JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, 10 kadar ul serum örneklerinden, hücre dışı veziküller (EVS), hücrelerden salınan küçük zar parçacıkları izole etmek için bir yöntem göstermektedir. Bu yaklaşım, ultra-santrifüj ihtiyacını önlediği deney süresi sadece birkaç dakika sürer ve sınırlı hacim örneklerinden EV'lerin izolasyonunu sağlar.

Özet

Ekstrasellüler veziküller (AGH), hücrelerin çeşitli salınan zar parçacıklar, klinik uygulamalar için büyük bir potansiyele sahip. Onlar nükleik asit ve protein kargo içeren ve giderek ökaryotun ve prokaryot hücreler hem tarafından kullanılan arası bir iletişim aracı olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, küçük boyutları için, EV'lerin izolasyonu için mevcut protokoller genellikle, zaman alıcıdır, zaman alıcıdır, ve bu, bir ultra santrifüj gibi büyük örnek hacimleri ve pahalı ekipman gerektirmektedir. Bu sınırlamaları gidermek için, biz, kolay, verimli ve 10 ul kadar düşük örnek hacimleri gerektiren EVs alt grupları ayırmak için kağıt tabanlı imünoafinite platformu geliştirdi. Biyolojik numuneler, kimyasal olarak belirli EV yüzey belirteçleri yüksek afiniteye sahip yakalama molekülü ile değiştirilmiş kağıdı test bölgeleri doğrudan pipetle edilebilir. Biz taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile tahlil doğrulamak, kağıt-tabanlı enzim-bağlı immunosorbent tahlilleri (p-ELISA) ve transcriptome analizi. Bu kağıt-tabanlı cihazlar sağlık ve hastalık EV fonksiyonları anlayışımızı ilerletmek yardımcı klinik ve araştırma ortamında EVs çalışma sağlayacaktır.

Giriş

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membranous particles that range in size from 40 nm to 5,000 nm and are released actively by many cell types via different biogenesis routes1-9. They contain unique and selected subsets of DNA, RNA, proteins, and surface markers from parental cells. Their involvement in a variety of cellular processes, such as intercellular communication10, immunity modulation11, angiogenesis12, metastasis12, chemoresistance13, and the development of eye diseases9, is increasingly recognized and has spurred a great interest in their utility in diagnostic, prognostic, therapeutic, and basic biology applications.

EVs can be classically categorized as exosomes, microvesicles, apoptotic bodies, oncosomes, ectosomes, microparticles, telerosomes, prostatosomes, cardiosomes, and vexosomes, etc., based on their biogenesis or cellular origin. For example, exosomes are formed in multivesicular bodies, whereas microvesicles are generated by budding directly from plasma membrane and apoptotic vesicles are from apoptotic or necrotic cells. However, the nomenclature is still under refined, partly due to a lack of thorough understanding and characterization of EVs. Several methods have been developed to purify EVs, including ultracentrifugation14, ultrafiltration15, magnetic beads16, polymeric precipitation17-19, and microfluidic techniques20-22. The most common procedure to purify EVs involves a series of centrifugations and/or filtration to remove large debris and other cellular contaminants, followed by a final high-speed ultracentrifugation, a process that is expensive, tedious, and nonspecific14,23,24. Unfortunately, technological need for rapid and reliable isolation of EVs with satisfactory purity and efficiency is not yet met.

We have developed a paper-based immunoaffinity device that provides a simple, time- and cost-saving, yet efficient way to isolate and characterize subgroups of EVs22. Cellulose paper cut into a defined shape can be arranged and laminated using two plastic sheets with registered through-holes. In contrast to the general strategy to define the fluid boundary in paper-based devices by printing hydrophobic wax or polymers25-27, these laminated paper patterns are resistant to many organic liquids, including ethanol. Paper test zones are chemically modified to provide stable and dense coverage of capture molecules (e.g., target-specific antibodies) that have high affinity to specific surface markers on EV subgroups. Biological samples can be pipetted directly onto the paper test zones, and purified EVs are retained after rinse steps. Characterization of isolated EVs can be performed by SEM, ELISA, and transcriptomic analysis.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Operasyon prosedürünün genel şeması Şekil 1'de verilmiştir. Etik uygulamaları kullanarak, (sağlıklı bireylerde kan örnekleri toplandı ve İDD protokolleri onayladı Tayvan altında Taichung Gaziler General Hospital (TCVGH), Taichung aracılığıyla hastaların sulu mizah örnekleri elde KİK TCVGH No CF11213-1).

Kağıt Cihazların İmalatı 1.

  1. 96 oyuklu bir mikrotitre plakası gibi aynı düzeni sağlamak için, çapı 5 mm olan daireler halinde kromatografi kağıdı kesin. Kayıtlı geçiş delikleri, ve laminat iki polistren levhalar ile bu kağıt parçalarını sandviç.
  2. Aşağıdaki 28 adımları açıklanan kimyasal konjugasyon yöntemi kullanarak kağıt cihazları değiştirin.
    1. Bir plazma odasında oksijen plazmanın (100 mW, 1% oksijen, 30 sn) ile kağıt cihazları davranın.
      DİKKAT: 3-merkaptopropil trimetoksisilan ve N -γ-maleimidobutiriloksi sukkinimid ile çalışırken özel dikkat alınmalıdıresteri (GMBS), her ikisi de neme duyarlı ve zehirli olduğundan. Koruyucu eldiven giyin ve solumaktan kaçının veya deri ve göz ile temas. Sıkıca kapalı stok şişe tutun ve su yoğunlaşmasını önlemek için açmadan önce oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Seçenek olarak ise, bir azot doldurulmuş eldiven torbası ya da kutu içinde hazır şişe açın. Küçük şişelere içine kısım stok şişe sık açılmasını önlemek için.
    2. Hemen 30 dakika süreyle etanol (200 proof) içinde 3-merkaptopropil-trimetoksi silan bir% 4 (hacim / hacim) çözeltide kağıt cihazları tedavi inkübe edin.
    3. Etanol ile kağıt cihazları yıkayın ve 15 dakika boyunca etanol içerisinde 0.01 umol / ml GMBS ile inkübe edilir.
    4. Etanol (200 proof) içinde yıkayın ve 4 ° C 'de 1 saat süre ile, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 10 ug / ml avidin çözeltisi ile kağıt cihazları inkübe edin. 4 ° C'de muhafaza eğer ihtiyaç ve 4 hafta içinde kullanın.
  3. (BSA 10 ul PBS sığır serumu albümini (ağ / hac),% 1 ihtiva eden her kağıdı test bölgeleri Islak) 3 x 10 dakika için yakalama molekülü biyotinile edilmiş 10 ul tespit önce 3 x 10 dakika karıştırıldı. Veya anneksin V (01:20, anneksin V bağlanması tampon içinde hac / hac), anti-CD63 antikoru kullanarak (PBS ağırlık / hacim) BSA ve% 0.09 (a / h) sodyum azid (w% 1 ihtiva eden 20 ug / ml) yakalama molekülleri.
  4. PBS sırasıyla, 3 x 1 dakika süreyle tampon çözeltileri bağlayıcı BSA veya anneksin V (ağ / hac),% 1 ihtiva eden tekabül eden 10 ul kullanılarak bağlanmamış anti-CD63 antikoru ya da bunun anneksin V molekülleri durulayın.

2. Serum ve Sulu Mizah Örnek Toplama ve İşleme

  1. Serum koleksiyon.
    1. Serum ayırma tüpleri Venipunktür periferik kan 10 ml toplayın ve hafifçe tüpü beş kez ters çevirin. Dikey konumda tüp ayarlama ve 30 dakika boyunca bekleyin.
    2. 15 dakika boyunca 1.200 × g santrifüj. 30 dakika süre ile 3000 x g 'de daha temiz bir tüpe üst tabakadan serum, ve santrifüj aktarın.
    3. 0.8 mikron fil ile süpernatant geçmekter. Kullanılana kadar -80 ° C'de örnek tutun.
  2. Sulu mizah koleksiyonu: kullanana kadar -80 ° C'de doğrudan prosedürler ve mağaza örnekleri invaziv aracılığıyla bir göz hekimi tarafından tanısı konulan hastalarda sulu mizah örnekleri toplamak.

Ekstrasellüler Veziküller 3. İzolasyonu

  1. 5 ul / dakikalık bir oranda, her bir kağıt test bölgesi üzerine Noktası örnekler.
  2. BSA veya anneksin V sırasıyla, anti-CD63 antikoru ya da bunun anneksin V molekülleri ile işlevselleştirilmiş kağıt cihazlar için 3 x 1 dakika süreyle tampon çözeltileri bağlanması (w / v) PBS,% 1 ihtiva eden tekabül eden 10 ul bağlanmamış EV'lerini durulayın. Aşağıdaki mansap deneyler yapın.

4. Alt Analiz Örneği 1: Tarama Electromicrographs

  1. 10 dakika için 10 ul 0.5 × Karnovsky en fiksatif kullanarak Fonksiyonlu kağıt testi bölgesinde çekilen AGH Fix.
  2. 2 × 5 dakika için yeterli PBS ile örnekleri durulayın.
  3. Kurutmak10 dakika sonra 2 x 10 dakika boyunca% 50 etanol, 2 x 10 dakika boyunca% 70 etanol, 2 x 10 dakika boyunca% 95 etanol ve 4 x 10 dakika boyunca% 100 etanol daha sonra% 35 etanol ile örnekler.
  4. Kuru Kritik ve kaplamaz paladyum / altın örnekleri sputter ve düşük elektron ivme geriliminde çalışan bir taramalı elektron mikroskobu kullanarak incelemek (~ 5 kV).

5. Aşağı Analiz Örneği 2: Paper-based ELISA

  1. 1 de, anti-CD9 birincil antikor ihtiva eden bir 5 ul çözeltisi ekleyin: 1000 seyreltme, PBS içinde yakalanan EV'lerini ihtiva eden, her bir test bölgesine. 1 dakika bekleyin.
  2. PBS 30 saniye boyunca 100 rpm'de çalkalandı ml 30 ile örnekleri durulayın.
  3. 5 ul çözüm içeren yaban turpu peroksidaz (HRP) 1 ikincil antikor -bağlanmış ekle: PBS 1.000 seyreltme ve 1 dakika bekleyin.
  4. PBS 30 saniye boyunca 100 rpm'de çalkalandı ml 30 ile örnekleri durulayın.
  5. Hidrojen peroksit An 1 hacim oranı: 1 ihtiva eden bir 5 ul kolorimetrik alt-tabakanın eklemed 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) ve bir masaüstü tarayıcı kullanarak tarayın.

6. Alt Analiz Örneği 3: RNA İzolasyon

  1. Yakalanan AGH parçalamak için bağlayıcı tampon / polivinilpirrolidon-tabanlı RNA izolasyonu yardımı 35 ul ve lizis 265 ul örnekleri daldırın. Vortex şiddetle.
  2. Lizata izolasyon kiti sağlanan 30 ul Homojenat ekleyin. Vortex şiddetle ve 10 dakika süreyle buz koymak.
  3. Aşağıdaki adımlarda tarif edilen asit, fenol-kloroform ayırıcısı kullanılarak RNA ekstrakte edin.
    1. Şişenin alt tabakasından fenol-kloroform 330 ul alın ve homojenat / lizat ekleyin. Vortex şiddetle.
    2. 5 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüjleyin. Temiz bir tüp sulu (üst) faz aktarın ve kaldırıldı hacmi not.
  4. Önceki adımda ve co uzaklaştırıldı, sulu faz 1.25 katı hacim hacim% 100 etanol ile total RNA çökeltilmesi95 ° C'ye kadar ön ısıtmaya tabi elüsyon çözeltisi RNA'yı llect.
  5. Konsantre hale getirin ve bundan başka, imalatçının protokolüne göre bir RNA temizleme kiti kullanılarak RNA'yı saflaştırmak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

EVs alt grupları izole kağıt cihazın yeteneği verimli EV yüzey belirteçlerinin onun duyarlı ve özgül tanıma dayanır. yakalama molekülü ile kağıt liflerinin stabil bir modifikasyonunun başka bir yerde tarif edildiği gibi 28-30 avidin-biyotin kimyası kullanılarak elde edilir. fiziksel adsorpsiyon yöntemi kimyasal birleşme etkinliği ve floresans bazlı Bilgilerini kullanılarak değerlendirilir. Kağıt test bölgeleri aşama 1.3'de 20 ug / ml florofor R-fikoeritrin-konjüge biyotin-mo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

dışı keseciklerin alt başarılı izolasyonu için en kritik adımlar şunlardır: kağıt 1) iyi bir seçim; Kağıt liflerinin yüzeyi üzerinde yakalama moleküllerinin 2) sabit ve yüksek kapsamı; 3) Numunelerin doğru kullanımı; ve 4), genel laboratuar hijyen uygulaması.

Gözenekli malzemeler, çok ucuz ve ekipman içermeyen deneylerde kullanılmıştır. Bu ayarlanabilir bir gözenek boyutu, çok yönlü özelliğe, düşük maliyet ve yüksek yüzey-hacim oranı, sıvıların p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

Bu çalışma Tayvan Ulusal Bilim Konseyi grants- MGK 99-2320-B-007-005-my2 (CC) ve MGK 101-2628-E-007-011-My3 (CMC), ve Gaziler Genel kısmen desteklenmiştir Hastaneler ve Tayvan Ortak Araştırma Programı Üniversite Sistemi (CC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Chromatography PaperGE Healthcare Life Sciences3001-861Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilaneSigma Aldrich175617This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
EthanolFisher ScientificBP2818Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA)BioShop Canada Inc.ALB001Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS)Pierce Biotechnology22309GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
AvidinPierce Biotechnology31000NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63Ancell215-030clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin VBD Biosciences556418Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibodySystem BiosciencesEXOAB-CD9A-1The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubesBD Biosciences367991Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding bufferBD Biosciences55645410x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent setBD Biosciences555214The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
[header]
RNA isolation kitLife TechnologiesAM1560MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aidLife TechnologiesAM9690Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kitQiagen Inc.74004MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamberMarch InstrumentsPX-250
Scanning electron microscopeHitachi Ltd.S-4300
Desktop scannerHewlett-Packard CompanyPhotosmart B1108-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record systemJ&H Technology CoGeneSys G:BOX Chemi-XX816-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

Referanslar

  1. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
  2. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J. Transl. Med. 9, 9(2011).
  3. Raj, D. A. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81, 1263-1272 (2012).
  4. Wiggins, R. C., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., Brukman, J. Procoagulant activity in normal human-urine associated with subcellular particles. Kidney Int. 29, 591-597 (1986).
  5. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  6. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W. G., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J. Transl. Med. 9, 86(2011).
  7. Asea, A., et al. Heat shock protein-containing exosomes in mid-trimester amniotic fluids. J. Reprod. Immunol. 79, 12-17 (2008).
  8. Bard, M. P., et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 31, 114-121 (2004).
  9. Perkumas, K. M., Hoffman, E. A., McKay, B. S., Allingham, R. R., Stamer, W. D. Myocilin-associated exosomes in human ocular samples. Exp. Eye Res. 84, 209-212 (2007).
  10. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Lab. Invest. 90, 1549-1557 (2010).
  11. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, 756-766 (2012).
  12. Grange, C., et al. Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche. Cancer Res. 71, 5346-5356 (2011).
  13. Jaiswal, R., et al. Microparticle-associated nucleic acids mediate trait dominance in cancer. Faseb. J. 26, 420-429 (2012).
  14. Thery, C., Clayton, A., Amigorena, S., Raposo, G. Current protocols in cell biology. Morgan, K. K. (UNIT 3.22), John Wiley. New York, NY. (2006).
  15. Rood, I. M., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
  16. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110, 13-21 (2008).
  17. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracellular Vesicles. 2, 20360(2013).
  18. Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney Int. 77, 736-742 (2010).
  19. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Ravi, R. K., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. 82, 1024-1032 (2012).
  20. Chen, C., et al. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles. Lab. Chip. 10, 505-511 (2010).
  21. Davies, R. T., et al. Microfluidic filtration system to isolate extracellular vesicles from blood. Lab. Chip. 12, 5202-5210 (2012).
  22. Chen, C., et al. Paper-based immunoaffinity devices for accessible isolation and characterization of extracellular vesicles. Microfluid. Nanofluid. 16, 849-856 (2014).
  23. Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J. Immunol. Methods. 270, 211-226 (2002).
  24. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: Purification of both vesicles from cell-free supernatants. J. Immunol. Methods. 338, 21-30 (2008).
  25. Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 7091-7095 (2009).
  26. Dungchai, W., Chailapakul, O., Henry, C. S. Electrochemical detection for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 5821-5826 (2009).
  27. Glavan, A. C., et al. Omniphobic 'R-F paper' produced by silanization of paper with fluoroalkyltrichlorosilanes. Adv. Funct. Mater. 24, 60-70 (2014).
  28. Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y. H., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear-stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
  29. Murthy, S. K., Sin, A., Tompkins, R. G., Toner, M. Effect of flow and surface conditions on human lymphocyte isolation using microfluidic chambers. Langmuir. 20, 11649-11655 (2004).
  30. Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosens. Bioelectron. 14, 683-688 (1999).
  31. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat. Rev. Immunol. 2, 569-579 (2002).
  32. Scanu, A., et al. Stimulated T cells generate microparticles, which mimic cellular contact activation of human monocytes: differential regulation of pro- and anti-inflammatory cytokine production by high-density lipoproteins. J. Leukocyte Biol. 83, 921-927 (2008).
  33. Inal, J. M., et al. Microvesicles in health and disease. Arch. Immunol. Ther. Ex. 60, 107-121 (2012).
  34. Fridley, G. E., Holstein, C. A., Oza, S. B., Yager, P. The evolution of nitrocellulose as a material for bioassays. Mrs Bull. 38, 326-330 (2013).
  35. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  36. Missoum, K., Belgacem, M. N., Bras, J. Nanofibrillated cellulose surface modification: a review. Materials. 6, 1745-1766 (2013).
  37. Kalia, S., Boufi, S., Celli, A., Kango, S. Nanofibrillated cellulose: surface modification and potential applications. Colloid Polym. Sci. 292, 5-31 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 98h cre d vezik llereksozomlarsel lozka tmikroak kanlarka t ELISAsulu mizahkimyasal ekimi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır