İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

Özet

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Özet

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

Giriş

hücre ve moleküler biyoloji en güncel çalışmalar nüfus ortalamasına dayanmaktadır. küçük popülasyonlar biyolojik süreçlerin ve hastalık sonucu önemli roller oynayabilir Bununla birlikte, önemli biyolojik olaylar bu geleneksel toplum tabanlı analizler maskelenmiş olabilir. Tek hücre düzeyinde heterojen popülasyonlar gen ifadesini anlama (ve vardır) ilgili biyolojik ve klinik Insights ^1,2 yol açabilir. Embriyonik gelişim çalışmalarına ilgilendiren, daha büyük bir hücre popülasyonunda, progenitör hücreler, çoğunlukla az temsil edilmektedir zorlu sonuçta hücre kaderinin kararları ³ başlatmak gen ifadesinde ince değişiklikleri tespit etmek için yapım. Benzer şekilde, tek bir hücre tipi ^mikro-4 tepki olarak farklı ekspresyon profillerine sahip olabilir. Örneğin, (örneğin., Aort veya böbrek) aynı organ veya farklı organlarda yerleşik endotel hücreleri ortak Morp paylaşımı rağmen önemli heterojeniteye sergilerlerlitolojik ve fonksiyonel özellikleri ^5. Buna ek olarak, aynı tümör doldurma kanser hücreleri, aynı zamanda, tek hücre düzeyinde ⁶ moleküler profiller ya da mutasyonlar farklı olabilir.

Modeli sistemlerinde, tek hücre transkriptomik başarılı yeni hücre popülasyonu tespit hücre farklılaşması sırasında meydana gelen ara durumları, özelliği ve ^7,8,9 uyaranlara diferansiyel hücresel tepkileri ortaya çıkarmıştır. Bu tür anlayışlar, geleneksel toplum tabanlı çalışmalarda maskeli olurdu. Zebra balığı embriyolar kök, dede bir derece altında kullanılan kaynağıdır ve geliştirme sırasında tek hücre heterojenite ve hücresel kimliklerin moleküler düzenleme soruları keşfetmek için hücrelerin ayırt. Onların son derece basmakalıp, ex vivo geliştirme ve genetik manipülasyon kolaylığı onlara bu yaklaşımın ^10,11 için mükemmel bir model sistem olun. Özellikle, tek hücre gen yorumlanması önemli bir sınırlamae ifade veri gelişimi sırasında yeni ara hücre devletlerin güvenilir kimlik doku koleksiyonu ⁹ çok dikkatli zamanlama gerektirir. Bu tutulan hücre arasındaki farklılıklar, yaşa bağlı hücre farklılaşması tarafından sunulan gen ekspresyonu, tek bir zaman noktasında bir doku içinde heterojen yerine heterojen temsil sağlamak için gereklidir. Fareler ile karşılaştırıldığında, zebra balığı embriyo gelişimi tam olarak embriyoların ¹² çok sayıda senkronize edilebilir. Buna ek olarak, geniş bir kavrama boyutları ile, zebra balığı embriyolar kök ve projenitör hücre bol kaynağı olarak kullanılabilir.

Bu protokol, zebra balığı embriyoların hücreleri izole etmek ve QRT-PCR ile gen ekspresyon analizi için ticari olarak temin edilebilir, entegre Mikroakiskan devresi (IFC) çipi ve otoprep sistemi kullanılarak tek hücre yakalamak için bir yöntemi tarif etmektedir. Bu protokol, bütün dahil olmak üzere herhangi bir yüksek verimli çoğullama deneyleri hızla devredilecek olabilirHücresel heterojenite ¹³ daha kapsamlı analiz sağlar transcriptome sıralama. Ayrıca, geleneksel gen sentezleme tahlilleri için çeşitli avantajlar sağlar. Tek hücre izolasyon protokolü alt uygulamalar dahildir tehlikeye hücrelerinin oranını azaltır FACS sonrasında yüksek canlılığı, elde edilir. Bir IFC kullanarak, yakalanan hücreler doğrudan yakalama oranlarını değerlendirmek ve morfolojik hücre sağlığını değerlendirmek için görülebilir. Buna ek olarak, bu protokol mikroakışkan hücre yakalama teknolojileri sadece etiketli transgenik balık hattı ve erişimi gerektiren, Zebra balığı araştırma topluluğuna geniş çapta uygulanabilir.

Prensip kanıtı olarak, kalp progenitörlerinden edilen tek hücreler izole edilmiş ve bir IFC çip ele geçirilir ve daha sonra kalp farklılaşma markerlerinin nispi bolluk QRT-PCR ile ölçülmüştür. tek hücre düzeyinde gen ekspresyon analizi kalp atalarıdır kendi differe bir arada gösteriyorntiating soyu. Kalp atalarıdır tek hücreli profil elde edilen anlayış, geleneksel toplum tabanlı analizlerde maskelenmiş olabilir omurgalı gelişimi sırasında kalp progenitör hücreleri arasında gen ekspresyonu heterojenlikten, ışık tutabilir.

Protokol

Bu protokol, embriyolar üretme yaşarlar, ergin zebrabalıkları kullanılmasını gerektirir. embriyolar doku toplama hasat edilir. Deney yapmak için uygun etik inceleme kurulları onay almak için esastır.

1. Sahnelenen Embriyolar elde

1. Deneyden bir gün önce, üreme için sağlıklı, yetişkin zebrafish hazırlamak. bir erkek ve bir üretim tankı açık bir bölücünün karşılıklı yanları üzerinde bir dişi yerleştirin.
2. alt uygulama için yeterli embriyo üretimi için gerektiği kadar üreme tankları için 1.1 tekrarlayın. ilgi hücre tipinde floresan proteinleri ifade vahşi tip balık ve transgenik balıklar hem embriyolar elde edin.
   NOT: Adımlar 2-8'de downstream uygulamalar için gerekli embriyo sayısı ilgi bir zaman noktasında ilgi hücrelerin göreceli bolluk bağlıdır. Bu hücre türüne göre değişebilir rağmen, 200 embriyolar 2,000-5,000 sıralı hücreler üretmek zaman cilgi arşın 24 hpf (saat sonra döllenme) de
3. Ertesi sabah, taze bir üreme tankına balık aktararak breading tankındaki suyu değiştirmek ve bölücü çıkarın. üreme teşvik etmek için bir açı tankı yatırın.
4. sahnelenen embriyolar toplayın.
   1. Her 15 dk, taze üreme tankına yetişkinleri aktarılması ve çay süzgecinden geride yumurta geçerek embriyolar toplamak.
      NOT: karşılaştırılabilir yoğunlukları ve sıcaklıklarda muhafaza zaman Zebra balığı embriyolar eş zamanlı olarak gelişir.
   2. (1 L çift distile su içinde 0.21 g / L Anında okyanus tuzları) Yumurta Su ile yumurta durulayın ve bir petri transfer. hava sirkülasyonu ile 28.5 ° C'de nemli inkübatör petri aktarın.
5. İki saat son toplanmasına, sıralama 10 cm petri kutularının içine çok hücreli embriyo döllenmiş ve çanak başına 50 embriyolar yoğunluğunu azaltır. Tek, 15 seçin embriyolaralt uygulama için toplama dakika zaman penceresi. 28.5 ° C embriyolar inkübe edin.
   NOT: Örneğin, 08:30, 08:45, 09:00, 09:15, 09:30, 09:45, 10:00 ve 10:15 AM embriyolar toplamak. döllenmiş embriyo en fazla sayıda 9:00 toplanan pençelerinden ise zaman noktalarındaki karşılaştırıldığında, daha sonra aşağı uygulamalar için sadece bu embriyolar kullanın.

2. Tek Hücre Ayrışma için Kurma

1. önce ilgi (18 hpf) zaman noktasına yaklaşık 30 dakika ince forseps ile el koryon embriyolar kaldırmak.
2. Toplamak ve her durum için aşağıdaki etiket: İki 2 ml mikrosantrifüj tüpler, bir 40 mikron hücre süzgeç, bir 35 mm hücre kültürü çanak ve 35 mikron hücre süzgecinden ile tepesinde iki FACS tüpleri.
3. Buz üzerinde aşağıdaki reaktifler Chill: Yumurta Su 1L çift distile su 0.21 g / L Anında Okyanus tuzları içeren; 55 mM NaCI, 1.8 mM KCI, 1.25 mM NaHCO ₃ ihtiva eden tampon De-yolking; ve FACS Tampon Leibovitz L-15,% 5 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ile takviye edilmiş ortam ihtiva etmektedir.
4. RT Hücre Ayrılma Reaktif 1 numune başına 1 ml getirin. buz üzerinde örnek başına çözülme 1 ml Hücre Ayrılma Reaktif 2. Kullanmadan önce hemen oda sıcaklığına kadar getirin.

3. Tek Hücre Ayrılma

1. Geniş delikli cam pipet kullanılarak, yumurta suyun minimum bir hacmi içinde 2 ml mikro santrifüj tüpüne 100-300 embriyolar aktarılır.
2. 20 dakika boyunca buz içinde tüp 1 ml buz gibi soğuk yumurta su ile su değiştirilmesi ve daldırarak embriyolar öldürülür.
   DİKKAT! (Ikincil ötanazi gibi hücre ayrışma ardından buz üzerinde ürpertici) bu ötenazi yöntemi için uygun kurumsal hayvan bakım gözetim komitesinden onay almak için çok önemlidir. Standart ötanazi tipik embriyolar da canlı hücreleri elde etmek için uygun değildir ki, soğutulmuş sonra ağartılmalarına nispeten 3 gün sonra gübreleme
3. 1 ml buz gibi soğuk Yumurta suyla embriyolar iki kez yıkayın. yıkamak, Yumurta Suyu ve Yumurta Su eklemek için bir P1000 kaldırmak için geniş bir delik cam pipet kullanın.
4. P1000 ucu ile 8-12 kez 1 ml Deyolking Tampon ile embriyo su değiştirilmesi ve öğütülerek sarısı çıkarın veya sarısı çözülür ve kadar embriyoların sadece organları görebilir.
5. 1 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile doku toplanır. yavaşça doku pelet bozmadan süpernatant kaldırmak için bir pipet kullanın. 1'in ml Yumurta Su yeniden askıya.
6. Tekrarlayın üç yıkar toplam adım 3.5, ancak son yıkamada, 1 ml RT Hücre Ayrılma Reaktif 1 yeniden askıya.
7. yatay olarak yerleştirilmiş borular ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hücre ayrışma Reaktif 1 inkübe edin. Her 2-3 dk hafifçe topaklanma önlemek için P1000 pipet ile çiğnemek.
   NOT: ezerek toz haline getirme adımları sırasında hafifçe örnekleri taşıyınız. Bazen tek bir büyük yığın embriyo organları bir arapsaçı gelen tüp içinde oluşacaktır. Bu iradeNazik toz haline getirilerek destekli ek sindirim ile dağıtmak. VORTEKS DO NOT.
8. 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile doku toplanır. 1 ml Hücre Ayrılma Reaktif 2 supernatant ve tekrar süspansiyon çıkarın.
9. Oda sıcaklığında 5-15 dakika boyunca inkübe edin. yatay tüpleri yerleştirin. Her 2-3 dk hafifçe topaklanma önlemek için çiğnemek. Her 5 dk, sindirim ilerlemesini değerlendirmek.
   1. , Sindirim ilerlemesini değerlendirmek hücre kültürü çanak üzerine bir damlacık olarak 18 ul FACS Tampon ve pipet içine 2 ul süpernatant sulandırmak için.
   2. numune üzerinde bir lamel yerleştirin ve 10X ve 20X büyütmede bir doku kültürü mikroskop altında gözlemlemek.
      NOT: Hazırlık tek hücreler, küçük kümeler, büyük kümeler, ve zaman zaman çoğunlukla-sağlam embriyo vücudun bir karışımı olarak görünmelidir.
   3. Görme tek hücreleri ve küçük kümeler olan hazırlık oranını değerlendirmek.
      NOT: Aşırı sindirim canlılığını azaltır; altında sindirim tek hücre verimi azaltacaktır.
10. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücre hazırlama toplayın. Süpernatantı atın ve soğuk FACS Tampon 1 ml yeniden askıya.
11. FACS Tampon ile 40 mikron hücre süzgeç ıslatın. 35 mm hücre kültürü çanak üzerine 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçirin. tampon sıralama 1 ml FACS hücre süzgeci bir kez yıkayın.
12. 2 ml mikrosantrifüj tüp akış yoluyla aktarın. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler toplamak ve 100 ul FACS tampon içinde yeniden askıya.
13. Bir hemasitometre kullanarak hücre verimi güvenin. Dahası seçim FACS makine için önerilen ml veya optimum konsantrasyon başına 5x10 ⁶ hücre örnekleri sulandırmak. hemasitometre hücre verimi sayma yaparken isteğe bağlı, tripan mavisi ile counterstain ölü hücreler FACS sıralama öncesinde hücre hazırlık canlılığı teyit etmek.
    NOT: Çok sıralamak için zaman aşırı miktarda alacak seyreltilmiş Hazırlıklar. çok c vardır Hazırlıklaroncentrated multimerler içine gelme eğilimindedir ve saf nüfus sıralamak için optimal bulunmaktadır.
14. Rezerv her numunenin% 10-20 olarak boyanmamış denetimlerini kullanmak için. ekleyerek diğer örnekler, leke ölü hücreler bir floresan ölü / canlı (L / D) ayrım Her numune içine boya. yıkama ETMEYİN.
    Not: nükleik asitler, L / D boyası olarak kullanılabilir tehlikeye hücre zarları ve lekeleri hücreleri nüfuz herhangi bir flüoresan boya, florasan spektrumu ilgi seçimi ve fluorofor markalama hücrelerinin FACS makine ile uyumlu olması koşuluyla.
    1. bazı hücreler FACS saflaştırma transit ölecek ve sıralı nüfus dışında tutulmalıdır olarak boya ekledikten sonra hazırlık yıkamayın.
15. 20 ul FACS tamponu ile FACS tüp şapkalı 35 mikron hücre süzgeç ıslatın. süzgeç hücreleri ekleyin ve yerçekimi tarafından toplanır. Buz üzerinde muhafaza edin.

4. FACS Zenginleştirme

1. için tek zenginleştirmek için FACS kullanınFloresan markörü eksprese eden canlı hücreler.
   1. yan dağılım genlikli (SSC-A) vs ileri dağılım (FSC-A) genlik bir dağılım arsa üzerinde enkaz hücreleri ayırt etmek için bir kapı olarak ayarlayın, hem doğrusal ölçeklendirme ile.
      Dikkat balığı hücreler tipik olarak bir fare veya insan hücrelerine göre daha küçüktür. Bu hücreler ve döküntüler, arasındaki düşük bir bazal ayırma yansıtılır.
   2. 4.1.1 set kapısından, tek hücre için zenginleştirmek ve ileri saçılım yüksekliği (FSC-H) ve düşük yan dağılım yüksekliği (SSC-H) bir dağılım grafiğini kullanarak multimerlerini, doğrusal ölçekleme hem dışlamak için bir kapı olarak ayarlayın.
      NOT: orantısız yüksek FSC-H ve düşük SSC-H hücreler muhtemel multimerleri ve sıralama dışındadır.
   3. tek renk kontrollerini kullanarak 4.1.2 gate seti, doğrusal ölçekleme ve kanal genliği ile FSA-A'nın bir dağılım grafiği kullanan tek canlı hücreleri dahil bir kapı set günlük ölçeklendirme ile L / D leke tespit etmek için kullanılır. L / D negatif hücreleri içerir.
   4. itibarenkapı, tek renk kontrollerini kullanarak, 4.1.3'de belirlenen günlük ölçekleme ile floresan protein hücre işaretleyici tespit etmek için kullanılan kanalın lineer ölçeklendirme ve genlik ile FSA-A'nın bir dağılım grafiği kullanılarak pozitif floresan ile tek canlı hücreleri dahil bir kapı set . Pozitif hücreler yer alır.
   5. Gerekirse L / D leke ve floresan protein spektrumları arasındaki girişim için hesap, herhangi bir tazminat kontrolleri ayarlayın.
2. Adım 4.1 ayarlanan kapılarının her giren hücrelere ayarlayın sıralama mantığı.
   1. çift ​​etiketli hücreleri kullanarak, hücre sıralama için yolluk doğrulayın.
      NOT: Hücreler yerine enkaz, tek hücreler yerine multimer, L / D negatif ve floresan pozitif hücreler olacaktır sıralama için hücreler.
3. Buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüp içinde soğuk FACS Tampon 5 ul içine ilgi nüfus kriteri 2000-4000 hücreleri. hücre için mümkün olan en düşük basınçlar kullanmak, sıralama sırasında hücreler üzerinde kesme ve zorlanma en aza indirmek içinsıralayıcı.
   NOT: FACS Tampon 5 ul damlacık FACS makinesinden çıkan hücreler için bir yastık görevi görür. şirketinden FACS tamponuna 2000-4000 hücrelerin toplanması öncesinde IFC fiş üzerine yüklemeden santrifüj ihtiyacını ortadan kaldırır. Hücreler pelet birbirine bağlı olmadığını santrifüj multimerlerinin oluşumuna yol açabilir, bu strateji, tavsiye edilir.
4. sonrası sıralama canlılığı analizi değerlendirin.
   1. L / D leke 1000 seyreltme: Transferi 1 ul tampon ve 1 sıralama 100 ul FACS ile taze bir FACS tüp hücreleri sıralanır. Adım 4.1 yolluk stratejisi ile FACS sıralayıcı aracılığıyla hücrelere geçerler. L oranını kullanın / negatiften pozitife D sıralı hücrelerin canlılığı tahmin etmek.

Mikroakiskan Chip üzerine 5. Yük Hücreleri

1. hemasitometre kullanarak, konsantrasyon ve sıralanmış hücrelerinin boyutunu hem de ölçün.
   1. en az 10 ul sıralı hücreleri sulandırmak. 5 u bir kısım seyreltin, 5 ul tripan mavisi ile L hücreleri. hemasitometre üzerine yerleştirin ve lamel uygulayın.
   2. hemasitometre 4 x 4 ızgaraları tüm hücrelerin parlak bir alan görüntüleri toplamak. Canlı hücrelerinin sayısını ve canlı hücre / ml hesaplar. Canlı hücreler tripan mavisi kadar yapmayız.
      Not: Tüm canlı hücre çapını ölçmek için herhangi bir standart Image Analysis yazılımının kullanılması. hücre boyutu, ortalama ve standart sapma hesaplayın ve ilgi hücre boyut aralığı için uygun olan bir IFC plaka seçin. Hücre boyutu aralığı bir IFC plaka hücre boyut aralığı straddles ise ilgi hücreleri tam kapsamlı yakalamak için birden fazla tabak kullanın.
2. üreticinin talimatlarına göre IFC plakaya Yük hücrelerinin (Malzeme).
   1. 1x10 ⁶ hücre / ml hücreleri sulandırmak ve üreticinin talimatlarına göre yüzdürme optimizasyon yapmak.
      NOT: Yüzdürme optimizasyon hücreleri dibine çöker, ne de yükleme wel üstüne şamandıra ne sağlarIFC çip üzerine optimum yükleme l. hücrelere tampon oranı hücre tipine göre değişir, ancak genellikle 6 aralıkları olabilir: 4-7: Hücrelerin 3: tampon.
   2. astar-IFC plakasına hücreleri ekleyin. Yük uyumlu Fluidics makinenin içine plaka ve Mikroakiskan devre boyunca ve yakalama şerit içine hücreleri itmek için bir hücre yükleme komut dosyasını çalıştırın.
3. Hücreler IFC plaka üzerinde yakalama sitelerinde açılmış olduğunu doğrulamaktadır.
   1. Fluidics makineden IFC plakasını sökün. bir tabak adaptörü ile donatılmış bir mikroskop IFC plakasını monte edin.
   2. 10X büyütmede her yakalama site için parlak bir alan ve floresan anlık toplayın.
      NOT: aydınlık yakalama süreleri lamba yoğunluğuna bağlı olarak, 10-50 ms arasında değişebilir. Floresan yakalama süreleri fluorofor parlaklığına bağlı olarak, 250-750 ms arasında değişebilir. fotohasar önlemek için hücrelerin ışığa maruz kalmaması.

6. cDNA Sentezi

1. I'e göre yerinde hücre parçalama gerçekleştirinFC plaka üreticinin talimatlarına.
   1. IFC plaka üzerinde kuyu lizis tamponları ekleyin. üreticinin talimatlarına göre uyumlu fluidik makine ve çalışma hücre parçalama komut üzerine yük plakası.
2. IFC plakası, üreticinin talimatlarına uygun olarak, ters transkripsiyon gerçekleştirin.
   1. IFC plakasına ters transkripsiyon ayraçlar eklenir. Uyumlu Fluidics makine üzerine yük plakası. Ters transkripsiyon komut dosyasını çalıştırın. Örnek döngü koşulları: 5 dakika 85 ° C'de daha sonra da 1 döngü, 10 dakika boyunca 25 ° C 'de 1 döngü, 1 saat süre ile 42 ° C' de 1 döngü.
3. IFC plakası, üreticinin talimatlarına uygun olarak gene özel problar ile ön amplifikasyon gerçekleştirin.
   Not: düşük kopya numaraları ile daha kesin nedeniyle, ara katkı boyalar ile kullanım için optimize florojenik etiketli problar yerine probları kullanımı.
   1. Havuz astar ve son 180 nM her sulandırmak. IFC plakasına toplanmış primerler ekleyin. Uyumlu fluidi üzerine yük plakasıcs makinesi. Run amplifikasyon komut dosyası.
4. Aşağıdaki çevrim koşulları ön amplifikasyon yapın: 1 döngü, 95 ° C'de 10 dakika, daha sonra da 18 döngü, 4 dakika 60 ° C'de, daha sonra 15 saniye boyunca 95 ° C 'de tavlama ve uzatma, denatüre edici ile. Mağaza hasat kadar 4 ° C 'de cDNA önceden büyütülmüş. kullanılıncaya kadar -20 ° C'de üreticinin talimatlarına ve saklamak için uygun mikroakışkan plakadan Hasat cDNA.

Tek Hedef QRT-PCR Tek Hücreleri 7. Select cDNA

1. üreticinin talimatlarına uygun olarak 25 ul dilüsyon reaktif cDNA seyreltilir.
   NOT: Yaklaşık son verim hücre başına ön amplifiye cDNA 28 ul. QRT-PCR bir hedef içermeyen bir kontrol olarak kullanılmak üzere bir seyreltici bir kısım ayırın.
   1. parlak bir alan ve adım 5.3.2 kaydedilen floresan görüntülere değinen her yakalama sitesine puan. El ile saymak ve hücre sayısını kaydedin. Değerlendirmek ve her hücre grip olup olmadığını kayıtFlüoresan.
      NOT: Her birey sitesi içerebilir 0,> 1 hücre birden çok hücre ve / veya tanımlanamayan enkaz ihtiva yakalama siteleri içeren 1 veya> 1 hücre. görüntüler yeterli kalitede ise, bir piksel değeri de floresan sinyal yoğunluğu ölçmek için atanabilir.
2. Mah-PCR analizi için seçin örnekleri.
   1. Pozitif floresan ile tam 1 hücreyi ihtiva adım 7.2 tanımlanan yakalama sitelerinden cDNA örnekleri seçin. Her bir numuneden cDNA havuzunu 1 ul alikotları.
      NOT: Bu ilgi genler seçilen hücrelerin herhangi ifade olup olmadığını belirlemek için kullanılan "Havuz" pozitif kontrol edilmesidir.
   2. Bir negatif kontrol olarak tam olarak 0 hücreleri içeren en az bir yakalama sitesinden cDNA seçin. no-şablon kontrolü gibi adım 7.1.2 den seyreltici kullanın.
3. Mah-PCR testi çalıştırın.
   1. Aşama 6.4.1 ön-yükseltme için kullanılan tek probları kullanın. triplicat tüm örnekleri yükleyine. 1 döngü, 50 ° C 2 dakika, 1 döngü, 10 dakika için 1, 60 ° C'de, sonra 95 ° C 15 saniye tavlama ve uzatma denatüre edici ile 40 döngü 95 ° C: 384 plaka üzerinde 10 ul reaksiyon için döngü koşulları min.

8. Veri Analizi

1. Standart jel elektroforezi ile Mah-PCR ürünleri doğrulayın. Ürünü onaylamak beklenen molekül ağırlığında tek bir bant olduğunu (her sonda için değişir).
   NOT: Bir sonda uygunsuz boyutta birden çok bantları veya tek bir bant üretirse, o zaman özgünlüğü sorgulanabilir ve bu analizden geni dışlar.
2. Herhangi bir anormallik ¹⁴ tüm amplifikasyon eğrileri ve hesabı inceleyin. Her bir numune / gen kombinasyonu ¹⁵ için ortalama BT değerini hesaplayın.
   NOT: Pozitif kontroller CT değerleri tipik 10-30 arasında değişmektedir. Negatif kontroller CT değerleri tipik 35-40 (hiçbir amplifikasyon) arasında değişir. BT değerleri 30-35 derece düşük ifadesi olarak kabul edilirve dikkatli ¹⁴ ile yorumlanmalıdır.
3. Rapor verileri
   1. Numuneler CT = 10-30 düşersen, veriler de bir kontrol numunesine transkript bolluk katlık değişim olarak bildirilebilir.
      Not: ^{(- ΔΔCT)} katlı değişim 2 ^ eşittir ACt ev bakıcısı geni ile ilgili numunenin ortalaması CT çıkarılarak bir ev bakıcısı geni ile ilişkili ve ΔΔCT numunesi ve bir pozitif kontrol ¹⁵ ile ACt farklılıklar olduğunu.

Sonuçlar

Prensip kanıtı olarak, gen ifadesi kalp gelişimi sırasında farklılaşma dinamikleri keşfetmeye değerlendirildi. zebrabalıkları kardiyak ataları Bunların, doğrusal kalp tüpü oluşturmak için sigorta ön yan levha mezoderm yer değiştiren hücrelerin mezodermal nüfusu ortaya çıkar. Füzyon öncesinde, kalp ataları kalp atalarıdır ^16,17 erken belirli belirteç olduğu düşünülmektedir transkripsiyon faktörü Nkx2.5 (NK2 homeobox 5), ifade başl...

Tartışmalar

Burada tarif edilen yöntem, bir kardiyak genlerin bir alt ekspresyonunu değerlendirmek için mikro-akışkan destekli tek hücre yakalama sisteminde kullanım için zebra balığı embriyolardan kalp progenitör hücrelerin bir popülasyonu ettirecek hücre tipi özel bir promoterin kontrolü altında bir floresan protein ifade kullanır hücreler. FACS lazer eksitasyon ve emisyon özellikleri tercih fluorofor (ler) ile uyumlu olduğu sürece, bu yöntem, herhangi bir flüoresan raportör hattı için kullanılabilir....

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11254-20	For removing the chorion from embryos
Microcentrifuge tube 2 ml	GeneMate	C-3261-1
40 um cell strainer	Biobasic	SP104151
35 mm culture dish	Falcon	351008
FACS tubes topped with 35 um cell strainer	Falcon	352235
P1000 and tips	Rainin	17005089
P20 and tips	Rainin	17005091
IFC chip manufacturer's protocol	Fluidigm	100-6117	Version 100-6117 E1 was used in representative experiment
Wide bore pastuer glass pippette	VWR	14673-010	For transferring embryos
Adult wild type zebrafish	N/A		We used AB line
Adult transgenic zebrafish	N/A		We used Tg(nkx2.5:ZsYellow)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents for cell dissociation
Double distilled water	N/A
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
NaCl	FisherScientific	S271-3	make stock in water and use for de-yolking buffer
KCl	Sigma Aldrich	P5405	make stock in water and use for de-yolking buffer
NaHCO3	Sigma Aldrich	S6014	make stock in water and use for de-yolking buffer
Leibovitz's L-15	Gibco	21083-027
FBS	FisherScientific	03-600-511	Heat inactivate; any brand of FBS should be fine
Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE	Life Technologies	12605-010	Store at room temperature.
Cell Dissociation Reagent 2 - FACSmax	Genlantis	T200100	Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use
pronase (optional)	Sigma	P5147
L/D Dye - Sytox Blue	Life Technologies	S34857	Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work
Trypan Blue	Gibco	15250-061
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents for IFC plate use and qRT-PCR
Gene-specific probes			Probes will vary by experiment
TaqMan Probe ef1a	Life Technologies	Dr03432748_m1
TaqMan Probe gata4	Life Technologies	Dr03443262_g1
TaqMan Probe nk2-5	Life Technologies	Dr03074126_m1
TaqMan Probe myl7	Life Technologies	Dr03105700_m1
TaqMan Probe vmhc	Life Technologies	Dr03431136_m1
TaqMan Probe isl1	Life Technologies	Dr03425734_m1
TaqMan Gene Expression Master Mix	Life Technologies	4369016
Reagents listed in IFC manufacturer's protocol
C1 Reagent Kit	Fluidigm	100-5319	Reagents for loading cells onto IFC plate
Ambion Single Cell-to-CTTM	Life Technologies	4458237	Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps
Molecular Biology Quality Water	Corning	46-000CM
C1 IFC for PreAmp (5-10 um)	Fluidigm	100-5757	IFC plate for small cells
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
C1 AutoPrep machine	Fluidigm	100-5477	For IFC plate use
Hemocytometer	Sigma Aldrich	Z359629	For counting cells and assessing cell size
Dissecting microscope			For removing embryos from chorion
Tissue culture microscope			For assessing single cell digestion
FACS machine			For isolating cells of interest