Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu

Özet

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

Özet

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Giriş

İmmünohistokimya (IHC) doku içinde proteinin tespit edilmesi için standart bir laboratuar tekniğidir ve IHC hala yaygın olarak araştırma ve teşhis patoloji hem de kullanılır. İHK boyama değerlendirme sonuçlarının yorumlanması içine potansiyel önyargı tanıtan genellikle yarı-kantitatif olduğunu. Birçok yarı nicel yaklaşımlar son tanıya ^1-4 içine boyanma yoğunluğu ve boyama ölçüde hem dahil olan geliştirilmiştir. Diğer sistemler daha iyi ifade ^5. lokalize etmek için puanlama yoğunluğu ve hücre içi konumunu içerir. Birden fazla izleyiciler ortalama puanları Ortaklığın genellikle tek izleyici önyargı ⁶ etkilerini en aza indirmek için kullanılmaktadır. Bu çabalara rağmen, analiz öznellik hala ⁷ boyanma ölçüde değerlendirirken, özellikle kalır. İnsan girişten Protokol standardizasyon ve minimize öznellik doğru, tekrarlanabilir İHK sonuçlar yaratmak için her şeyden önemlidir.

içerik "> dokular içinde protein ifadesini belirlemek için İHK yanı sıra diğer seçenek vardır. Böyle immunoblotting gibi diğer teknikler, protein ifadesini araştırmak için altın standart olarak görülüyor ise araştırma ayarı içinde, immünhistokimya geleneksel, protein lokalizasyonu ⁸ incelemek için bir araç olarak görülmüştür . belirlenmesi doku veya hücre bölmesi özgü ifade doku slaytlar üzerinde floresan antikor kullanımı makul bir uzlaşma vardır. hücre parçalanması veya lazer yakalama mikrodiseksiyon ^9,10 olarak gelişmiş teknikler içeren olmadan zordur, ama nedeniyle NADPH arka plan otofloresansı, lipofuscins, retiküler lifler, kollajen, elastin ve ¹¹ doğru niceleme zorlaştırabilir.

Otomatik hesaplama patoloji platformları patoloji boyaması ^12-15 daha objektif kantitatif için umut verici yönü vardır. Doku mikrodizinlerinde ile çok bantlı görüntüleme birleştirenbüyük örnek boyutlarda protein ekspresyonu yüksek verimli analizini kolaylaştırır. Kategorik biçimi ¹⁶ yerine, sürekli bir veri dönerken esas içsel hatalar ve analizi için gerekli zamanı hem de azaltarak, bu teknikler ile, protein, eş-lokalizasyonu, boyama heterojenliği ve doku ve hücre içi lokalizasyonu analizi mümkündür. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, çok bantlı görüntüleme yazılımı kullanılarak analiz ile çoklanmış immünohistokimyasal gerçekleştirmek için yararını ve metodolojisini göstermekti.

Bu protokol, dört optimize monoklonal antikorlar ile tek bir doku bölüm slayt kılavuzu, multipleks immünohistokimyasal için yazılmıştır. bir temsili olarak, çekirdek anti-tavşan östrojen reseptörü alfa (ÖRa) ve androjen reseptörü (AR) zara-bağlı anti-fare CD147 ve membrana bağlı anti-fare E-kaderin ile çoklanır. tercih edilen herhangi bir antikorun substitut edilebilirBurada listelenen antikorlar için ed, ancak antikorların her kombinasyonu ayrı optimizasyon gerektirir. Tüm antikorlar için ön işleme tabi tutulması aynı olmalıdır. AR ve CD147 antikorlar, bir kokteyl olarak ayrı ayrı ve optimize edilmelidir. Her antikor, biyotin-bir polimer sistemi ve 4 benzersiz kromojenler biri kullanılarak tespit edilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Not: protokolü, burada daha önce tarif edilen ^12,17,18 boyama ve doku mikrodizisi (TMA) analizini tarif eder. 4 um kalınlığında TMA bölümü, standart bir mikrotom kullanılarak parafin bloğu elde edilmiştir.

NOT: 4 kromojenlerin ve karşıt için spektral kütüphane görüntü kantitatif için oluşturulmalıdır. Bunu yapmak için, her bir antikor için optimize protokol bir slayt başına antikor, eksi son counterstain ile çalıştırılmalıdır. Beşinci slayt spektral kütüphane oluşturmak için gerekli 5 görüntüleri oluşturmak için hematoksilen ile boyanmış olmalıdır.

1. Multiplex İmmunohistokimya

1. 20 dakika boyunca 60 ° C'lik bir fırında kayar. Bir kimyasal davlumbaz kullanarak,% 100 ksilen slayt batırmayın. ksilen 2 değişiklikler için tekrarlayın. 5 dakika boyunca% 100 etanol içinde slayt bırakın. Taze% 100 etanol ile tekrarlayın.
2. 3 dakika boyunca% 95 etanol içinde slayt bırakın. Taze tekrarlayın% 95 etanol. 3 dakika boyunca% 70 etanol içinde slayt bırakın. 3 dakika için damıtılmış su içinde slayt bırakın. taze damıtılmış su ile tekrarlayın. Tap slayt dikey slayt suyu tahliye etmek. 5 dakika için hazır kullanım endojen peroksidaz engelleyici 200 ul uygulanır.
3. slayt peroksidaz engelleyici boşaltın ve (7.0 daha az pH) 45 ml hazır kullanıma alma tampon batırmayın. bir düdüklü tencere koyun slayt konteyner ve başlangıç ​​programı 4 dakika boyunca 124 ° C'ye kadar ayarlayın. düdüklü tencere 20 dakika soğumasını bekleyin. açmadan önce.
4. alma tampon kabını çıkarın ve ek 10 dakika soğumasını bekleyin. 10 dakika için damıtılmış su içinde slayt durulayın. slayt suyu boşaltın ve dikkatli hidrofobik bir bariyer kalem ile slayt doku tasvir.
5. Nemli gazlı bez içeren kapak (kuluçka bölme) ile düz bir hazne için fosfat tampon salin (PBS) .Transfer sürgünün 200 ul ekle.
6. 1x 1 litre hazırlamak 50 m seyreltilerek Tween-20 (TBST) ile tuzlu su Tris tamponlu20x Tris L% 1 Tween-20 ve 950 ml damıtılmış su ihtiva eden tamponlu tuz.
7. slayt PBS boşaltın ve 1x TBST 200 ul geçerlidir. 2 dakika kuluçkalayın. slayt TBST boşaltın ve kuluçka odasına slayt dönün. Ready-to-üniversal proteini blok yakın odasının 200 ul uygulayın ve 7 dakika boyunca inkübe edin.
8. Protein bloğu boşaltın ve kuluçka odasına slayt dönün. Anti-ÖRa antikoru 1 seyreltin: 400 antikoru seyreltici 239,4 ul antikor 0.6 ul ekleyerek. slayt seyreltilmiş antikor ve yakın odasının 200 ul uygulayın.
9. 2 saat için oda sıcaklığında slayt inkübe edin. slayt antikor boşaltın ve TBST içinde 5 dakika için daldırma ile, ardından TBST ile yıkayın.
10. slayt TBST boşaltın ve kuluçka odasına slayt dönün. Hazır kullanımlı keçi anti-tavşan yaban turpu peroksidaz polimer ve kapalı bölmenin 200 ul uygulanır. 30 dakika boyunca inkübe edin. oda sıcaklığında. 5 dakika boyunca TBST kabın içinde TBST ve yer slayt ile durulayın slayt.
11. 250 ul DAB substrat tamponuna DAB kromojeninin 8 ul ekleyerek ve iyi karıştırılarak kromojen kahverengi yaban turpu peroksidaz-3,3'-diaminobenzidin (HRP-DAB) hazırlayın.
12. kuluçka odasına slayt, dönüş slayt TBST boşaltın ve 6 dakika süreyle kahverengi HRP-DAB kromojeninin 200 ul geçerlidir. İyice damıtılmış su bir kap içinde damıtılmış su ve yer slayt slayt yıkayın.
13. ikinci tampon reaktif 150 ul birinci yıkama reaktif 50 ul birleştirerek denatüre çözüm karıştırın. slayt kapalı suyu boşaltın ve 3 dakika boyunca slayt seyreltilmiş denatüre çözümü uygulayın. oda sıcaklığında. Süzün ve TBST ile reaktif denatüre yıkayın. 5 dakika boyunca TBST slayt daldırın.
14. Anti-AR antikoru 4.2 ul ve antikor seyreltici 203 ul anti-CD147 antikor 2.8 ul seyreltilmesi ile AR / CD147 antikor kokteyli hazırlanır. , Slayt TBST boşaltın kuluçka odasına slayt dönmek ve AR / CD147 c 200 ul uygulamakslayta ocktail. Yakın odası ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. 5 dakika boyunca TBST içinde durulayın TBST ile slayt ve batırmayın.
15. TBST, kuluçka odasına geri dönüş slayt boşaltın ve hazır-to-use keçi anti-tavşan alkalin fosfataz polimerin 200 ul geçerlidir. Yakın odası ve 30 dakika inkübe slayt. oda sıcaklığında. 5 dakika boyunca TBST içinde durulayın TBST ile slayt ve batırmayın.
16. 250 ul kırmızı kromojen tampon kırmızı kromojeninin 3.2 ul ekleyerek kromojen kırmızı alkalin fosfataz hazırlayın ve iyice karıştırın.
17. slayt TBST boşaltın ve kuluçka odasına slayt dönün. Slayt yakın bölmeye seyreltildi kırmızı alkalin fosfataz kromojen 200 ul uygulayın ve 7 dakika boyunca inkübe edin.
18. kromojen boşaltın ve iyice distile su ile slayt durulayın. 5 dakika için damıtılmış su içinde, bir kap içinde slayt yerleştirin. , Slayt suyu boşaltın TBST ile yıkayın ve kuluçka odasına geri dönün. slayt ve Clos'a 200 ul keçi anti-fare-HRP polimer uygulanırE odası. 30 dakika boyunca inkübe edin. oda sıcaklığında.
19. slayt polimeri boşaltın ve TBST ile yıkayın. 5 dakika boyunca TBST Place slayt. tampon 250 ul stabilize edici reaktif 3.2 ul ekleyerek mor HRP-bağlı kromojen 200 ul hazırlayın ve iyice karıştırın. mor kromojeninin 3.2 ul ekleyin ve sonra, iyi hidrojen peroksit reaktif 3.2 ul karıştırın ve iyice karıştırın.
20. slayt TBST boşaltın ve slayt ve 7 dakika inkübe hazırlanan mor kromojeninin 200 ul geçerlidir. oda sıcaklığında. 5 dakika boyunca distile su bir kap içinde saf su ve yer kaydırağı ile durulayın slayt.
21. ikinci tampon reaktif 150 ul birinci yıkama reaktif 50 ul karıştırılarak denatüre çözüm karıştırın. slayt kapalı suyu boşaltın ve 3 dakika boyunca slayt seyreltilmiş denatüre çözümü uygulayın. oda sıcaklığında.
22. TBST ile ayıraç kapalı denatüre durulayın. 5 dakika süreyle TBST içinde kapta slayt yerleştirin. Anti-e-kaderin antikor sulandırmakAntikor seyreltici ul 218.9 1.1 ul antikor eklenerek 200: 1. kuluçka odasına slayt, dönüş slayt TBST boşaltın ve slayt E-kaderin 200 ul geçerlidir. Yakın odası ve 30 dakika kuluçkalayın. oda sıcaklığında.
23. 5 dakika boyunca TBST kabın içinde TBST ve yer slayt ile durulayın slayt. kuluçka odasına slayt dönmek, slayt TBST boşaltın ve 200 ul keçi anti-fare HRP polimer uygulayın. 30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. 5 dakika boyunca TBST kabın içinde TBST ve yer slayt ile durulayın slayt.
24. Siyah 250 ul tampon kromojeninin 8 ul ekleyerek kromojen HRP-bağlantılı hazırlayın. slayt ve 2 dakika için geliştirmek kromojen 200 ul uygulanır. Damıtılmış su ile iyice yıkayın ve bir slayt damıtılmış su konteyner içinde bırakın.
25. distile su 200 ul 40 ul hematoksilin ekleyerek hematoksilin sulandırmak. slayt suyu boşaltın ve 30 saniye boyunca slayt seyreltilmiş hematoksilen 200 ul geçerlidir. durulama slaytİyice 2 dakika için akan musluk suyu., daha sonra, 30 saniye için damıtılmış su içinde durulanır. 15-30 dakika süreyle, 60 ° C fırına yerleştirilmiştir kayar.
26. 30 saniye taze hazırlanmış% 100 ksilen slayt daldırın aşırı ksilen silin ve kalıcı montaj medya bir damla ekleyin. Bir numaralı 1.5 lamel ile lamel.

2. Otomatik Görüntü Alma ve Analiz

1. otomatik slayt tarayıcı üzerine lekeli slaytlar yükleyin. TTB çekirdek çapı, ayrılık ve sayısına bağlı, üreticinin kılavuzuna göre otomatik tarama protokolü oluşturun.
2. Açık multispektral görüntüleme yazılımı bireysel kromojenlerin ve hematoksilen lekeli slayt ile boyanmış kontrol slaytlar bir spektral kütüphane kurmaya. Bir kontrol slayt alınan bir görüntü küpü açın ve optik o kromojen tanımlamak için dört beş olumlu boyanan alanları seçin. Tam bir spektral kütüphane representi kadar diğer kontrol slaytlar görüntü küpleri ile tekrarlayınTüm kromojenleri ng oluşturulan ve daha sonra spektral kütüphane tasarruf edilir.
3. multispektral görüntüleme yazılımı içinde yeni bir projeye başlamak. Seç "Multispektral (.im3)" örnek biçimi için görüntü formatı seçeneği ve "Aydınlık" için. "Skor", "fenotiplendirme" "Özellikler Find", "Segment Dokusu" ve "İhracat": Birincisi, istenen seçenekleri seçerek projeyi yapılandırın. Bu noktada, resim çözünürlüğü istenirse analiz süresini hızlandırmak için değiştirilebilir.

3. Doku Segmentasyon

1. Önceden oluşturulan spektral kütüphane İthalat ve analize dahil edilecek tüm kromojenleri seçin.
2. Açık görüntü küpleri "Görüntü Aç Cube" seçeneğini seçerek belirlenen eğitim verilerine dahil edilecek. Eğitim doğruluğunu sağlamak için, görüntülerin toplam sayısının en az% 18 oranında seçmek analiz edilecek. segmentasyon doğruluğunu artırmak için tüm hastalık durumlarını temsil görüntüleri seçin. Görüntülerin bu kısmı is görüntülerinin eğitim seti çağırdı.
3. göz damlası aracı seçerek ve beyaz bir görüntüdeki bir alanı seçerek belirlenen eğitim beyaz dengesi görüntüler.
4. Doku segmentasyonu geçmek için "Advance" düğmesini seçin. Doku tiplerini seçmek için "Doku Kategoriler" paneli kullanın (yani "doku" ve "non-doku") analiz edilecek. Daha doğru bir protein doku lokalizasyonu için, birden fazla doku kategoriler (yani. "Epitel", "stroma" ve "non-doku") kullanılabilir.
5. algoritması oluşturma ve eğitim görüntülerin içindeki hücrelerin grupları etrafında çizerek doku kategorilerini tanımlayan başlayın. bir doku kategorisinde bittiğinde, diğer doku kategorileri için tekrarlayın. Bu doku kategorisi Çeşidi karakteristik görüntülerin içindeki hücrelerin gruplarını seçmek için emin olun.
6. görüntülerinin eğitim seti içindeki tüm görüntüler için bu işlemi tekrarlayın.
7. Seçin parçaları (kromojenleri) trai dahil edilecek"Doku segmenter" için ning. aydınlık immünohistokimya görüntü analizi yaparken, tüm bileşenler, normal olarak eğitim dahildir. Bu aşama sırasında önyargı önlemek için ayarlanmış eğitim bol negatif boyama görüntüleri içerir.
8. Doku segmentleştiriciyi eğitimi için uygun bir "Desen Ölçeği" seçiniz. 20X büyütme altında, bir büyük model ölçeği genellikle uygundur. yüksek büyütme altında ince bir mimariye sahip dokular ile çalışırken, daha küçük bir model ölçeği daha uygundur.
9. Doku segmentleştiriciyi eğitim başlatmak için "Tren Doku segmenter" düğmesini seçin. Düzgün sınıflandırılır eğitim bölgeleri içindeki piksellerin oranını yansıtan bir pop-up kutusu görüntüleyen doğruluğunu gözlemleyin.
   NOT: Yazılım sürekli elle durdurulana kadar algoritmanın doğruluğunu geliştirmek için çalışır. Biz daha önce% 97 eğitim doğruluk ¹² görüntüler sonuçların% 18 o eğitimi göstermiştir.
10. Doku segmenter eğitimli sonra, uygun bir segment çözünürlüğü seçin. Segment çözünürlüğü daha az zaman ve para cezası çözünürlük daha fazla zaman gerektiren gerektiren kaba çözünürlükte segment görüntüleri için gerekli süreye karşılık gelir.
11. Segment "Segment Görüntüleri" tıklayarak görüntülerin tüm eğitim seti. Yazılım yeterli zaman tüm eğitim görüntüleri algoritması uygulamak için izin verir. Bittiğinde, mevcut eğitim algoritması ile herhangi Yanlış sınıflandırılmış doku bulmak için ayarlanmış eğitim gözden geçirin.
12. ince ayar yapmak için doku segmentasyon işlemi, eklemek, düzenlemek veya doku eğitim bölgeleri kaldırın. piksel başka bir bir doku kategorisinde kenarlarında uzatmak durumunda "süs kenarları" seçeneğini kullanın. piksel küçük gruplar Sınıflandırılmamış ise, asgari bölüm boyutu eşiği ayarlayın.
13. düzenlemeler, seçme "Segment Görüntüler" tamamlandığında, bu doku segmentasyonu için yeni bir algoritma oluşturmak için doku segmentleştiriciyi yeniden eğitecek. Bir önceki algoritmaotomatik olarak kaydedilir ve gerekirse iade edilebilir.
14. Ne zaman emin doku segmentasyon algoritması sonuçları, "Advance" düğmesini seçerek hücre segmentasyon ilerlemek.

4. Hücre Segmentasyon

1. Seç hücre içi bölmeleri hücre segmentasyon dahil edilecek. "Çekirdekler" zaten "Sitoplazma" ya da "Membran" seçmek için seçili olduğundan emin olun.
   Not: bir zar-özgü protein işaret, E-kadherin gibi IHC dahil edildiğinde "Membran" segmentasyon yalnızca seçilmelidir.
2. "Çekirdekler" sekmesine içinde, çeşitli seçenekler vardır. Nükleer segmentasyon için uygun ayarları seçerek başlayın (adım 4.3). bireysel ya da tüm doku kategorileri segmentasyon dahil edilecektir seçin.
3. Nükleer segmentasyon için bir yaklaşım seçin
   1. İyi elde edilmesi için basit bir yöntem için counterstain "piksel-esaslı (eşik)" yaklaşımı seçmekgörüntü işleme ayarları hakkında çok bilmeden sonuçları.
      NOT: Bu genellikle iyi bir ilk seçim yapar. bir yaklaşım, "Pixel Tabanlı (Eşik)" seçerken, güvenilir bir nükleer karşı-leke olduğunda tutarlı nükleer karşıt eksikliği varsa "Tabanlı Object" kullanılması gerektiğini ise, daha uygundur.
   2. güvenilir bir nükleer counterstain olduğunda "Pixel Tabanlı (Eşik)" yaklaşımı seçin.
      NOT: Bu yaklaşım tamamen piksel tabanlı olduğunu. Bu yaklaşım, aynı zamanda, bir IHC leke pozitif leke doku kategori içindeki bütün pikseller tespit gibi basit bir eşik değeri ile memnun diğer görüntü analiz ihtiyaçları için kullanılabilir.
   3. Nükleer counterstain nükleer nesnelerin tutarlı ve özel boyama sağlamaması halinde Nesne Tabanlı yaklaşım seçin ve daha gelişmiş morfometri-temelli yaklaşımlar çekirdekleri tespit etmek için ihtiyaç vardır.
   4. "Nucl" Nükleer segmentasyonu için Bileşenleri "seçinKulak Boyut "ve" Temizlik-up "kullanıcı daha çekirdekler segmentasyon ayarlarını tanımlamak istiyorsa.
4. sitoplazma şekil parametreleri seçin
   1. sitoplazma segmentasyon geçmek için "Advance" düğmesini seçin.
      NOT: Seçim için sitoplazma segmentasyon içinde çeşitli seçenekler vardır. "Çekirdeğe iç mesafe" olarak adlandırılan bir seçenek piksel tabanlı. Bu çekirdeğin dış ve sitoplazma içi arasındaki mesafe yansıtır. Bu değeri artırmak nükleer sinyal sitoplazma bölmeye üzerine çarpılar olasılığını azaltır.
   2. Sonraki seçeneğini, "dış mesafe çekirdeğine".
      Not: Bu aynı zamanda, piksel tabanlı. çekirdeğin dış mesafeden çekirdeğinin dış ve hücre dışı arasındaki mesafe yansıtır. Bu değeri ya da istenirse membran sinyallerini hariç tutmak için büyük veya küçük yeterli ayarlanabilir.
   3. Sonraki seçeneğini "minimum boyutu".
      NOT: Minimum boyut, PIXEtemelli l analize dahil edilecek asgari sitoplazma örneklem büyüklüğü yansıtır. sitoplazma boyutu tür hücreler sıkı birlikte paketlenmiştir olduğu gibi belirli bir hücrede küçükse, bu sitoplazma segmentasyon analize dahil edilmiştir.
   4. Bir sonraki seçenek, "İlköğretim", "İkincil" ile "Bileşeni" seçin ve ikincil seçenekleri olarak "üçüncül" seçeneğini seçin.
      NOT: Burada biri belirli bir sitoplazma işaretleyici seçebilirsiniz. Belirli bir sitoplazmik IHC markör kullanılmış ise nükleer segmentasyon benzer bir şekilde, bu bileşen, bir asgari eşik değerini bularak sitoplazma tanımlamak için kullanılabilir. Bu sitoplazma tanımlanmasında yardımcı ama kabul edilebilir doğruluk için gerekli değildir.
   5. Üç sekmeli seçeneklerin son taşıma "Membran" dir. Burada kullanıcı bir protein işaretleyici ile membran yuvasını tanımlar. , "Primary" Seç "İkincil" ve / veya kullanılan her zar özel bir belirteç için "Tersiyer". Ayarlayın "Tam Ölçekli OD "asgari eşik veya hücre zarlarının her işaretleyici için olumlu bulmak için.
   6. "Membran" sekmesi altında devam eden ve seçeneği "Maksimum Hücre Boyutu" seçeneğini seçin.
      NOT: Bu hücrelerin en büyük boyutunu belirtir piksel membran değerine mesafe vardır. 12 değeri 20X büyütmede çekilen görüntüler için normalde uygundur.
   7. tüm seçenekleri seçtikten sonra, "Segment Image" veya "Segment All" seçeneğini seçin. Görüntülere ayarları uygula ve "bireysel" ya da "Galeri" modunda onları gözlemlemek.
      NOT: Gerekirse ayarları ve eşikleri ayarlayın ve görüntülerinin eğitim seti hücre segmentasyon sonuçlarından memnun kadar yeniden segmenti.

Hücrelerin 5. fenotipleme

Not: Doğru hücre parçalara ayırma, doğru hücre fenotiplendirilmesini elde edilmesi için gerekli olan ve fenotipleme özelliği öğretilebilir mesafesindedir.

1. Kullan "Ekle &# 34; düğmesi "Fenotipleri" listesine fenotipleri ekleyin. Kullanıcılar fenotip için bir renk seçebilirsiniz.
2. Bir hücreye bir fenotip atamak için "Düzenle fenotipleri" üzerine tıklayın. fenotip belirledikten sonra taşımak için kullanıcı sağlayan bir açılır menü getirmek için belirli bir hücreyi tıklayın. devam etmek için, her bir fenotipi en az beş (5) hücreleri tanımlamak. Her bir fenotip 25 ya da daha fazla hücre seçimi en iyi sonuçları elde etmek için gereklidir.

6. Puanlama İHK ve Co-Yerelleştirme

1. Adım "Skor İHK veya IF" geçmek için "Advance" i seçin. gol "Doku Kategori" seçiniz.
   NOT: Sadece bir doku kategori, belirli bir analiz sırasında atılır, ancak başka bir doku kategorisinde skorlama sonuçları isteniyorsa, analiz daha sonra farklı ayarlarla tekrar edilebilir.
2. istenen "Puanlama" türünü seçin.
   NOT: Pozitiflik ilgi bileşeni için (olumlu ve olumsuz) iki depo oluştururÇift pozitifliği co-lokalizasyon analizi için kullanıldı ise. Diğer seçenekler 4-bin, 10 bin ve 50 bin seçim marker için analiz içerir.
3. analizi puanlama kullanılacak hücrenin "Bölme" seçiniz.
4. Primer nükleer bileşen için asgari eşik bulma benzer şekilde, "Görünümü Bileşen Verileri" seçin ve ilgi bileşen (ler) için pozitif hücreler için boyama uygun optik yoğunluk minimum eşikleri bulmak için eğitim görüntüleri üzerine imleci.
5. yoğun lekeli hücrelerin hariç tutulacak ise, uygun bir seviyeye eşik max indirin. Aksi takdirde, analiz için bir eşik maksimum seçmek için otomatik düğmesini kullanın.
6. eşikleme değerlerini doğrulamak için puan görüntüleri eğitim seçin.
   NOT: Belirli bir çöp kutusu içinde hücrelerin yüzdesi iade edilecektir ve görsel denetim veya manuel sayımı ile mukayese edilebilir. Tamamlandığında, "İhracat" aşamasına geçmek için "Advance" i seçin.

7. Algoritma ve Toplu Analizi uygulamak

1. Eğitim kümesi için veri ihraç ederek doku segmentasyonu, hücre segmentasyonu ve puanlama değerleri yoluyla oluşturulan algoritma test edin. ihracat dizini için yeni bir klasör oluşturmak için yönergeleri izleyin. Seç resimler ve tablolar oluşturulmuş ve analize dahil edilecek. "Herkes için Export" seçerek analiz gerçekleştirin.
2. Tablolar sekmesi ayrılmış metin dosyaları ihraç edilmektedir ve çoğu veri analiz programları açılabilir.
3. Analiz tamamlandığında, ayarların doğruluğunu değerlendirmek için yüksek ve düşük lekelenme hem görüntüler için hücre parçalama ve puanlama verilerini görüntülemek.
4. ayarlarla memnun olduğunuzda, toplu analizi yoluyla görüntüleri tüm dizi görüntülerinin eğitim setinden oluşturulan algoritma uygulanır. "Toplu Analizi" sekmesine tıklayın ve açılan algoritmanın etkin bir projeden kopyalanmış olacaktır.
5. Yeni ihracat dizini seçin ve hangi görüntü ve tabl seçines analize dahil edilecektir. girdi dosyaları seçeneği altında, seçme "Resim Ekle" ve tüm görüntüleri toplu analize dahil edilecek seçin.
6. "Çalıştır" seçeneğini seçerek analiz gerçekleştirin. Eğitim setinin analizi ile olduğu gibi, bu adımı belirli ayarları ve analize dahil görüntülerin sayısına bağlı olarak, bir zaman değişken miktarda gerektirir.
7. Tamamlandığında, "Değerlendirme / Merge" sekmesine ilerlemek. istenirse toplu analizi ihracat dizin ve toplu dizin varsayılan değiştirilebilir. Seç "Tüm Dahil" ve analiz için özet verileri ile veri sayfaları oluşturmak için "Birleştirme" seçeneğini seçin.

İhraç Verilerin 8. Analiz

1. veri analizi yazılımı ihraç tabloları açın ve kaldırmak veya bu tür her bir bileşen için minimum ve maksimum değerler olarak analiz alakasız veri sütunları gizlemek. Analizlerde kullanılan birincil veri ortalama optik yoğunluk C olanHer bir bileşen için olumn.
2. İnceleme ihraç segmentasyon Haritaları ve ham görüntüleri analiz dışında edilecek olan numune veya TMA çekirdekleri belirlemek için. Doku yüzde değerleri dışlama kriterleri için en sık kullanılan <% 5 keyfi bir kesme ile, bir örnek dahil edilmelidir belirlerken ya da yardımcı olur.
3. alakasız veri veya örnekleri içeren satırlar veri analiz dışında olması çıkarın.
4. Hastalık durumunda değişiklik ya da hastalık ^12,18-21 bir klinik-patolojik özellikleri ile ilişkisini araştırmak protein ölçümü verileri kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 1 'de, bir eğitim olmayan doku bölümünde birlikte, stromal ve epitelyal kısımlarına kademeli görüntüleri prostat dokuları üzerinde gerçekleştirilir. Epitelyal membran markör E-kadherin kullanarak, hücre parçalara ayırma, Şekil 2'de gösterilen çekirdek, sitoplazma ve membran kısımları, ayrı yapıldı.

Bir deneyde, Şekil 3'te gösteri...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Protein ifade değerlendirmek için geleneksel immunohistokimyasal kullanımı analizi ^22,23 öznel, yarı nicel yöntemler ile sınırlıdır. Peşin platformları biyobelirtecin ifade ve lokalizasyon yüksek verimlilik analizi için yaratılmıştır. doku ve hücre içi bölmeleri hem Detaylı segmentasyon kullanıcıları diğer ilgi işaretleri ile biyobelirteç ifade, yerelleştirme ve ko-lokalizasyon çalışma sağlar. Daha önceki çalışmalarda, aynı hücresel bölme ^18,20,21 lokalize p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Chemical	X3F1GAL	NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0
Ethyl Alcohol-200 proof	Fisher Scientific	4355223	NFPA rating: Health – 0, Fire – 3 , Reactivity – 0
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0
Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl	Fisher Scientific	BP153-1	NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0
Tween 20	Chem-Impex	1512	NFPA rating: Health – 0, Fire – 1 , Reactivity – 0
Phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	BP2944-100	NFPA rating: Health – 1, Fire – 0 , Reactivity – 0
Peroxidazed	Biocare Medical	PX968	Avoid contact with skin and eyes. May cause skin irritation and eye damage.
Estrogen Receptor alpha	Thermo Fisher Scientific-Labvision	RM9101	Not classified as hazardous
Androgen Receptor	SCBT	sc-816	Not classified as hazardous
CD147	Biodesign	P87535M	Not classified as hazardous
E-cadherin	Dako	M3612	Not classified as hazardous
Renoir Red Andibody Diluent	Biocare Medical	PD904	It is specially designed to work with Tris-based antibodies
DeCloaking Chamber	Biocare Medical	Model DC2002	Take normal precautions for using a pressure cooker
Barrier pen-Immuno Edge	Vector Labs	H-4000
Denaturing Kit-Elution step	Biocare Medical	DNS001H	Not classified as hazardous
Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer	Biocare Medical	RHRP520	Not classified as hazardous
Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer	Biocare Medical	RALP525	Not classified as hazardous
Mach 2 Goat anti-Mouse HRP Polymer	Biocare Medical	M3M530	Not classified as hazardous
Betazoid DAB Chromogen Kit	Biocare Medical	BDB2004	1. DAB is known to be a suspected carcinogen. 2. Do not expose DAB components to strong light or direct sunlight. 3. Wear appropriate personal protective equipment and clothing. 4. DAB may cause sensitization of skin. Avoid contact with skin and eyes. 5. Observe all federal, state and local environmental regarding disposal
Warp Red Chromogen Kit	Biocare Medical	WR806	Corrosive. Acid that may cause skin irritation or eye damage.
Vina Green Chromogen Kit	Biocare Medical	BRR807	Harmful if swallowed
Bajoran Purple Chromogen Kit	Biocare Medical	BJP807	Flammable liquid. Keep away from heat, flames and sparks. Harmful by ingestion or absorption. Avoid contact with skin or eyes, and avoid inhalation.
Cat Hematoxylin	Biocare Medical	CATHE	Purple  solution  with  a  mild  acetic  acid  (vinegar)  scent.  May  be  irritating  to  skin  or  eyes.  Avoid  contact  with  skin  and  eyes.  Avoid  ingestion.
XYL Mounting Media	Richard Allen	8312-4	NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0
1.5 Coverslips	Fisher Brand	22266858	Sharp edges
Incubation (Humidity)Chamber	obsolete	obsolete	Multiple vendors available
Convection Oven	Stabil- Therm	C-4008-Q
Background Punisher Blocking Reagent	Biocare Medical	BP974	This product is not classified as hazardous.
inForm software	PerkinElmer	CLS135781	Primary multispectral imaging software used in manuscript
Nuance software	PerkinElmer	Nuance EX	Software used for making spectral libraries within manuscript
Vectra microscope and slide scanner	PerkinElmer	VECTRA	Automated slide scanner and microscope for obtaining IM3 image cubes