JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Özet

RNA dizi (RNAseq) gen ekspresyonunu, mutasyon, gen füzyonlarının ve kodlayıcı olmayan RNA'lar algılamak ve karakterize etmek için kullanılabilir çok yönlü bir yöntemdir. 100,000,000 dizi okuma ve mRNA ve kodlayıcı olmayan RNA'lar gibi birden fazla RNA ürünlerini içerebilir - Standart RNAseq 30 gerektirir. Biz hedefli RNAseq (yakalama) bir masaüstü sequencer kullanarak seçilen RNA ürünlerde odaklanmış bir çalışma izin nasıl gösterilmektedir. RNAseq yakalama aksi geleneksel RNAseq yöntemleri kullanılarak atlanabilir, Açıklama içermeyen düşük, ya da geçici olarak ifade transkript karakterize edilebilir. Burada hücre hatları, ribozomal RNA tükenmesi, cDNA sentezi, barkodlu kütüphane, bir masaüstü sequencer üzerinde melezleme ve hedeflenen transkript yakalanması ve multipleks sıralama hazırlanması RNA çıkarma açıklar. Biz de kalite kontrol değerlendirme, hizalama, füzyon algılama, gen ifadesi miktarının ve tek MBK tanımlanmasını içeren hesaplama analiz boru hattı, anahatleotide varyantları. Bu deney, gen ekspresyonunu, gen füzyonlarının ve mutasyonları tanımlamak için hedeflenmiş transkript dizilemesi için izin verir.

Giriş

Whole transcriptome or RNA sequencing (RNAseq) is an unbiased sequencing method to assess all RNA products. The goal of targeted RNAseq (Capture) is a focused evaluation of selected transcripts with increased sensitivity, dynamic range, reduced cost or scale, and increased throughput compared to standard RNAseq. Similar to standard RNAseq, targeted enrichment approaches can be used to evaluate gene expression, multiple RNA species such as mRNA, microRNA (miRNA), lncRNA1, other noncoding RNAs2, gene fusions3, and mutations4-6.

Capture involves hybridization of complementary oligonucleotides to enrich cDNA libraries for sequencing. The rationale for RNAseq Capture is similar to microarray approaches where complementary oligonucleotides or probes are hybridized to samples and then measured for relative abundance. For microarray technologies, expression is based on relative signal measured for transcripts binding to these probes. Microarrays are thus limited by range, potential background noise from non-specific binding, and cross-hybridization of probes. Furthermore, arrays have limited dynamic range for low and highly expressed transcripts compared to RNAseq1. Microarrays are widely utilized due to their reduced cost and high throughput capacity compared to RNAseq.

Here, we demonstrate a method for RNAseq Capture that offers a middle ground between RNAseq and microarray approaches for evaluating the transcriptome. RNAseq Capture has intermediate throughput, greater dynamic range and sensitivity, and is scaled for fast turnaround on desktop sequencers. RNAseq Capture also requires reduced computational resources in terms of storage space and data processing.

Protokol

Not: Bu protokol eşzamanlı işleme ve dört numunelerin analizini açıklar. Bu yöntem, hücrelerden izole edilmiş RNA, taze dondurulmuş doku ve formalin ile fikse parafine gömülü doku (FFPE) ile uyumludur. Her numune için bir RNA girişi başlayan 1000 ng (250 önerilir ng) - Bu protokol 50 ile başlar.

1. rRNA tükenmesi ve RNA Usul Parçalanma

  1. rRNA tükenmesi
    1. Oda sıcaklığında, -20 ° C ve çözülme ile ilgili elüte, asal, parça karışımı, rRNA çıkarma karışımı, rRNA bağlayıcı tampon ve yeniden süspansiye etme tamponu çıkarın. 4 ° C ile elüsyon tamponu, rRNA çıkarma boncuk ve RNA / cDNA, belirli para-manyetik boncuklar alınır ve oda sıcaklığına getirin.
    2. PCR tüpü RNA 0.25 ug ekleyin. 10 ul bir toplam son hacmine nükleaz içermeyen ultra saf su ile toplam RNA seyreltilir. Her tüpe rRNA bağlayıcı tampon 5 ul ekleyin yavaşça pipett 5 rRNA kaldırma karışımı ul ekleyine yukarı ve aşağı karıştırın. kapaklı termal döngüleyici içinde yer tüpler RNA denatüre etmek için 5 dakika boyunca 68 ° C'ye kadar, 100 ° C ve program termal döngü önceden ısıtıldı.
    3. RNA bozunmasından sonra, termal döngü tüpleri çıkarın ve 1 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Vortex rRNA kaldırma boncuk tüp şiddetle boncuk tekrar süspansiyon. Yeni tüplere rRNA kaldırma boncuk 35 ul ekleyin ve rRNA kaldırma boncuklar içeren tüplere RNA denatürasyon reaksiyonu (20 ul) aktarın.
    4. hızlı bir şekilde 45 ul ve pipet pipet ayarlayın ve 20x aşağı karıştırın. 1 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra, 1 dakika, oda sıcaklığında manyetik stand tüpleri. Yeni etiketli PCR tüplerine süpernatant aktarın ve 1 dakika boyunca, oda sıcaklığında manyetik stand Yine bu tüpleri. Bu, boncuklar aktarılmasını sağlar. Yeni etiketli PCR tüplerine süpernatant aktarın.
    5. Vortex RNA / cDNA özel paramanyetik boncuk ve her tüpe boncuk 99 ul ekleyin. Yavaşça pipet tümhacim yukarı ve aşağı 10x karıştırın. bozulmuş RNA ile başlanarak, her bir tüpe iyi karıştırılmış RNA / cDNA, belirli para-manyetik boncuk 193 ul ekle. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra 5 dakika boyunca, oda sıcaklığında, manyetik ayağa tüpleri. Çıkarın ve süpernatantlar atın.
    6. taze hazırlanmış% 70 etanol (EtOH) 200 ul ekle. Manyetik stand tüpleri tutmak ve boncuk rahatsız değil dikkat edin. sonra çıkarın ve supernatant atmak 30 saniye boyunca oda sıcaklığında inkübe. 10 dk kurumasını - 5 için tüpler oda sıcaklığında bekletin.
    7. Santrifüj 5 saniye boyunca 600 x g'de oda sıcaklığında elüsyon tamponu çözülmüş. Her tüpe elüsyon tamponu 11 ul ekleyin ve hafifçe yukarı pipet ve 10x aşağı karıştırın. 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, manyetik ayağa tüpler yerleştirin. Yeni etiketli PCR tüplerine süpernatant 8.5 ul aktarın.
  2. RRNA Tükenmiş RNA Parçalanma
    1. 8.5 ul el ekleute 8.5 ul ana ve her tüpe 8.5 ul fragmanı karışımı. Yavaşça yukarı pipet ve 10x aşağı karıştırın. 8 dakika, daha sonra 4 ° C'de tutun, 100 ° C, 94 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış kapak: program aşağıdaki termal döngüleyici içinde yer borular.
      Not: Bu adım 155 bp büyüklüğünde bir ortalama insert büyüklüğü üretmek üzere tasarlanmıştır. RNA örnek ortalama fragman büyüklüğü daha düşük 200 bp ise, bu adımı atlayın ve First Strand cDNA Sentezi geçin.

2. cDNA Sentezi

  1. İlk cDNA sentez
    1. -20 ° C ile birinci iplik sentez karışımı alınır ve oda sıcaklığında erimeye.
    2. Ön programı aşağıdaki ayarlarla termal döngü cihazı: Ön ısıtma kapağı seçeneği ve 15 dakika, 15 dakika boyunca 100 ° C, 10 dakika boyunca, sonra 25 ° C, 42 ° C, 70 ° C olarak ayarlanır ve 4 ° C'de tutun . Bu programı kaydet "Sentez 1. Strand."
    3. 600 & # santrifüj çözülmüş ilk iplik sentez karışımı tüp215; 5 saniye boyunca örn. 1 ul birinci iplik sentez karışımı 9 ul ters transkriptaz karıştırın.
    4. İlk kol sentezi 8 ul ekleyin ve her tüp transkriptaz karışımı ters yavaşça yukarı pipet ve aşağı karıştırmak 6x. 6.0 xg'de sabit hız mini masaüstü santrifüj kullanılarak 4 saniye boyunca santrifüj tüpleri altına sıvı getirmek. Termal döngü tüpleri yerleştirin ve Sentez 1. Strand seçin. termal döngü cihazı 4 ° C ulaştığında, tüpleri kaldırmak ve ikinci kol cDNA'yı sentezlemek için hemen devam.
  2. İkinci kol cDNA sentez
    1. Kapağın 16 ° C'ye kadar ön ısıtma termal döngü, 30 ° C'ye kadar ön-ısıtılır. Çözülme ikinci sarmal ana karışımı ve buz üzerinde yeniden süspansiyon tamponu. Öncesinde, 4 ° C ila paramanyetik boncuk şişe kaldırmak ve oda sıcaklığına getirmek için en az 30 dakika bekletin.
    2. Her bir PCR tüpü yeniden süspansiyon tamponu 5 ul ekle. 600 Santrifüj ikinci iplik master miks5 saniye g × ve her bir PCR tüpü 20 ul ekle. 1 saat boyunca 16 ° C'de önceden ısıtılmış termal döngüleyici içinde yer borular. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, termal döngü kaldırmak ve tüpler oda sıcaklığına gelmesi için izin verir.
    3. Vortex paramanyetik boncuklar onlar iyi dağılmış kadar. Her tüpe iyi karıştırılmış paramanyetik taneler 90 ul ekle. Yavaşça tüm hacim yukarı pipet ve aşağı 10x karıştırın. 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, manyetik ayağa Tüpler.
    4. Çıkarın ve süpernatant 135 ul atmak ardından EtOH yıkama gerçekleştirmek için manyetik stand tüpler bırakın. boncuk bozmadan 200 ul taze her tüpe,% 80 EtOH hazırlanabilir ekleme, daha sonra, 30 saniye boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Çıkarın ve her bir alınan süpernatan her atın. İki% 80 EtOH yıkar toplam tekrarlayın.
    5. 10 dk manyetik stand üzerinde kurumasına - 5 için tüpler oda sıcaklığında bekletin. çözülmüş oda sıcaklık santrifüj5 saniye boyunca 600 × g e tabanda tampon. Manyetik stand PCR tüpleri çıkarın. Her PCR tüp 17.5 ul tabanda tampon ekleyin ve hafifçe iyice karıştırın için yukarı ve aşağı 10x tüm birimi pipetle. Oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edin.
    6. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, manyetik stand Tüpler daha sonra, 0.2 ml PCR şerit tüplerine 15 ul süpernatant (çift sarmal cDNA'ya) aktarın.
      NOT: Bu cDNA, 7 güne kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir güvenli durdurma noktasıdır.

3. kütüphane hazırlanması

  1. Adenilat 3 'Sona Erdi
    1. Oda sıcaklığında, -20 ° C ve çözülme A-tailing karışımı çıkarın. Ön programı aşağıdaki ayarlarla termal döngü cihazı: Ön ısıtma kapağı seçeneğini ve 100 ° C olarak ayarlanır, daha sonra 5 dakika boyunca, 30 dakika boyunca 37 ° C, 70 ° C 'ye ayarlanmış ve 4 ° C'de tutun. Bu programı kaydet "ATAIL70."
    2. tabanda 2,5 ul ekleyinHer tüpe tampon. Sonra çözülmüş A-atık karışımı 12.5 ul ekleyin. Yavaşça tüm hacim yukarı pipet ve aşağı 10x iyice karıştırın. termal döngü tüpleri yerleştirin ve ATAIL70 seçin. termal döngü cihazı sıcaklığı 4 ° C'de olduğunda, termal döngü PCR tüpleri kaldırmak ve adaptörleri Arter hemen geçin.
  2. Arter Adaptörler
    1. Uygun RNA adaptörü tüpleri çıkarın -20 ° C ile ligasyon tampon ve yeniden süspansiyon haline getirme tamponu durdurmak ve oda sıcaklığında erimeye. protokolde böyle bir talimat kadar -20 ° C den Bağlama karışımı tüpünü çıkarmayın. 4 ° C ila paramanyetik boncuk şişe çıkarın ve en az 30 dakika oda sıcaklığına getirmek için bekletin.
    2. 30 ° C termal döngü önceden ısıtınız ve ön ısıtma kapak seçeneği ve 100 ° C'ye ayarlanmış seçin. Santrifüj 5 saniye boyunca 600 x g'de çözülmüş RNA adaptör tüpleri. Kullanımdan hemen önce, -20 ° C den Bağlama karışımı tüp kaldırmakdepolama.
    3. Her bir numune, bir tüpe yeniden süspansiyon tamponu 2.5 ul ekle. Ligasyon karışımı 2.5 ul ekle. Bağlama karışımı tüp kullanımdan hemen sonra -20 ° C depolama dönün. Her örnek tüpüne çözülmüş RNA adaptör endeksi 2.5 ul ekleyin. Yavaşça tüm hacim yukarı pipet ve aşağı 10x iyice karıştırın.
    4. 6.0 x g sabit hız mini masaüstü santrifüj kullanılarak 4 saniye boyunca santrifüj tüplerine. Önceden ısıtılmış termal döngüleyici içinde yer borular. Kapağı kapatın ve 10 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
    5. termal döngü tüpleri çıkarın ve ligasyon inaktive etmek her tüpe durdurma ligasyon tamponu 5 ul ekle. Yavaşça tüm hacim yukarı pipet ve aşağı 10x iyice karıştırın.
    6. Karışık paramanyetik boncuk 42 ul kullanarak ve 79.5 ul süpernatant atarak, 2.2.4 - 2.2.3 de açıklandığı gibi yıkayın tekrarlayın. 10 dakika - manyetik stand tüpler, 5 oda sıcaklığında numuneler hava kurumaya bırakın.
    7. PCR şerit tüpleri çıkarınManyetik standı ve her tüpe 52.5 ul tabanda tampon ekleyin. Yavaşça tüm hacim yukarı pipet ve aşağı 10x iyice karıştırın. 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 5 dakika boyunca ya da sıvı açıktır kadar oda sıcaklığında manyetik stand tüpler yerleştirin. Aktarım, yeni 0,2 mi PCR şerit tüplerine Her tüpten 50 ul. boncuk rahatsız etmemek için özen gösterin.
    8. Karışık paramanyetik boncuk 50 ul kullanılarak ve 95 ul süpernatant atarak, 2.2.4 - 2.2.3 de açıklandığı gibi yıkayın tekrarlayın. 10 dakika - manyetik stand tüpler, 5 için oda sıcaklığında numuneler hava kurumaya bırakın.
    9. manyetik stand PCR şerit tüpleri çıkarın ve her tüpe 22.5 ul tabanda tampon ekleyin. Yavaşça tüm hacim yukarı pipet ve aşağı 10x iyice karıştırın.
    10. 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 5 dakika boyunca ya da sıvı açıktır kadar oda sıcaklığında manyetik stand tüpler yerleştirin. Bir her tüpten ul transfer 20Yeni 0.2 ml PCR şerit tüp. boncuk rahatsız etmemek için özen gösterin. Bu güvenli bir durdurma noktasıdır ve cDNA 7 güne kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.

4. Kütüphane Büyütme

  1. DNA fragmanları ettirecek
    1. Oda sıcaklığında -20 ° C depolama ve çözülme PCR ana karışımı, PCR primer kokteyl ve tabanda tamponu çıkarın. 4 ° C depolama paramanyetik boncuk şişe çıkarın ve en az 30 dakika oda sıcaklığına getirmek için bekletin.
    2. Ön programı aşağıdaki ayarlarla termal döngü cihazı: Ön ısıtma kapağı seçeneğini ve 100 ° C olarak ayarlanır, daha sonra 10 saniye, tavlama için 98 ° C 'de, 30 saniye boyunca 98 ° C' de denatürasyon, 15 çevrim ilk denatürasyon ayarlamak 30 saniye, 5 dakika boyunca 72 ° C'de bir son uzatma döngüsü ve 72 ° C 'de 30 saniye, ve uzatma, 60 ° C' de 4 ° C 'de sabit. Bu programı Kaydet "PCR."
    3. çözülmüş PCR Master santrifüj5 saniye boyunca 600 x g'de tüpler karıştırın ve PCR primerleri. Her bir numune, bir tüpe çözülmüş PCR primerleri 5 ul ekle. Her bir numune, bir tüpe çözülmüş PCR Master Mix 25 ul ekle. Yavaşça tüm hacim yukarı pipet ve aşağı 10x iyice karıştırın.
    4. Önceden programlanmış termal döngü şapkalı PCR şerit tüpleri yerleştirin. Kapağı kapatın ve PCR programı çalıştırın. PCR tamamlandığında, termal döngü tüpleri çıkarın ve buz üzerinde tutmak.
    5. Karışık paramanyetik boncuk 50 ul kullanılarak ve 95 ul süpernatant atarak, 2.2.4 - 2.2.3 de açıklandığı gibi yıkayın tekrarlayın. 10 dakika - manyetik stand tüpler, 5 oda sıcaklığında numuneler hava kurumaya bırakın.
    6. manyetik stand tüpleri çıkarın ve her bir örnek tüpüne 32.5 ul tabanda tampon ekleyin. Yavaşça tüm hacim yukarı pipet ve aşağı 10x iyice karıştırın. 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 5 dakika boyunca ya da sıvı açıktır kadar oda sıcaklığında, manyetik ayağa PCR tüpleri yerleştirin. Daha sonra 30 ul su aktarmakTaze 0.2 ml PCR tüplerine pernatant.
    7. Bir flüorometre 7'yi kullanarak cDNA miktarının gerçekleştirin ve kapiler elektroforez sistemi 8 kullanarak cDNA kalitesini belirler.
      Not: Bu güvenli durdurma noktasıdır ve cDNA 7 güne kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir. Not: Bu kütüphane RNAseq kütüphanesi olarak kabul edilir.
      Daha sonraki adımlar Yakalama kütüphanesine yol açar.

5. Melezleme, Yakalama ve Sıralama

  1. çoklanmış Melezleme
    1. -20 ° C ile özel hidratlı probları, yatak-1 DNA, genel bloke oligos ve adaptöre özgü blokaj oligos kaldırma ve buz üzerinde eritin.
    2. Düşük bağlaması 1.5 ml tüp, 500 ng DNA birleştirmek (numune başına 125 ng zaman çoğullama 4 örnek), 5 ul Cot-1 DNA (1 mcg / ml), 1ul evrensel engelleme oligos, 0.5 ul p7 (6 nükleotid) özel adaptör oligos engelleme (bu tutar multipleks conditi bağlı olarak ayarlanabilir gerekebilirons) ve 0.5 ul P7 (8 nükleotid) adaptöre özgü blokaj oligos (bu miktar) çoklu koşullara bağlı olarak ayarlanması gerekebilir.
    3. Dönme ters yöne bakacak kapak açıkken bir vakum konsantratör örnek tüp yerleştirin. 20 dakika boyunca 45 ° C'de veya sıvı buharlaşana kadar kuru içeriği.
    4. 8.5 ul 2x hibritleme tamponu, 3.4 ul hibridizasyon bileşen A ve 1.1 ul nükleaz içermeyen su ile kurutuldu içeriği yeniden süspanse edin. tabanda ve vorteks her 2.5 dakika için 10 dakika bekleyin. 0.2 mi PCR tüpü yeniden süspansiyon haline malzemesini transferi ve bir termal döngü, 10 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edin.
    5. termal döngü hibridizasyon örnek tüp çıkarın ve 1.5 pmol / ul konsantrasyonda yeniden süspansiyon haline getirildi, özel prob 2 ul ekle. Seçenek olarak ise, 0.75 pmol / ul konsantrasyonda yeniden süspansiyon haline getirildi, özel prob 4 ul ekle. 65 ° C sıcaklıkta - (24 saat 16), gece boyunca hibridizasyon reaksiyonu inkübe edin.
      NOT: ProbeÇeşitli Bayiler satın ler kullanılabilir ve üreticinin talimatlarına uyulmalıdır. hibridizasyon adımın süresi de değişebilir.
  2. Boncuk Hazırlama ve Yakalama
    1. 4 ° C ile streptavidin ile eşleştirilen paramanyetik tanelerin şişe çıkarın ve 30 dakika için oda sıcaklığında dengeye. 1x çalışma çözümleri oluşturmak için 10x Yıkama Tamponlar (I, II, III ve sıkı) ve 2.5x Boncuk Yıkama Tamponu seyreltiniz.
    2. Kısım I yeni bir 1.5 ml tüp içine 1x yıkama tamponu 140 ul. En az 2 saat süreyle bir ısı bloğu ısı, tüm 1x katı tampon miktarı ve 65 ° C'de 1x yıkama tamponu I kısım.
    3. Alikotu 1.5 ml tüp içine yakalama başına streptavidin ile eşleştirilen paramanyetik taneler 100 ul. mıknatıs üzerine yerleştirin ve supernatant atın. 10 saniye boyunca 200 ul boncuk yıkama 100 ul boncuk başına tampon ve vorteks ekleyin. 5 dakika ya da süpernatant netleşene kadar - 2 için mıknatıs üzerine yerleştirin. süpernatant temizlendikten sonra, atın ve yenidenİki yıkama toplam bir kez daha turba.
    4. Boncuk yıkama tamponu çıkarılmasından sonra, ilk başlangıç ​​hacmi olarak eşit hacimde kordon yıkama tamponu ilave (örneğin, tek bir yakalama 100 ul). Süspanse ve 0.2 ml PCR tüp transfer. 5 dakika ya da süpernatant netleşene kadar - 2 manyetik rafa tüp yerleştirin. Süpernatantı atın.
    5. 65 ° C 'de termal döngüleyici içinde hibridizasyon numunesi ve boncuk hem ile, boncuk tüp ve pipet hibridizasyon karışımı aktarın aşağı 10x karıştırın. 45 dakika, vorteks için 65 ° C'de inkübe ve sabit bir hızda (6.0 xg) masa üstü Mini santrifüj kullanılarak 4 saniye örnek aşağı doğru döndürün.
  3. Boncuk Yıkama
    1. termal döngü yakalama tüpünü çıkarın ve ben karıştırmak için 10 saniye boyunca tüp ve vorteks 100 ul önceden ısıtılmış 1x Yıkama Tamponu ekleyin. taze düşük bağlaması 1.5 ml tüp karışımı aktarın. Bir manyetik ayırma rafa tüp yerleştirin ve 2 izin - ayrılması için ya da süpernatant netleşene kadar 5 dk. Discard yüzer.
    2. 200 ul ısıtılmış 1x sıkı yıkama tamponu ekleyin ve karıştırın aşağı 10 kez yukarı pipet ve. 5 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta inkübe edilir. Manyetik ayırma rafa tüp yerleştirin ve 2 izin - ayrılması için ya da süpernatant netleşene kadar 3 dk. Süpernatantı atın. İki yıkama toplam kez daha sıkı yıkama tekrarlayın.
    3. 200 ul oda sıcaklığında 1 x I ve vorteks 2 dakika karıştırmak için yıkama tamponu ilave edin. Manyetik ayırma rafa tüp yerleştirin ve 2 izin - süpernatant ayrılması için kadar veya 5 dk açıktır. Süpernatantı atın.
    4. 200 ul oda sıcaklığında 1 x karıştırmak için 1 dakika için tampon II ve vorteks yıkama ekleyin. Manyetik ayırma rafa tüp yerleştirin ve 2 izin - süpernatant ayrılması için kadar veya 5 dk açıktır. Süpernatantı atın.
    5. Ekle 200 ul oda sıcaklığında 1 x karıştırmak için 30 saniye için tampon III ve vorteks yıkayın. ayrılması için ya da süpernatant kadar 5 dakika - 2 izin manyetik ayırma rafa tüp yeritemiz. Süpernatantı atın.
    6. Manyetik ayırma raf tüpü çıkarın ve boncuklar tekrar süspansiyon 20 ul nükleaz içermeyen su ekleyin. yukarı pipetleme ve 10 kez aşağı iyice karıştırın.
  4. Mesaj Yakalama PCR Amplifikasyon
    1. 4 ° C paramanyetik taneler çıkarın ve 30 dakika için oda sıcaklığında dengeye.
    2. Oda sıcaklığında, -20 ° C ve çözülme sıcak PCR Hazır (2x) ve PCR primer karışımı çıkarın ve daha sonra buz üzerine yerleştirin. (Bu miktarlar 1 melezleme kütüphanesinde artı% 10 aşan içindir) PCR Primer 1 2.75 ul ve PCR primer 2 2.75 ul 2x sıcak başlangıç ​​PCR Hazır Mix 27.5 ul birleştirerek kütüphane amplifikasyon Master Mix hazırlayın.
    3. Ayar 20 boncuk ul artı 50 ul toplam hacim için kütüphane amplifikasyon ana karışımı 30 ul çekilen DNA ekleyerek PCR tüpü içinde reaksiyonu. Cap tüp düzgün ve vorteks karıştırın. Sabit hız mini sekmesini kullanarak 4 saniye boyunca santrifüj tüplerine6.0 x g le-üstü santrifüj.
      1. Aşağıdaki PCR programı kurun: - 65 ° C'de 15 saniye, tavlama için 98 ° C 'de denatürasyon için 12 döngü ön ısıtma kapağı seçeneğini ve 100 ° C olarak ayarlanır, daha sonra 45 saniye, 10, 98 ° C'de başlangıç ​​denatürasyon ayarlamak 60 saniye için 72 ° C 'de 30 saniye ve uzatma, bir son uzatma 60 saniye boyunca 72 ° C'de döngü ve 4 ° C de sabit ° C için.
    4. PCR numuneyi çıkarın ve 75 ul paramanyetik boncuk ekleyin. İyice karıştırın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
    5. 2 oda sıcaklığında mıknatıs tüpler yerleştirin - 3 dakika sonra süpernatant kaldırmak. 30 saniye daha sonra süpernatant çıkarılması için inkübe, 200 ul% 80 etanol eklenerek mıknatıs boncuklar yıkayın. İki% 80 yıkar toplam tekrarlayın.
    6. 10 dakika boncuklar kuruması için 5 - oda sıcaklığında inkübe edin. bitmedi kuru çatlama yapmak. Süspanse boncuklar Tris-EDTA pH 8.0 (1X TE çözeltisi) 22 ul ve elüsyon için 3 dakika bekleyin. 5 dk th - 3 mıknatıs üzerinde örnek yerleştirintransferi herhangi bir boncuk sağlayan yeni bir düşük bağlama 1.5 ml tüp yıkanan ürün 20 ul, en fazla gerçekleştirilmektedir.
    7. Flüorometre 7 kullanılarak çekilen cDNA miktarının gerçekleştirin ve kapiler elektroforez sistemi 8 kullanılarak çekilen cDNA kalitesini belirler.
  5. Masaüstü Sequencer Yükleme İşlemi 9
    1. Buz üzerinde,% 0.1 Tween 20 çözülme 10 N NaOH ve hibridizasyon tamponu 10 mM Tris-CI pH 8.5 kullanılarak 4 nM'lik nihai bir konsantrasyona kadar ele cDNA kütüphanesi ile seyreltilir. RT suda masaüstü sequencer v2 reaktif kiti kutu 1 çözülme kullanımdan önce yaklaşık 30 dakika. MAX DOLUM HATTI 10 üzerinde doldurmayın. Bu bir sıralama platform belirli bir işlemdir ve üreticinin talimatlarına göre değişebilir unutmayın.
    2. mikrosantrifüj tüpüne (her zaman taze hazırlandı) 980 ul nükleaz içermeyen su ile 20 ul 10 N NaOH birleştirerek 0.2 N NaOH 1ml hazırlayın. 4 nM tarafından phix kitaplığı (kütüphane kontrol) seyreltin% 0.1 Tween 20, 3 ul 10 mM Tris-CI, pH 8.5, 10 nM kütüphanesi kontrol 2 ul birleştirilmesi.
    3. karıştırmak için kısa bir süre için 5 0.2 N NaOH ul ve vorteks ile 4nM kütüphanesinin 5 ul birleştirilerek nihai kütüphanesini ve kütüphane kontrol denatüre. 6.0 x g sabit hız mini masa üstü santrifüj kullanılarak 4 saniye boyunca santrifüj tüplerine. 5 dakika kitaplıkları denatüre etmek için, oda sıcaklığında inkübe edilir.
    4. Denatüre kütüphaneler 10 ul ihtiva eden tüplere önceden soğutulmuş hibridizasyon tamponu 990 ul ekle. Bu 20 pM kütüphane ile sonuçlanır. Mark tarih ile denatüre 20 pM kütüphane ve -20 ° C'de 3 haftaya kadar saklanabilir.
    5. Bir 12:05 kütüphane kontrol sonuçlanması önceden soğutulmuş hibridizasyon tamponu ve seyreltilmiş kütüphane kontrolü 225 ul 20 pM kütüphane kontrol 375 ul karıştırın. çözüm karıştırmak için birkaç kez ters çevirin.
    6. 12:05 denatüre kütüphane kontrol ve karıştırmak için girdap 6 ul denatüre nihai kütüphane 594 ul birleştirin. Kombine samp ayarlale kütüphane ve bir kenara buz üzerinde kütüphane kontrol numuneleri masaüstü sequencer reaktif kartuşu içine yüklemek için hazır olana kadar.

6. Veri Analizi

  1. Sıra Kalite Değerlendirmesi
    1. Dizi kalite değerlendirme 11 kullanılarak ham dizi verilerine (fastq dosyaları) kalitesini hesaplayın.
      Not: Bu adım, daha aşağıda analizine tabi önce verilerin değerlendirilmesi için yardımcı olur. Yazılım dahili parametreleri ile çalışır ve her fastq dosyası için metrik bir dizi üretir.
  2. hiza
    1. Hizala dizisi GTF dosyası olarak bilinen transkript sağlarken referans İnsan genom hg19 ve transcriptome Tophat2 12 kullanarak (fastq dosyaları) (sürüm 2.0.10) okur. çıkış BAM dosyası olarak adlandırılan bir ikili hizalama biçiminin biçimindedir.
    2. Sıralama ve Samtools 13 (sürüm 0.1.19 kullanarak endeksleme dahil post işleme adımları uygulayın) BAM dosyası. , SAM yeniden sıralama, işaretleme yinelenen gerçekleştirmek boyut hesaplama ve Picard araçları 14 (sürüm 1.84) kullanarak ekleme veya değiştirme okuma grupları yerleştirin.
  3. RNAseq Kalite Değerlendirmesi
    1. RNAseq kalite değerlendirme kullanarak RNAseq veriler için kalite kontrol metrik bir dizi hesaplayınız. Bu yazılıma giriş Tophat2 uyum bir BAM dosya 15'dir. Çıkış diğerleri arasında, vb yüzdesi ve rRNA yüzdesi, okumak haritalanmıştır toplam okuma sayısı, çiftleri, listeleyen bir HTML dosyasıdır.
  4. varyant Arama
    1. Hizalama YILDIZ (sürüm 2.4.0) 16 kullanın ve daha sonra tek nükleotid çağrı varyantları bayrak GATK en (Sürüm 3,3-0) HaplotypeCaller 17 .Follow GATK BAM post-processing adımları ve filtreleme kriterlerini kullanarak ve çıkışı yanlış pozitif kaldırın.
  5. Gen ifadesi
    1. gen ekspresyon USI hesaplayınSmokin paketi 18 den ng Kol Düğmeleri yazılım (sürüm 2.1.1).
      NOT: Giriş Tophat2 hizalama aracı bir BAM dosyasıdır. çıkış sentezleme (okur eşlenen milyon başına kilobaz başına fragmanları) FPKM olarak hesaplanır izoformu geni ve transkript seviyesinde, üretilir.
  6. Füzyon Arama
    1. ChimeraScan 19 (sürüm 0.4.5), Tophat Fusion 20 özel ve Trup 21 kullanılarak her numuneden füzyonları arayın. Oncofuse 22 (sürüm 1.0.9b2) kullanarak alanlar için füzyonları açıklama.

Sonuçlar

RNAseq Yakalama şematik bir vurgulama temel adım, Şekil 1 'de gösterilmektedir. Bilinen mutasyonlar ile dört kanseri hücre RNAseq yakalama tekniği etkinliğini göstermek için kullanılmıştır (K562 ABL1 füzyon RET füzyon LC2 ile EOL1 PDGFRalpha füzyon ve oranda RT- ile 4 FGFR3 füzyon). Dört numune bir araya toplanmış ve 100 bp fastq dosyaları oluşturan bir masaüstü sıralayıcı, okur 2x ile sekanslandı. İns...

Tartışmalar

RNAseq Yakalama RNAseq ve mikroarray arasında bir ara stratejisi transcriptome bir bölümüne değerlendirmek için yaklaşımlarının. Yakalama avantajları genomik değişikliklerin bir masaüstü sequencer, yüksek verimlilik ve algılama maliyeti, hızlı gerçekleştirme süresi azaltılmış sayılabilir. Yöntem olup, kodlayıcı olmayan RNA'lar 23 karakterize tek bir nükleotidi tespit etmek için adapte edilebilir RNA bağlama incelemek ve genin füzyon ya da yapısal yeniden 24 tan...

Açıklamalar

S.R. receives funding from Novartis and Ariad Pharmaceuticals for conduct of clinical trials. S.R. immediate family members own stock in Johnson and Johnson.

Teşekkürler

We give special thanks to Ezra Lyon, Eliot Zhu, Michele Wing, Esko Kautto and Eric Samorodnitsky for technical support. We would also like to thank Jenny Badillo for her administrative support for our team. We acknowledge the Ohio Supercomputer Center (OSC) for providing disk space, processing capacity, and support to run our analyses. We thank the Comprehensive Cancer Center (CCC) at The Ohio State University Wexner Medical Center for their administrative support of this work. S.R. and Team are supported by the American Cancer Society (MRSG-12-194-01-TBG), a Prostate Cancer Foundation Young Investigator Award, NHGRI (UM1HG006508-01A1), Fore Cancer Research Foundation, American Lung Association, and Pelotonia.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Thermomixer REppendorf21516-166
Centrifuge 5417REppendorf5417R
miRNeasy Mini KitQiagen217004
Molecular Biology Grade EthanolSigma AldrichE7023-6X500ML
Thermoblock 24 x 1.5 mlEppendorf21516-166
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles)IlluminaMS-102-2002
MiSeq Desktop SequencerIllumina
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetAIlluminaRS-122-2301
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p5IDT127040822
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt)IDT127040823
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt)IDT127040824
Agencourt® AMPure® XP - PCR Purification beads Beckman-CoulterA63880
Dynabeads® M-270 StreptavidinLife Technologies65305
COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mgRoche Applied Science05480647001
Qubit® Assay Tubes Life TechnologiesQ32856
Qubit® dsDNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32851
SeqCap® EZ Hybridization and Wash Kits  (24 or 96 reactions)Roche NimbleGen 05634261001 or 05634253001 
Qubit® 2.0 Fluorometer Life TechnologiesQ32866
10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution)IDT
Tween20 BioXtraSigmaP7949-500ML
Nuclease Free WaterLife TechnologiesAM9937
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Well Fast Rection ModuleBiorad185-1196
SeqCap EZ Hybridization and Wash KitsRoche Applied Science05634253001
SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μlLife Technologies18064-014
D1000 ScreenTapeAgilent Technol. Inc.5067-5582
Agencourt RNAClean XP - 40 mlBeckman Coulter IncA63987
RNA ScreenTapeAgilent Technol. Inc.5067-5576
RNA ScreenTape LadderAgilent Technol. Inc.5067-5578
RNA ScreenTape Sample BufferAgilent Technol. Inc.5067-5577
Sodium HydroxideSigma72068-100ML
DynaBeads MyOne Streptavidin T1Life Technologies65602
DYNAMAG -96 SIDE EACHLife Technologies12331D
ChloroformSigmaC2432-1L
KAPA HotStart ReadyMixKAPA BiosystemsKK2602
NanoDrop 2000 SpectrophotometerThermo Scientific
My Block Mini Dry BathBenchmarkBSH200
D1000 ReagentsAgilent Technol. Inc.5067- 5583
Vacufuge PlusEppendorf022829861 

Referanslar

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Mercer, T. R., et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014).
  3. Maher, C. A., et al. Chimeric transcript discovery by paired-end transcriptome sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12353-12358 (2009).
  4. Piskol, R., Ramaswami, G., Li, J. B. Reliable identification of genomic variants from RNA-seq data. Am J Hum Genet. 93, 641-651 (2013).
  5. Quinn, E. M., et al. Development of strategies for SNP detection in RNA-seq data: application to lymphoblastoid cell lines and evaluation using 1000 Genomes data. PLoS One. 8, e58815 (2013).
  6. Tang, X., et al. The eSNV-detect: a computational system to identify expressed single nucleotide variants from transcriptome sequencing data. Nucleic Acids Res. 42, e172 (2014).
  7. . Preparing Libraries for Sequencing on the MiSeq® Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf (2013)
  8. . MiSeq® Reagent Kit v2 Reagen Preparation Guide Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html (2012)
  9. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14, R36 (2013).
  10. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  11. DeLuca, D. S., et al. RNA-SeQC: RNA-seq metrics for quality control and process optimization. Bioinformatics. 28, 1530-1532 (2012).
  12. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
  13. Van der Auwera, G. A., et al. From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline. Curr Protoc Bioinformatics. 11, 11.10.1-11.10.33 (2013).
  14. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
  15. Iyer, M. K., Chinnaiyan, A. M., Maher, C. A. ChimeraScan: a tool for identifying chimeric transcription in sequencing data. Bioinformatics. 27, 2903-2904 (2011).
  16. Kim, D., Salzberg, S. L. TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts. Genome Biol. 12, R72 (2011).
  17. Fernandez-Cuesta, L., et al. Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data. Genome Biol. 16, 7 (2015).
  18. Shugay, M., Ortiz de Mendibil, ., Vizmanos, I., L, J., Novo, F. J. Oncofuse: a computational framework for the prediction of the oncogenic potential of gene fusions. Bioinformatics. 29, 2539-2546 (2013).
  19. Clark, M. B., et al. Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing. Nat Methods. 12, 339-342 (2015).
  20. Cieslik, M., et al. The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing. Genome Res. , (2015).
  21. Cabanski, C. R., et al. cDNA hybrid capture improves transcriptome analysis on low-input and archived samples. J Mol Diagn. 16, 440-451 (2014).
  22. Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq. Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).
  23. Zhao, W., et al. Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling. BMC Genomics. 15, 419 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Molek ler BiyolojiSay 114RNA dizilememelezlemeyakalamagen f zyonlarifadehedeflenen RNAseq

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır