protokol, iki kemirgen uyarılabilir telomeraz oluşturmak nasıl gösterir knock-allelleri 4-hidroksitamoksifen (4-OHT) -inducible TERS-Östrojen Reseptör (mTERT-ER) ve Lox -Stopper-Lox TERS (LSL-mTERT). protokol telomer disfonksiyonu neden ve in vivo mTERT-ER ve LSL-mTERT farelerde telomeraz aktivitesini yeniden etkinleştirmek için prosedürleri açıklar. Örnek veri telomeraz aktivitesinin yeniden aktive telomer işlev bozukluğunun neden olduğu doku dejeneratif fenotipleri iyileştirebilir göstermektedir. Ord içindeer tümörijenez üzerindeki telomeraz reaktivasyonu etkisini belirlemek için, biz prostat oluşturulan tümör modeli G4 PB-Cre4 PTEN ^{L / L} p53 ^{L / L} LSL-mTERT ^{L / L} ve timus T-hücreli lenfoma modeli G4 Atm ^{- / -} mTERT ^{ER / ER} . temsili veriler büyük ölçüde tümörogenez artırabilirsiniz telomer disfonksiyonu tarafından uyarılan genomik istikrarsızlık fon bu telomeraz reaktivasyonu göstermektedir. protokol aynı zamanda nöral kök hücreler mTERT-ER ve LSL-mTERT farelerinden (NSC'lerde) izole ve in vitro NSC'lerde telomeraz aktivitesini sokmak için kullanılan prosedürleri açıklamaktadır. temsili veriler telomeraz reaktivasyonu in vitro kendini yenileme yeteneği ve nörogenezi geliştirmek olduğunu göstermektedir. Son olarak, protokol, her iki fare FFPE üzerine telomer FISH (floresan in situ hibridizasyon) gerçekleştirmek için prosedürleri açıklar (Formalin Sabit ve parafınfin Gömülü), beyin dokuları ve kültür hücrelerinin metafaz kromozomları.

Giriş

Telomeraz telomer korunmasından sorumlu bir enzimdir. Bunlar bütünlüğünü korumak kromozomların uçlarında tekrar eden diziler bulunmaktadır. telomeraz holoenzimin iç kısım bileşenleri, bir ters transkriptaz, katalitik alt birimi (TERT) ve ^1,2 tekrar telomerik eklenmesi için bir şablon olarak hizmet eder, bir RNA alt ünitesi (TERC) 'dir. Genellikle farklılaşmış somatik hücrelerde engellenir birlikte, telomeraz sağlam aktivite sergiler ve germ hücreleri, kanser hücrelerinin önemli bir rol oynamaktadır ve kök hücreleri.

mTERC ve mTERT knockout farelerde kök hücreleri ve kanser hem de telomeraz fonksiyonlarını incelemek için in vivo model sistemlerinde de büyük sağlar. mTERC ve mTERT fareler (G1) farelerde ³ telomerlerin uzun rezerv nedeniyle herhangi bir belirgin fenotipleri yoktu nakavt. Bununla birlikte, seri son nesil (G5-G6) mTERC ve mTERT fareleri birleştiği sonuçlandısonunda ilerici telomerlerin erozyon ve yüksek çoğalma dokuların ⁴ ciddi dejenerasyon yarattı. Geç nesil (G5-G6) mTERC ^{- / -} fareler nedeniyle testis ve germ hücre tükenmesi apoptoz yüksek oranlarda kısırdır. G5-G6 mTERC ^{- / -} farelerde de bağlı doku kök / progenitör hücre bölümlerinde ⁴ apoptoz ve kusurlu kendini yenileme yeteneği yüksek oranlarda kemik iliği, bağırsak ve deri gibi son derece proliferatif dokularda dejeneratif fenotipleri sergilerler. Geç nesil kemik iliği hematopoetik kök hücre mTERC ^{- / -} fareler çoğalma potansiyeli sergileyen kaybı, tehlikeye kendini yenileme özelliği, geliştirilmiş apoptoz ve fonksiyonel olarak tükenme ^{5,6. - / -} Farelerde ^7,8 Benzer şekilde, bağırsak kript giderek artan apoptotik cisimler G1-G6 mTERC her bir ardışık üretimi gözlendi. TO işlevsiz telomerlerin zararlı etkilerini ciddi geç nesil (G4-G5) engelli edildi vitro yetişkin nöral kök hücrelerin çoğalmasında ve in vivo nöron hem beri yüksek ciro dokulara sınırlı olması mTERC görünmüyor ^{- / -} farelerde ⁹ . Kök hücrelerin telomeraz rolü daha bazı açılardan ^10,11 yaşlanma erken benzer bir nadir insan genetik bozukluk Diskeratosis konjenitanın (DKC), bulgular tarafından desteklenmektedir. DKC dyskerin, çekirdek telomeraz alt birimini, ve diğer dyskerin bağlı proteinler ¹² şifreleyen TERC, TERT mutasyonlar ve gen neden olur. Ortalama olarak, DKC hastalarında telomer yaştaki kontrollerin daha kısa 99% vardır. hastalığın önemli morbidite hematopoietik kök hücrelerin kusurlu bakım neden olduğu aplastik anemi, kaynaklanmaktadır. Örneğin oral lökoplaki, tırnak distrofisi, zihinsel retardati gibi hastalık diğer yönleritestis atrofi ve akciğer komplikasyonları, tüm telomeraz nakavt farelerin geç nesil doku kök hücreleri ve progenitör hücreler ^10, bu yakın anlaşma bulguların fonksiyonlarını engelli öneririz. DKC hastalar miyelodisplastik sendrom eğilimli ve malign mukozal neoplazmlar bir artış prevalansı. Bu nedenle, insan hastalarda telomeraz eksikliği geç nesil telomeraz nakavt farelerde gözlenen kök hücre fonksiyonları ve tümör yatkınlık kusurları tartışıldı.

Kısa telomerlerin ve yüksek telomeraz aktivitesi kanseri özellikleridir. Normal veya premalign hücreler bölmek gibi, DNA çift sarmallı-tatili (DSBs) ¹³ provoke benzer telomerlerin ve hücresel kontrol noktalarının aktivasyonu nihai erozyon düşük ya da hiç telomeraz aktivitesi sonuçları. Klasik DSBs gibi, telomer bozukluk, yaşlanma ve / veya apoptosi gibi hücresel tepkileri, p53 uyardığı gösterilmiştir ve ilişkilendirilmiştir^14,15 s. P53 mutasyon inaktive üzerine, hücre bisiklet ve hücre sağkalım translokasyonları ve bölgesel büyütmesi ve silmeler ^16,17 ile karakterize bir yanlısı kanserojen mutator mekanizma sağlar telomer disfonksiyonu olan hücrelerde geliştirilmiştir. Aynı zamanda, telomer disfonksiyonu (hatta p53 boş hücreler) ilişkili yaygın kromozomal instabilite devam Bu tür kanserlerin tam habis ilerlemesi sınırlamak gibi görünmektedir. Örneğin, geç nesil G4-G5 mTERC ^{- / -} Ink4a / Arf ^{- / -} fareler nedeniyle telomer yıpratma Ink4a / Arf boş fareler ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azaltılmış lenfoma insidansı gösterdi. Başka bir çalışmada ise, G4 mTERT daha gelişmiş adenomatöz lezyonlar ^{- / -} APC ^dk fareler büyük ölçüde nedeniyle önemli bir büyüme yakalanması ve apoptoz ^18,19 APC ^dk fareler ile karşılaştırıldığında bastırıldı.telomer genomik istikrarsızlık disfonksiyonu-uyardığını gözlem tümör ilerlemesi telomeraz aktivasyonu kanser hücre canlılığı ve / veya nötralize p53-bağımlı-bağımsız denetim noktası ya mekanizmaları ile uyumlu bir seviyeye genomik istikrarsızlık bastırılması kısmen malign ilerlemesini sağlayacak olabileceği spekülasyonları ister engeller.

Telomeraz reaktivasyonu durdurmak ve hatta kök hücrelerin yaşlanma ters ve telomeraz reaktivasyon genomik istikrarsızlık fonunda tümörogenez teşvik edip edemeyecekleri incelemek amacıyla, iki uyarılabilir kemirgen telomeraz allelleri oluşturdu. İlki 4-hidroksitamoksifen olan (4-OHT) -inducible TERS-Östrojen Reseptör (mTERT-ER) füzyon knock-alel. 4-OHT yokluğunda, mTERT-ER (amacına mTERT ^{ER / ER)} için homozigot fareler, telomeraz aktivitesi eksikliği ve geleneksel mTERT veya m ile aynı sitogenetik ve hücre fenotipleri sürdürmekTERC nakavt modeli. 4-OHT yapılan uygulamadan sonra, ters-ER proteini aktivitesi doğal TERT proteini ^{20, 21} denk düzeylerde geri yüklenebilir. İkinci alel yeni bir uyarılabilir TERS knock-bir intronik loxp-Durdurucu-loxP kaseti içeren alel (LSL- olan mTERT); LSL eksizyonu Cre-aracılı üzerine, mTERT endojen ifade kontrol mekanizmaları ²² altında yeniden ifade edilir.

Protokol

NOT: Bu protokol tüm adımlar UT MD Anderson Kanser Merkezi tarafından onaylanmıştır.

MTERT-ER, alel 1 Üretimi

1. Knock-tanıtılması ERT2-LBD (Ligant Bağlama Alanı) üst ve (intron 2 boyunca ekson 1) mTERT genomik sekans ile çerçeve içinde bir Lox ihtiva eden hedefleme vektörü - fare ES hücreleri içine Füme fragmanı (Şekil 1A) - pgk - neo elektroporasyon ile.
2. Kültür 6-10 gün neomisin ES hücreleri. Neomisin dirençli klonlar almak ve 48 gözlü levhalar genleşir. Bir ticari kit kullanılarak genomik DNA ayıklayın ve vuruş-in alel güney lekesi ile onaylayın.
3. Ters bir mikroskop altında C57BL içine mikromanipulasyon kiti ile / 6 blastosistler% 95'in üzerinde, normal kromozom iki ES hatları enjekte. Vekil annelerin ²³ rahim içine blastosistler implante. C57BL / 6 fe yüksek dereceli erkek Khimaira'da (% 70-90) Mateerkek.
4. Güney blot heterozigot mTERT-ERneo hayvanların genotiplendirmesi onaylayın.
5. NeoR kaseti silmek için heterozigot mTERT-ERneo hayvanlar ve EIIa-Cre hayvanları Mate. Homozigosite oluşturmak için en az üç kez ve daha fazla arası bir cins heterozigot mTERT ER hayvanlar için, C57BL / 6 hayvan için heterozigot hayvanlar Mate.

LSL-mTERT alel 2. Üretim

1. Knock-bir loxP ihtiva eden hedefleme vektörü sunulması - üç Tapa - Yeni - LoxP fragmanını ve elektroporasyon ^23, fare ES hücreleri içerisine (ekson 1 ve intron 2, Şekil 1B arasında) mTERT genomik sekans.
2. Kültür 6-10 gün neomisin ES hücreleri. Neomisin dirençli klonlar almak ve 48 gözlü levhalar genleşir. Bir ticari kit kullanılarak genomik DNA ayıklayın ve güney blot ²³ ile vuruş-in alel onaylayın.
3. Injeters bir mikroskop altında bir mikromanipulasyon kiti ile C57BL / 6 blastosist içine% 95 normal karyotipli ct iki ES hatları. Vekil annelerin ²³ rahim içine blastosistler implante. C57BL / 6 kadın yüksek dereceli erkek Khimaira'da (% 70-90) Mate.
4. Güney blot heterozigot LSL-mTERT hayvanların genotiplendirmesi onaylayın.
5. En az üç kez, C57BL / 6 hayvan için heterozigot hayvanlar Mate ve ayrıca arası cins heterozigot LSL-mTERT hayvanlar homozigosite üretir.

In vivo mTERT-ER ve LSL-mTERT Farelerde Telomeraz 3. Yeniden

MTERT-ER

1. Enjeksiyondan önce tüm cerrahi aletler sterilize.
2. % 50 (h / h), oksijen /% 50 (hac / hac): diazot monoksit gazı karışım içinde izofluran odası (indüksiyon için% 4, muhafaza edilmesi için% 2) ile fareler anestezi. Ya da bir ketamin-ksilizin karışımı ile farelerin (100 m uyutmakg / kg vücut ağırlığı, + 10 mg / kg vücut ağırlığı).
3. Derin anestezi ulaşıldıktan sonra, indüksiyon odasından anestezi hayvan kaldırmak ve izofluran odasının (% 2) bağlı tüp içinde kendi kafa tutmak.
4. Hayvan derinden anestezi sağlamak için farelerin ayak pedleri sıkıştırın. Kurumasını gözleri önlemek için her iki göze merhem koy. Povidon-iyot çözeltisi ile farelerin arkasını silin.
5. Arka cilt altında hassas trokar (10 G) ile yavaş salan 4-OHT pelet enjekte edilir ve iki omuz arasındaki orta hatta pelet itin.
6. Yara klip uygulayıcı ile kesi Seal ve anestezi kurtarma için fareler izlemek. 10 gün sonra klipleri çıkarın. Prosedür kısaca bitmiş çünkü Ek ısı gerekli değildir.
7. 4-OHT topak ile muamele süresi çalışmanın amacı göre optimize edilmelidir.

LSL-mTERT için

1. Tamoksifen (10 mg / ml mısır yağı içinde çözülmüş) (200 ul / 25 g / gün) karın içinden iki ardışık gün enjekte edilir.

Nöral Kök Hücre ve In Vitro Telomeraz ve reaktivasyonu 4. İzolasyonu

1. Fareler, karbon dioksit ile kurban edilir ve beyinleri çıkarılır. Üretici başına ticari olarak temin nöral doku ayrışma kiti protokolü izleyin.
2. Vorteks fazlası Çözüm 4 için hücre kültürü ortamı, 1 ml ile çözüm 4 etiketli şişe içinde liyofilize toz yeniden süspanse edin. Bu çözelti daha sonra alikotlandı ve daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de saklanmalıdır.
3. Ön ısı kullanılmadan önce 15 dakika için 37 ° C 'de bir karışımı.
4. Çözüm 1 (50 ul) eklenmiş ve çözelti 2 (1900 ul): enzim karışımı 1 olun. Çözüm 3 (20 ul) eklenmiş ve çözelti 4 (10 ul): enzim karışımı 2 olun.
5. 400 mg doku ve vorteks için 1.950 ul enzim karışımı 1 hazırlayın. 37 ° C'de karışım önceden ısıtmakKullanımdan önce 15 dakika.
6. 1-gün fare beyinleri çıkarıp, ve koku ampuller ve beyincik kaldırarak forebrains tutun. 4 ° C ve çıkartılması da mağaza çünkü soğuk kültür ortamı, 1 ml ön beyin dokuları tutun. 1 saat içinde nöral doku işlemek için emin olun.
7. Sindirim başına 400 mg sınırı aşıldı olmadığından emin olmak için doku ağırlığı belirlemek. 35 mm çaplı Petri kabı kapağının üzerine beyin yerleştirin ve bir neşter kullanılarak beyin ezmek.
8. HBSS 1 ml ekleyin, 1 ml pipet kullanarak (a / Ca / Mg o) ve arka bir 15 ml tüp içine pipetle parçalar. HBSS ile durulayın (ağırlık / Ca / Mg o). Santrifüj, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 300 x g 'de ve dikkatli bir şekilde süpernatan aspire.
9. Önceden ısıtılmış enzim karışımı 1 1950 ul (Solutions 1 ve 2) başına en fazla 400 mg doku ekleyin. Çevirici ya da tüpü her 5 dakika çalkalanarak karıştırılması, 37 ° C'de 15 dakika boyunca, 15 ml bir tüp içinde inkübe edin.
10. 20 & # ekleyerek doku örneği başına 30 ul enzim karışımı 2 hazırlayın956; Çözüm 4. 10 ul Çözüm 3 bundan sonra, örnek ilave edin. Karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Vorteks etmeyin.
11. Mekanik yavaş yukarı ve aşağı pipetleme 10 kez ile geniş uçlu, yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak doku ayırmak. Hava kabarcıkları oluşturan kaçının.
12. Tüpü her 3 dakikada bir ters çevirme, 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
13. Adımı 4.11 tekrarlayın ve dokular 200 mg daha büyük ise 4,12 adım.
14. 50 ml tüp yerleştirilen 70 mikron hücre süzgecinden, hücre süspansiyonu uygulayın. Hücre süzgecinden 10 ml PBS uygulanır. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 300 g'da hücre süzgeç ve santrifüj hücre süspansiyonu atın. Aspire tamamen süpernatanlarına.
15. Daha fazla uygulamalar için gerekli hacme kök hücre ortamı ile hücrelerin yeniden süspanse.
16. , LSL-mTERT NSC'lerde telomeraz aktive iki gün için 100 mcM 4-OHT hücreleri tedavi için. 100 mcM 4 ile kültür ortamında hücreleri tutmak, mTERT-ER NSC'lerde telomeraz etkinleştirmek için-OHT.

5. Telomer BALIK

1. Kültürlenmiş hücrelerden metafaz kromozom hazırlayın.
2. FFPE (formalin içerisinde tespit edilmiş parafine gömülmüş) doku kesitleri ksilen içinde deparaffinize ve her biri 5 dakika (% 100,% 90,% 70,% 50 etanol) ve 5 dakika boyunca PBS ile etanol serileri içinde rehidre için.
3. Metanol sonrası düzeltme: asetik asit (3: 1) 1-2 saat karıştırıldı. 5 dakika her biri (% 70,% 90,% 100 etanol), ve kuru hava soğuk etanol serisi içinde dehidre olmaktadır. 5 dakika boyunca 37 ° C'de 1x PBS içinde yıkanır.
4. 2 dakika için 37 ° C 'de% 4 formaldehit içinde kromozom denatüre. Soğuk etanol serileri içinde her biri 5 dakika (% 70,% 90,% 100 etanol), ve kuru hava kurutmak.
5. Her slayt PNA melezleme karışımı 12-25 ul uygulayın. (Hibridizasyon karışımı:% 70 formamid, 0.06x SSC,% 0.2 BSA, 0.5 ng / ml tRNA, 0.5 ng / | il telomer veya sentromer problar)
6. Kauçuk çimento ile kapak kayma mühür. 4 m, 80 ° C'de post-doğasını kromozom preparatlarıyla ve doku kesitleriiçinde. Oda sıcaklığında melezleşme veya nemli bir oda içinde, 2-4 saat boyunca 37 ° C.
7. Yıkama tamponu, 2 x 15 dakika oda sıcaklığında yıkanır. (Yıkama tamponu:% 70 formamid, 0.06x SSC, pH 7.2). PBST ile, oda sıcaklığında, 3 x 5 dakika yıkanır. Mikroskopik inceleme için DAPI veya uzak-kırmızı floresan ile Counter-leke slaytlar.

Sonuçlar

stratejiler sıçangil mTERT-ER oluşturmak ve LSL-mTERT knock-allelleri Şekil 1A ve 1 B 'de tanımlanmıştır. Spesifik olarak, bir loxP - üç Stoper - Yeni - LoxP fragmanı LSL-mTERT bir alel yaratmak için, ekson 1 ve mTERT lokusunun ekson 2 arasına yerleştirilmiştir. MTERT ER bir alel yaratmak için, mTERT gen ile çerçeve içinde ERT2-LBD nüfuz alanıyla Biz gösterdi ekson 1 N-ucuna yerleştirilmiş olduğu telomeraz geçici 4, 4-OHT peletleri ile muamele edilerek telomer disfonksiyon farelerde yeniden zaman hafta, dejeneratif fenotip birden beyin (Şekil 2A) gibi organ ve testisler (Şekil 2B) 'de düzeltilebilir olabilir. Geç kuşak G4 LSL-mTERT ve G4 mTERT in vitro olarak kültürlenen hücrelerde telomeraz aktive etkisini belirlemek amacıyla, izole nöral kök hücreler (NSC'lerde)-ER fareler. Biz telomeraz telomer işlevsiz NSC'lerde yeniden ne zaman, NSC'lerde kendini yenileme yeteneği büyük ölçüde de anlamlı (Şekil 3B) geliştirilmiş oldu (Şekil 3A) artmış, ve in vitro nöron olduğunu gösterdi. Telomer disfonksiyon bağlamında ur gelişimi üzerindeki etkileri telomeraz aktive etkisini belirlemek amacıyla, üretilen PB-Cre4 PTEN ^{L / L,} p53 ^{L / L} LSL-mTERT ^{L / L} (prostat tümör modeli) ve ATM ^{- / -} mTERT ^{ER / ER} (timik T-hücreli lenfoma modeli) geç nesil kohortlara. Telomeraz 8 haftalık (Şekil 4B) süreyle, enjeksiyon (Şekil 4A) ya da 4-OHT peletler ile bu farelerde tamoksifen tarafından yeniden zaman, tümör oluşumu büyük ölçüde iki prostat tümör modeli (Şekil 4A) ve timus T-hücreli lenfoma modeli olarak geliştirilmiştir ( Şekil 4B). Son olarak, biz FFPE fare beyin dokularında telomer FISH gerçekleştirme protokolleri (Şekil 5) ve metafaz kromozomları (Şekil 5, ek) bildirdi.

Şekil 1: (A) mTERT-ER knock-strateji. Hedefleme vektörü televizyon; AWT vahşi tip alel; KI, knock-in alel; LA, sol kol; RA, sağ kol; E1, ekson 1 'dir; E2, ekson 2; neo pgk neomisin dirençli gen promotör-tahrikli; ER, tadil edilmiş östrojen reseptörü (ERT2) ligandı bağlanma alanı; DT, dyphteria A toksin gen. (B) LSL-mTERT knock-strateji. Hedefleme vektörü televizyon; AWT vahşi tip alel; KI, knock-in alel; LA, sol kol; RA, sağ kol; E1, ekson 1 'dir; E2, ekson 2; neo pgk neomisin dirençli gen promotör-tahrikli; DURDURUCU, üç tekrarlanan transkripsiyon bitiş dizileri; DT, dyphteria A toksin gen.

Şekil 2: Temsilcisi veri telomeraz reaktivasyonu göstermek için organların dejeneratif fenotipleri iyileştiren beyin Temsilcisi görüntüleri (solda). ve testisler (sağ) plasebo ya da 4 hafta boyunca 4-OHT ile tedavi G0 ve G4 mTERT-ER farelerin. Ölçek çubukları 50 um göstermektedir. Yeniden baskı ²⁰ izniyle. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3:. Temsilci veri telomeraz reaktivasyonu göstermek için kendini yenileme ve in vitro nöral kök hücrelerin nörogenezi artırır (A) nöral kök hücre Temsilcisi görüntüleriG4 LSL-mTERT izole s (üst panel) ve G4 mTERT ER (alt panel), araç ya da 4-OHT ile muamele kök hücre ortamında yetiştirilmesi. (B), farklılaşma ortamında kültürlendi G4 mTERT-ER izole nöral kök hücrelerinin in vitro nöron (Tuj1 +) ve Örnek görüntü (% 1 FBS), araç ya da 4-OHT ile işlemden geçirildi. Ölçek çubukları 100 mikron göstermektedir.

Şekil 4:. Telomeraz yeniden aktivasyonunu gösteren Örnek veri genomik instabilite fonunda tümörogenez artırır, (A) ^{/ l,} p53 ^{L / L} LSL-mTERT G0 PB-Cre4 PTEN ^L kesilmiş prostat tümörlerinin Örnek görüntüleri ^+/- G4 PB- Cre4 PTEN ^{L / L,} p53 ^{L / L} LSL-mTERT^{- / -,} Ve G4 PB-Cre4 PTEN ^{L / L,} p53 ^{L / L} LSL-mTERT ^{L / L} tamoksifen ile işlemden geçirildi. ²² izniyle yeniden yazdırın. (B), G0 ATM kesilerek timus T-hücresi lenfomaları temsili görüntüleri ^{- / -} mTERT ^{+ / ER,} G4 Atm ^{- / -} mTERT ^{ER / ER} araç ile muamele edilmiş ve G4 Atm ^{- / -} mTERT ^{ER / ER} 4- ile işlemden geçirildi 8 hafta boyunca OHT. Ölçek çubukları 1 cm göstermektedir.

Şekil 5: FFPE fare beyin dokusu ve metafaz (içerlek) üzerine telomerik ve sentromerik FISH Temsilcisi görüntüleri. Kırmızı, yeşil telomer boyama gösterir, DNA gösterir, ve mavi ce gösterirntromere lekelenmesi. Ölçek çubukları 1 mm göstermektedir.

Tartışmalar

Burada, iki uyarılabilir kemirgen telomeraz allelleri ve nasıl in vivo ve in vitro telomeraz etkinleştirmek için bir rapor oluşturma. mTERT-ER etkinliğini yeniden aktive edilmesi için kritik bir adım tamoksifen sürekli konsantrasyonunu tutmak, bu yüzden Amerika'nın Yenilikçi Araştırma tarafından üretilen 4-OHT zaman salınımlı pelet kullanmayı tercih. Peletler 60 gün boyunca 1 ng / ml arasında bir sabit durum kan seviyesinde 4OHT serbest tutun. Bir önceki çalışmada, bu strateji ile telomeraz aktivitesini aktive böyle kök hücre bitkinlik, G4 mTERT ^{ER / ER} telomer disfonksiyon ile uyarıldığında birden fazla organda doku yaralanması yanıtları ve organ yetmezliği düşüklüğü gibi dejeneratif fenotipleri iyileştirmek mümkün olduğunu gösterdi farenin ^20.

Yaşlanma telomeraz işlevi çalışmak dışında, bu iki uyarılabilir telomeraz alelleri de kanseri çalışma için de kullanılabilir. Önceki çalışmalarda aldıBu alel avantajı genomları şekillendirme ve T-hücresi timik lenfoma ²¹ ve prostat kanseri ²² biyolojisini etkileyen telomer yıpratma ve telomeraz reaktivasyonu rolünü araştırmak için. Bu iki çalışma gösterdi ki geç nesil G4 Atm telomer disfonksiyon ^{- / -} mTERT ^{ER / ER} ve G4 PB-Cre4 PTEN ^{L / L} p53 ^{L / L} LSL-mTERT ^{L / L} fareler için erken mutajenik olayların satın körüklüyor bir mekanizma sağlar Tümör başlatma, henüz tam malign tümörlerin ilerlemesini önler. Telomeraz telomer bozukluğu kaynaklı genomik istikrarsızlık, DNA hasarı kontrol noktaları ve yaygın kromozomal istikrarsızlık bağlamında yeniden zaman böyle prostat kanseri ²¹ kemik metastazı ve Thymi beyin infiltrasyonu gibi yeni biyolojik özelliklere sahip malign tümörlerin tam ilerlemesini sağlıyordu, bastırıldıc lenfoma ^21. Benzer durum daha önce de kolon kanseri ve pankreas kanseri (Dr. Haoqiang Ying Adam Boutin Ronald DePinho kişisel iletişim) dahil olmak üzere diğer kanser türlerinde gözlemlenmiştir.

TERS-ER proteini kolayca hayvan tamoksifen veya araç ile muamele edilmiş olmasına bağlı olarak devletler ile kapatılabilir edilebildiği için, mTERT ER alel tarafından üretilen tümör modelleri, anti-telomeraz tedavi test etmek için kullanılabilir. Bir önceki çalışmada, tümörler G4 Atm oluşturulan ^{- / -} mTERT ^{ER / ER} hayvanlar 4-OHT serbest bırakıldı; telomeraz tükenmesi üzerine, tümörler sonunda nedeniyle telomer disfonksiyonu kaynaklı kontrol noktaları ²¹ iadesi için küçüldü. Bununla birlikte, yanıt olarak direnç kazanmış bazı tümör Telomerlerin (ALT) mekanizmasının bir alternatif uzatılması etkinleştirerek sönme telomeraz için. Bu ALT + dirençli tümörlerin daha fazla karakterizasyonu bu t gösterdihey mitokondriyal sentezi ve oksidatif savunma PGC-1β bir ana regülatörü olmak üzere mitokondriyal biyoloji ve oksidatif savunma katılan genlerin anormal transkripsiyonunu var. Telomeraz + tümör hücreleri ²¹ nispeten sağlam kalır tutmak ise PGC-1β veya SOD2 (oksidatif savunma başka bir regülatör) demonte anlamlı ALT + tümör hücrelerini ortadan kaldırır.

Bu iki knock-in alel bir sınırlama da telomeraz genin doğal odağı çünkü onlar sadece endojen düzeyde telomeraz reaktivasyonunu gelemez olduğunu. Çok insan kanserlerinde telomeraz aslında çok daha yüksek bir seviyede sentezlenmektedir. Telomeraz düzeyini artırmak için, düşünülebilecek bir modifikasyonu Rosa26 lokusuna PGK (fosfogliserat kinaz) promotörü gibi daha güçlü bir promotör ile mTERT ER yapı sokmaktır.

Sonuç olarak, bu iki yeni uyarılabilir kemirgen telomeraz allelleri görülmemiş Genet sağlamakIC araçları, özellikle, önceden elde edilen telomer fonksiyon bozukluklarının neden olduğu genomik instabilite arka altında, yaşlanma ve doku homeostazında gibi tümör ilerlemesinde telomeraz fonksiyonlarını incelemek. mTERT ER alel, diğer tümör eğilimli fare modellerine geçen anti-telomeraz tedavi incelemek için kullanılabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leica AM6000 Micromanipulation Kit	Leica	Per quote
Leica DMI6000 B inverted microscope	Leica	Per quote
Neomycin	Life technologies	21810031
isoflurane vaporizer	Veterinary Anesthesia Systems	911103
isoflurane	Henry Schein	1005796
ketamine-xylazine mixture	Sigma-Aldrich	K113-10ML
4-OHT powder	Sigma-Aldrich	H7904-5MG
Tamoxfien	Sigma-Aldrich	T5648-1G
4-OHT pellet	Innovative Research of America	Custermized
Precision Trochar (10 Gauge)	Innovative Research of America	MP-182
wound clip applier	Fischer Scientific	01-804
clip	Fischer Scientific	01-804-5
Neural Tissue Dissociation Kit	Miltenyi Biotec	130-092-628
HBSS	Life technologies	14025092
PBS	Life technologies	10010023
xylene	Fischer Scientific	X3P-1GAL
methanol	Fischer Scientific	A-433S4
acetic acid	Fischer Scientific	A38-500
ethanol	Fischer Scientific	22-032-104
formamide	Fischer Scientific	F84-1
PNA telomere probe	Panagene	F1001-5
PNA centromere probe	Panagene	F3003-5
20X SSC	Fischer Scientific	BP1325-4
BSA	Sigma-Aldrich	A2153-10G
tRNA	Sigma-Aldrich	R5636-1ML
Tween 20	Fischer Scientific	BP337-100
rubber cement	Walmart	Elmer's
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542