Dijital Çizgi-kodlama Platform'u kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil

Özet

We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

Özet

En memeli patojenler için, çalışmalar profilleme gen ifadesi doğru enfekte dokulardan patojen gen transkript ölçmek için teknik zorluklar ile sınırlı kalmıştır. Patojen RNA enfekte doku örneklerinden izole edilen total RNA küçük bir bölümünü oluşturmaktadır. Mikroarray ve RNAseq teknolojileri Hem güvenilir zayıf dile patojen genlerin okur üreten zorluklar var. In vivo çoğalması azalmış olan mutant suşlar patojen daha büyük bir sorun teşkil etmektedir. Burada, çok hızlı son derece hassas ve son derece tekrarlanabilir bir in vivo gen ekspresyon profili protokol açıklar. Biz hematojen yaygın kandidiyazis bir fare modelinde mantar patojen Candida albicans bizim soruşturma sırasında bu protokolü geliştirdi. Bu protokolü kullanarak, dinamik düzenlenmiş C. zaman derslerini belgeledi albicans gen böbrek enfeksiyonu sırasında ifade ve keşfedilen beklenmedik özelliklerigen ekspresyon tepkileri vivo ilaç tedavisi antifungal.

Giriş

Gen ifadesi dinamikleri, bir hücre çevresel değişikliklere nasıl tepki hakkında önemli bilgiler tutar. Bir enfekte mikrop durumunda, gen ekspresyon verileri, patojen enfeksiyon ortama uyum sağlar ve konakçıya zarar ilgili klinik açıdan önemli bakış açıları sağlayacaktır. Son yirmi yılda, in vitro ve in vivo hem de gen ekspresyon çalışmaları veri büyük miktarda üretilen ve enfeksiyon biyoloji ^1-3 anlamak için bir temel atılmıştır. Bununla birlikte, mikrodizi, RNAseq dahil olmak üzere mevcut profil teknolojileri, enfeksiyon sırasında patojen gen ekspresyonunun profil için optimal değildir. RNA, enfeksiyon oluşmuş doku örneklerinden izole edilmiş toplam RNA'nın ezici kısmı (genellikle>% 99) oluşturmaktadır barındırır. Konak RNA mikrodizinlerinde yüksek arka katkıda bulunur ve dizi RNAseq okur hakimdir. Enfekte dokudan Patojen hücre izolasyonu, teorik olarak patojen RNA için zenginleştirmek için yardımcı olabilir, ancak ek olarak teşkilal problemleri: enfekte doku büyük miktarlarda gerektirir; prosedür sıkıcı olabilir; ve daha da önemlisi, bu uzun bir süreç boyunca yerel durum ya da RNA'nın bütünlüğü muhafaza etmek zordur. Gerçek enfeksiyonları sırasında patojen gen ifadesi üzerinde daha kapsamlı ve doğru veri elde etmek amacıyla, biz karışık RNA nüfusta azınlık RNA türlerinin güvenilir ve uygun maliyetli kantifizasyonunu bir protokol geliştirmek için yola çıktı.

NanoString nCounter ^{4, 5.} Bu platform QRT-PCR ile karşılaştırılabilir bir hassasiyet seviyesine sahip enzimatik amplifikasyonu gerektirmez dijital bar kodlu prob çiftleri kullanılarak gen ekspresyonunun doğrudan multiplekslenmiş ölçümü yapar yeni geliştirilmiş bir platformdur. Teknoloji genom çapında değil, her deneyde kadar 800 farklı genlerin saptanmasını sağlar. Bu nedenle, bu profil için problar olarak bilgilendirme genleri seçmek için çok önemlidir. Burada büyük bir uğultu çalışma profilleme gen ifadesini kullanmakÖrnek olarak invaziv enfeksiyon sırasında patojen, Candida albicans, göstermek için: 1) deneysel prosedürleri (protokol) Teknik ayrıntılar, 2) Bu yöntemin duyarlılığı, tekrarlanabilirlik ve dinamik aralık (temsilcisi sonuçları) ve 3) Önemli Bu protokol (tartışma) dayalı deney tasarlama ve gerçekleştirmek için dikkat edilmesi gereken noktalar. Bu protokol, kolayca çeşitli patojenler için adapte edilebilir ve başarılı bir şekilde enfeksiyon modellerinde ^6-9 bir dizi tatbik edilmiştir.

Protokol

Bütün hayvan prosedürleri Los Angeles Biyomedikal Araştırma Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından (protokol 011000) onaylı ve hayvanların etik tedavisi için Sağlık (NIH) kurallar National Institutes göre gerçekleştirilmiştir. Fareler Harbor-UCLA Araştırma ve Eğitim Enstitüsü kampüsünde bulunan bir AAALAC akredite tesis kafesli bulundu. Laboratuar hayvanları hekimliği konusunda uzmanlaşmış bir tam zamanlı veteriner onların bakımını yönetti. Kafes ve hayvancılık ABD Kamu Sağlığı Hizmetleri yayın "Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu" kurallarına göre sağlandı. Her girişimi insanca fareler tedavi etmek için yapılmıştır. Farelerin hayatta kalışı, sağlık günde üç kez izlenmiştir. Açıkçası hasta, uyuşuk fare grubundan ayrılmış ve acı en aza indirmek için ötenazi uygulandı. Euthanas Panel tarafından tavsiye edilen fareler doz aşımı pentobarbital (210 mg / kg) ile ötenazi uygulandıAmerikan Veteriner Hekimleri Birliği ia.

Dokular, Reaktifler ve Araçların 1. Hazırlık

1. Tüm çalışmalar için 20-22 g ağırlığındaki erkek Balb / c fareleri kullanın. Damar içine 1 x 10 ⁶ maya faz C deney grubu başına üç fare inoküle albicans hücreleri. Belirli zaman noktalarında sonrası enfeksiyon hayvanların ve hasat böbrekleri Kurban. Vidalı kapaklı bir tüp içine her bir böbrek yerleştirin daha sonra RNA ekstraksiyonu ⁶ -80 ° C 'de sıvı azot içinde dondurulması ve bir mağaza ek.
   Not: Xu ve ark detaylı olarak tarif edildiği gibi hayvan deneyleri gerçekleştirilmiştir ^6..
2. -80 ° C derin dondurucuda böbreklerin çıkarmadan önce aşağıdaki reaktifler ve araçları hazırlayın:
   1. Toplam RNA ekstraksiyon kiti açın. 2-merkaptoetanol ekleme (% 1 v / v) RLT tamponu ve (her bir örnek için 2 ml hazırlama) iyice karıştırın.
   2. Fenol hazırlayın: kloroform: izoamil alkol 25: 24: 1 (her bir örnek için 600 ul gerekir).
   3. Etiket M-tipi homojenizasyon tüpleri (M-tüp) ve buz üzerinde soğuk.
   4. Etiket 2 mi kap tüpleri vida ve her tüpe yaklaşık 300 ul zirkonyum boncukları ekleyin.
   5. Ara cihazları mevcuttur: Doku ayıracı, beadbeater, 50 ml tüpler ve 96 gözlü levhalar, fotometre adaptörleri ile masa santrifüj.

Enfekte Dokular 2. RNA Ekstraksiyon

1. -80 ° C derin dondurucuda böbreklerin içeren tüpleri çıkarın ve buz koymak. Her böbrekte 2-mercaptoethanol ile rlt tampon ml 1.2 ekleyin. M-tipi homojenizasyon tüpleri içine tampon ile böbrek Durusu.
2. Önceden yüklenmiş ayarı RNA_02.01 bir doku aynştıncı kullanarak böbrek homojenize.
3. Oda sıcaklığında, bir masa üstü santrifüjü içinde 1 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin.
4. Zirkonyum boncuklar içeren vidalı kapaklı tüpe 600 ul Homojenat aktarın. Buz üzerinde kalan Homojenat kaydedin.
5. 600 ul fenol ekleyin: kloroform: izoamil alkol 25: 24: 1 ilaÖnceki aşamada elde edilen borular.
6. 4 ° C soğuk odada 3 dakika süreyle beadbeater sıkıca kapaklarını kapatın ve vorteks.
7. 4 ° C soğuk oda 5 dakika boyunca 15.000 x g'de santrifüjleyin tüpler.
8. Dikkatle, yeni bir 1.5 ml mikrofüj tüpe sulu faz transferi% 70 etanol içinde eşit hacimde iyice karıştırın, daha sonra (iki kez yük) sıkma kolonu üzerine yüklenir.
9. Iki kez 500 ul tampon RPE ardından 700 ul tampon RW ile bir kez spin kolon yıkayın. Kuru toplama tüpüne Santrifüj bir ekstra dakika spin kolon kalan sıvıyı çıkarmak için. 8000 x g'de santrifüj tüm adımları uygulayın.
10. 50 ul _H2O ile Zehir RNA Bir spektrofotometre kullanılarak OD ₂₆₀ RNA konsantrasyonu ölçün.

3. Gen İfadesi Dijital Çizgi-kodlama kullanarak profilleme

1. Çözülme raportör karakterkümesi (yeşil kapak tüp) ve buz üzerinde yakalama karakterkümesi (gri kapak tüp).
2. Yeniden 130 ul hibridizasyon tamponu ekleyinporter karakterkümesi, mix ve aşağı dönmeye ters çevirin.
3. 12, reaksiyon tüplerinin her karışımın 20 ul ekle.
4. Her tüpe (5 ul bir hacim içinde) toplam doku RNA 10 ug ekleyin. Pipetleme karıştırın.
5. Her tüpe 5 ul yakalama karakterkümesi ekleyin. Hızlı bir dönüş aşağı ardından tüp çevirerek karıştırın.
6. Isıtılmış kapak O / N (~ 18 saat) ile birlikte, bir termal döngü 65 ° C 'de reaksiyonlar inkübe edin.
7. -20 ° C den bir numune kartuşunu çıkarın ve oda sıcaklığına sıcak olsun.
8. Bir masaüstü santrifüj 2 dakika boyunca 670 x g'de 4 ° C ve santrifüj, iki reaktif plakaları çıkarın.
9. Ekranda adım adım yönergeleri izleyerek hazırlık istasyonu kurmak yüksek hassasiyet seçeneği seçin.
10. Termal döngü gelen tepkileri çıkarın ve hemen hazırlık istasyonunda yükleyin. Yüksek hassasiyet programı (3 saat) çalıştırmak için seçin.
11. Hazırlık istasyonu programı tamamlandığında, kartuşu çıkarın ve net bir bant ile şerit mühür. Apkatlı kartuşun altına mineral yağ (nesil biri için nCounter sadece nesiller bu adımı gerekmez sonrası), daha sonra dijital analizörü üzerine kartuşu yükleyin.
12. Yüksek çözünürlüklü tarama seçeneğini ekrandaki adım adım talimatları takip ederek dijital analizörü ayarlayın.
13. Tarama programı (~ 4.5 saat), yüksek çözünürlük (600 alanlar) seçeneği seçin çalıştırın.
14. Tarama programı tamamlandığında, sonuçlar indirmek (veya e-posta yoluyla sonuçlar almayı tercih) ve üreticinin yazılımı içine ham veri aktarmak. Yazılım otomatik olarak veri kalitesini kontrol etmek ve verilerin kalitesi normal aralığın dışında kalırsa bayrakları çıkaracağız. Daha sonra bir excel dosyası olarak veri ihracat, (yazılım yönergeleri izleyin opsiyonel) Dahili fonksiyonunu kullanarak teknik ayarlama yapın.
15. Aşağıdaki yöntemlerden birini kullanarak verileri normalleştirmek: codeset tüm genlerden toplam sayıları; Bir ya da birkaç iç kontrol genleri; geometrik ortalamayüksek ölçüde eksprese edilen genler (tartışmaya bakınız).
16. Daha sonra farklı deney grupları arasında ifade düzeylerinin oranını hesaplamak, her genin (deney çoğaltır veya üç kez yapıldı ise) için ortalama ifade değerlerini hesaplayın.
17. (isteğe bağlı) analiz ve MultiExperiment Görüntüleyici ¹⁰ olarak nSolver yazılım veya bir kümelenme programında yerleşik işlevleri tarafından profilleme sonuçları görselleştirmek.

Sonuçlar

Patojen gen ifadesi in vivo profilleme için bir temel zorluk yeterli patojen RNA okur elde etmektir. Toplam RNA, toplam RNA, büyük miktarda patojen transkript düşük yüzdeli verilen (> 10 ug), her bir reaksiyon için kullanılacak sahiptir. Platform bu açıdan benzersiz bir avantaja sahiptir: bir yakalama probu ve ev sahibi RNA ezici bir miktar gürültü önemli bir seviyeye neden olmaz, böylece özgüllüğünü artırmak için bir rapor prob hem kullanır. İki enfekte doku örnekleri (mavi nokta) ham sayıları oluşturulan her şeyden 10. İfade veri iken Şekil 1'de gösterildiği gibi, (Ref uyarlanmıştır. 6), bir bulaşmamış doku örneğinden arka plan ham sayımları (kırmızı noktalar), tüm 10 altında olduğu Bu protokolü kullanarak son derece tekrarlanabilir. Şekil 1'de gösterildiği gibi, (Ref uyarlanmıştır. 6), ham sayıları iki biyolojik çoğaltır (mavi noktalar, 48 saat sonrası enfeksiyon böbrek örnekleri) çok goo vardıR-kare değeri d korelasyon, 0.945 eşittir. Platform ayrıca doğal biyolojik ifade seviyelerini kapsayacak şekilde yeterli dinamik aralığı sağlar (Şekil 1, ham sayıları ^{6 1} 10 ila 10 arasında değişmektedir).

Bir erken gen ifadesi tepki aşı ile 12 saat arasında anlamlı farklılık RNA düzeyleri genleri içerir: 248 çevre yanıt genleri belirten bir prob seti kullanarak, patojen geni (. Ref uyarlanan Şekil 2'de, 6) ifade iki aşamadan ayırt başardık Enfeksiyondan örnekleri (p <0.05 ve> ifadede 2 kat değişiklik), ve geç gen ifade yanıtı 48 saat sonrası enfeksiyon örneklerinde (P 12 saat zaman noktasında arasında anlamlı farklılık olduğu RNA düzeyleri ile genleri <0.05 içermektedir ve> 2 kat ifadesinde değişiklik). Bu sonuçlar göstermektedir C albicans gen ekspresyonu dinamik invaziv infectio sırasında düzenlenirbir memeli konakçının n.

Şekil Ham enfekte olan ve olmayan böbrek dokulardan sayar 1.. (. Ref 6 uyarlanmıştır) Sonda böbrek örnekleri dağılım olarak sunulmuştur iki enfekte (48 saat sonrası enfeksiyon, mavi veri noktaları) ve bir bulaşmamış (kırmızı veri noktaları) için sayar arsa. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

C Şekil 2. İfade albicans çevre duyarlı genlerin invaziv enfeksiyon sırasında (Ref uyarlanan. 6). ekspresyon düzeylerinde değişiklikler 248 C için fare böbrek işgali sırasında albicans genleri bir ısı m sunulmuşturap biçimi. Biyolojik kopyalardaki ortalama değerleri up-regülasyonu (sarı) için gösterilen ve 12, 24. genlerin (mavi), ve 48 saat sonrası enfeksiyon göreli düzenleme aşağı inokulum seviyeleri (0 saat) anlamına. Renk doygunluğu yukarı katlayın veya aşağı-regülasyon 10 tam doygunluk ile ifade değişimin boyutunu temsil eder. Isı haritası bölümleri temsilcisine kadar erken düzenlenen genlerin (üstte), geç genlerin (orta) ve erken aşağı düzenlenen genlerin (alt) göstermek için genişletilir. Bu porsiyonlar halinde, bireysel örnekler tekrarlanabilir göstermek için ayrı ayrı sunulmuştur. Biz aşı ve 12 saat örnekler arasında önemli farklılıklar gibi erken ifade değişiklikleri tanımlar. Biz 12 ve 48 saat örnekler arasında önemli farklılıklar gibi geç ifade değişiklikleri tanımlar. Önemi> 2 kat ve bir p-değeri <0.05 değişiklikler anlamına gelir. Ortalama değerler hesaplandı önce her bir numune için veri, kontrol geni TDH3 RNA düzeylerine normalleştirildi. Bizim atama kriterleri bazı Dynamica izinLly düzenlenen genler erken ve geç ifade sınıfları hem içine düşmek. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Bu protokol nanoString nCounter platformu kullanarak mikropların bulaşmasını kopyalanma profilleme optimize etmek için geliştirilmiştir. Bütün prosedür, ifade verileri doku toplama, en az 48 saat gerektirir. Hands-on defa 12 örnek için yaklaşık 4 saat olduğunu. Bu protokolde Bir anahtar değişken ilk aşamada dokuya eklenen tampon RLT miktarıdır. Çok az bir tampon fenol kloroform ile ekstraksiyon adımından sonra, viskoz jellerin oluşmasına yol açabilir ve RNA geri kazanımı için herhangi bir sulu faz bırakabilir ise çok fazla tampon, Homojenat seyreltilmiş ve RNA konsantrasyonunu düşürmek için yol açacaktır. (Tipik boyutları varsayarak) fare dokuları için tampon RLT arasında deneysel olarak tespit uygun hacimleri: böbrek (1.2 mi), dil (1.0 mi) ve akciğer (2.0 mi). Özellikle bu ipliksi formda yetişen mikrobiyal patojenler için, boncuk yenerek adım tamamen hücresel içeriği serbest bırakmak için açık kalın hücre duvarını kırmaya yardımcı olur. Elüsyon adımında, sırayla nihai RNA artırmak içinkonsantrasyon, ilk turu eluatı sütuna geri eklenir ve ikinci kez Zehir olabilir. Yaklaşık 100 ug toplam doku RNA için tek bir RNeasy spin kolon (~ 2 mg / ml x 50 ul) elde edilebilir. RNA daha fazla miktarda gerekli ise, ikinci bir preparatif kalan doku homojenatı yapılabilir. RNA konsantrasyonu ölçülmüştür kadar sadece durumda, kalan homojenatın atmayın.

Enfeksiyon modeline bağlı olarak, inokulum büyüklüğü ve patojen suş, toplam doku RNA patojen RNA yüzdesi% 0 -2% arasında değişir ve genellikle% 0.05% -0.5 aralığında düşüyor. C arasında toplam doku RNA Örneğin, 10 ug albicans ile enfekte saf C 10 ng eşit ham sayıları yaratabilir böbrek bir in vitro kültüründen albicans RNA (10 ng / 10 ug =% 0.1). Toplam doku RNA patojen RNA yüzdesi geniş bir aralıkta değişir, çünkü bu pathoge miktarını bilmek zor olduğuToplam RNA'nın belirli bir miktarda n RNA. Israf karakterkümesi önlemek için tespit seviyesinin altında patojen RNA ile numuneler üzerinde (250 x 192 genleri reaksiyonları için, reaksiyon başına maliyeti yaklaşık 200 $), bir RNA kalite kontrol adımı, her numune içindeki patojen RNA seviyesini belirlemek için gerçekleştirilebilir. Bu S-RTPCR ya da birkaç temizlik genleri ihtiva eden küçük bir karakterkümesi biri ile yapılabilir.

Patojen genler kullanılarak Normalleştirme, farklı örnekleri arasında mukayese edilebilir ifade profillerinin önce kritik bir adımdır. Normalleştirilmesi için üç yaygın olarak kullanılan yöntem vardır. Karakterkümesi tüm genlerden 1. Kullanım toplam sayar. 2. Bir veya birkaç 'temizlik' genler. 3. geometrik ortalama (N, N sayının ürünün kök ^th) yüksek ölçüde sentezlenen genlerin. Büyük bir karakterkümesi (> 100 gen), iyi bir seçim olabilir normalleşmesi için toplam sayıları kullanarak, rastgele seçilen sondalar içeren için çünkü ilgisiz genlerin olabilir inanç çok sayıda toplam sayılarıTam RNA girdi miktarı yansıtmaktadır. Küçük bir karakterkümesi (hifal büyüme genleri birlikte düzenlenir eğiliminde olduğu göz önüne alındığında bu tür hifal büyümesi gibi) belirli bir süreç odaklı sondalar içeren (<100 genler), birini seçerek ya da birkaç temizlik genler için normalleşmesi için kontrol şarttır olarak. TDH3, bir sağlam ifade metabolik gen, birçok deneyler için bir kontrol de hizmet vermiştir. Üçüncü yöntem son derece ifade genlerden eşit katkılarından dolayı bir vurgu ile, yöntem 1 ve 2 bir melez.

NCounter platformu genom çapında olmamasına rağmen, bu, tek bir deneyde 800 genlerin için ifade seviyesi ölçümü sağlar. Bu nedenle, analiz etmek en bilgilendirici genlerin seçme profilleme başarısı için kritik öneme sahiptir. Prob seçmek için iki yaklaşım kullanılmaktadır. İlk yaklaşım "temelli bilgi" dir. Yayımlanmış ifade ve işlevsel verilerden Bilgi akımına potansiyel ilgi genleri için ekrana derlenmişBu çevresel tepki genlerinin ^6-9 olarak çalışma. Bu yaklaşım, in vivo dolayısıyla veri yorumlama bağlamı sağlayan birçok mevcut veri setleri veri profilleme kolay karşılaştırılmasını sağlar. İkinci yaklaşım "tabanlı keşif" dir. Gibi transkripsiyon faktörlerini, kinaz veya hücre duvarı proteinlerinin belirten tüm genler gibi mikrop genomundaki genleri, kategorisi sondaları seçilmiştir. Bu yaklaşım, in vivo verileri ⁶ profilleme dayalı yeni virülans faktörleri ve yeni düzenleyici ilişkilerin keşif belirlenmesini sağlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS Dissociator	Miltenyl Biotec	130-093-235
gentelMACS M tube	Miltenyl Biotec	130-093-236
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
2-mercaptoethanol	Sigma	M-3148
Phenol:CHCl3:IAA	Sigma	P-2069
Zirconia beads	Biospec Products	11079110zx
Mini-Beadbeater-16	Biospec Products	607
nCounter Analysis system	nanoString Technologies
nCounter Gene Expression Codesets	nanoString Technologies
nSolver Analysis tool	nanoString Technologies