Yüksek verimlilik sıralaması kullanılması Tüm-Protein Doygunluk Mutagenez Kütüphaneleri Fonksiyonel Değerlendirme Protokolü

Özet

Biz yüksek verimli sıralama kullanan proteinlerin kapsamlı tek site doyma mutagenezi kütüphanelerinin fonksiyonel değerlendirme için bir protokol mevcut. Daha da önemlisi, bu yaklaşım kütüphane inşaatı ve sıralama multipleks dik primer çiftleri kullanır. ampisilin klinik olarak anlamlı bir doz için seçilen TEM-1 β-laktamaz kullanılarak Örnek sonuçlar verilmiştir.

Özet

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 β-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to β-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

Giriş

Mutagenez uzun biyolojik sistemler ve bunların evrim özelliklerini incelemek için, ve gelişmiş ya da yeni fonksiyonlara sahip mutant proteinler veya organizmalar üretmek için laboratuvarda istihdam edilmiştir. Erken yaklaşımlar organizmalardaki rastgele mutasyonların üreten yöntemler dayanıyordu birlikte, yeniden birleştirici DNA teknolojisi gelişi site-spesifik bir şekilde DNA seçme değişiklikler, örneğin., Mevkiye yönelik mutagenez, ^1,2 tanıtmak etmesini sağlamıştır. Mevcut teknik, tipik olarak, bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) mutajenik oligonükleotidler kullanılarak birlikte, belirli bir gen ^3,4 mutasyonların az sayıda (örn.,, Nokta mutasyonlar) oluşturmak ve değerlendirmek için nispeten kolay olan. Bu çok daha zor ancak ne zaman gol yaklaşımları, örneğin, oluşturma ve değerlendirme tüm olası tek site (veya daha yüksek mertebeden) mutasyonları.

çok iken m çok sayıda değerlendirmek için çalışırken erken çalışmalarda öğrenilmiştirgenlerdeki utations, kullanılan teknikler ^5-7 suşları bağımsız saçma baskılayıcı kullanarak her mutasyonun değerlendirmesini gerektiren, örneğin sık sık zahmetli olduğunu, ya da bağlı Sanger sıralama ⁸ düşük sıralama derinliği onların nicel yeteneği sınırlı kalmıştır. Bu çalışmalarda kullanılan teknikler, büyük ölçüde yüksek verimli DNA dizilemesi ^9-12 kullanılarak yöntemlerle yerini edilmiştir. Kütüphane önce elde edilen ve bu kavramsal olarak basit yaklaşımlar fonksiyonu için bir ekran veya seçime kütüphane tabi, mutasyonlar çok sayıda içeren bir kütüphane oluşturma gerektirmez birlikte, ve sonra derin sıralama (yani.,> 10 ⁶ dizilim mertebesinde okur) seçimden sonra. Bu şekilde, mutasyonlar, çok sayıda fenotipik veya spor etkileri, her mutantın popülasyon frekans değişikliği olarak temsil aynı anda daha nicel olarak değerlendirilebilir.

Biz daha önce bir ahmak tanıttı(., yani bütün bir protein doyma mutagenezi kütüphaneleri) proteinleri mümkün olan tüm tek amino asit mutasyonlarının kütüphaneleri değerlendirmek geçerli uzun dizileme daha büyük bir uzunluğa sahip genlere, le yaklaşımı uzunluğu ^11,13 şöyledir: İlk olarak, her amino asit pozisyonu, randomize bir tarafından mutajenik PCR sitesine yönlendirilmiş. Bu işlem sırasında, bir gen dizisi platform tarafından yerleştirilmiş bir toplam uzunluğu bitişik pozisyon oluşan gruplara ayrılmıştır. Her bir grup için mutajenik PCR ürünleri daha sonra bir araya getirilmiş ve her bir grup, bağımsız olarak seçilmesi ve yüksek verimli dizilemesine tabi tutulmuştur. Dizisi ve sıralama okuma uzunluğu mutasyonların konumu arasında bir yazışma sürdürerek, bu yaklaşım maksimize sıralama derinlik avantajı vardır:. Bir sadece gruplar (örneğin, standart bir av tüfeği ile içine bölme olmadan kısa pencerelerde bu tür kütüphaneler sırası olabilir süre dizilim yaklaşımı) en vahşi tip ve dolayısıyla m şekilde elde edilen okumaboşa dizileme throughput ajority (80 en az% 100 amino asit (300 bp) pencereleri dizisi 500 amino asit proteini bütün bir protein doyma mutagenezi kütüphane, örneğin, doğal suş dizisi olacaktır kaydeder).

Burada, bir protokol (Şekil 1 'de ana hatlarıyla) yukarıdaki yaklaşım kullanılarak, tüm protein doyma mutagenezi kütüphaneleri fonksiyonel değerlendirmesi için yüksek verimli sekanslama kullanan şekliyle sunulmuştur. Daha da önemlisi, biz tarama veya seçime aynı anda maruz onları bir kütüphaneye çoklanÕr sağlar her sekans grubu, barkod kütüphane klonlama işleminde dik primerlerin kullanımı tanıtmak ve daha sonra derin dizileme için de-çoklanmış. dizi grupları bağımsız seçime tabi olmadığından, bu iş yükünü azaltır ve her mutasyon seçimi aynı düzeyde deneyimleri sağlar. TEM-1 β-laktamaz, yüksek düzeyde bir direnç kazandıran bir enzimβ-laktam antibiyotikler (örneğin., ampisilin) ​​bakteri, bir model sistem ^14-16 olarak kullanılır. Bir protokol E. TEM-1 bir bütün protein doyma mutagenezi kütüphanenin değerlendirilmesi için açıklanan ampisilin klinik dozu (50 ug / ml) ^17,18 için yaklaşık bir serum düzeyinde seçimi altında E. coli.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Not: protokol taslağı için Şekil 1'e bakınız. Protokolde birkaç adım ve ayıraçları ( "DİKKAT" ile gösterilen) güvenlik önlemleri gerektirir. Kullanmadan önce malzeme güvenlik bilgi formlarını danışınız. Diğer belirtilmedikçe tüm protokol safhaları, oda sıcaklığında gerçekleştirilir.

1. Kültür Ortamı ve Tabaklar hazırlayın

1. Hazırlama 1 L arı su, 100 mi süper optimal Broth (SOB, Tablo 1) otoklav ile sterilize 1 L Luria-Bertani etsuyu (LB; Tablo 2) ve 1 L LB-agar (Tablo 3). ayrı ayrı hazırlayın ve üç kültür döküm kalıplarını her biri 1 L kilodan sterilize
   Not: protokol "su" anlamına gelir boyunca için otoklav sterilize saf su; SOB, LB ve LB-agar otoklav sterilize çözümlere bakın.
2. % 70 etanol, 10 ml 0.12 g tetrasiklin hidroklorür eritilerek Tet 12 mg / ml stok hazırlayın. 0.2 mikron filtre ve mağaza kullanarak sterilize4 ° C'de ışıktan korunmuş.
3. daha sonra, 50 ° C'de ve serin LB-agar Tet stokunun 1 ml (12 ug / ml Tet nihai konsantrasyon) ilave edilir. ışıktan korunarak oda sıcaklığında petri kaplarında ve serin içine dökün. 4 ° C'de saklayın ışıktan korunması.

Tüm-geninin Doyma Mutajenizi Kütüphane 2. Yapı

Not: Astarlar; tamamlanan PCR, restriksiyon dijestleri ve ligasyonlar; ve saflaştırılmış DNA örnekleri -20 ° C 'de muhafaza edilebilir.

1. Mutajenez primerleri tasarlamak
   1. Tüm olası amino asitleri her bir amino asit pozisyonunu mutagenize için tamamlayıcı mutagenez primeri bir çift tasarım (sens / ileri ve antisens / geri) aşağıdaki kurallara her amino asit pozisyonu için:
      1. amino aside karşılık gelen kodon (N dört nükleotit sahalarının bir karışımıdır; ve S sitozin karışımı (C) ve guanin (G) 'dir), prim ve merkezi NNS mutagenize edilmesi değiştiriner, her iki tarafında yaklaşık 15 nükleotid ile çevrili.
      2. 5 've 3' erime sıcaklığı _(Tm) C ya da G ve sona erdi yaklaşık 70 ° C ³ olduğundan emin olun. bu yönergelere göre NNS mutagenez primerler tasarlamak için hesaplamalı komut NNS_PrimerDesign.m (Ek kod dosyası bakınız) kullanın.
   2. ticari bir kaynaktan al primerler. Kullanım kolaylığı için, bunları 96 gözlü plaka formatında sentezlenen ve sens mutagenez primeri ve başka bir anti-duyarlı primerler ihtiva eden plakalar seti ile, 50 uM su içinde önceden seyreltilmiş.
   3. su, bir pipet lavabo doldurun ve üç 96-yuvalı plakalar üzerinde 263 gözlere 95 ul aktarmak için bir çok kanallı pipet kullanın. su ihtiva eden plakalar aynı kökenli oyuklarına sens mutajenez primerleri ihtiva eden 96 oyuklu plakalar 5 ul transfer etmek için bir çok kanallı pipet kullanılarak Astarlar 2.5 uM 20-kat seyreltilir.
   4. Tekrar etprotokol adımı 2.1.3 antisens mutagenez primerler sulandırmak için.
2. İki aşamalı PCR yer yönelimli mutagenezle her amino asit pozisyonu için NNS alt kütüphane sentezi
   1. ilk turda mutajenik PCRlar gerçekleştirin. Her mutajenez astar, şablon ve primerler AatII_F veya AvrII_R olarak pBR322_AvrII plazmid kullanılarak 25 ul PCR reaksiyonu hazırlamak (astar AvrII_R ile eşleştirilmiş anlamda mutagenez astar ve astar AatII_F ile eşleştirilmiş antisens mutagenez astar, 526 PCR'lerine toplam). AatII_F ve AvrII_R dizileri için Malzeme Tablosu bakın.
      1. 15 ml konik tüp Tablo 4 reaktifler ekleyerek PCR "master miks" hazırlayın. Bir pipet havzasına aktarın. Üç 96 gözlü PCR plakaları üzerinde 263 gözlere 15 ul transfer etmek için bir çok kanallı pipet kullanın. aynı kökenli oyuklara seyreltildi sens mutajenez primerleri ihtiva eden 96 oyuklu plakalar 10 ul transfer etmek için bir çok kanallı pipet kullanarak In PCR plakaları.
      2. 96 oyuklu bir plaka conta ile her PCR plakası kapatılır. 2 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin.
      3. PCR PCR plakaları aktarın ve aşağıdaki programı çalıştırın: 30 saniye boyunca 98 ° C; 20 döngü: 10 saniye boyunca 98 ° C, 20 sn için 55 ° C, 1 dakika için 72 ° C; 2 dakika 72 ° C; 4 ° C'de tutun.
      4. seyreltilmiş antisens mutajenez primerleri içeren 96 kuyucuğu için 2.2.1.3 - tekrarlayın protokol 2.2.1.1 adımları.
   2. ikinci tur mutajenik PCRlar gerçekleştirin. her amino asit pozisyonu için, 25 ul PCR reaksiyonu primerler kullanılarak AatII_F ve AvrII_R ve karışık hazırlamak ve bir şablon (263 PCR'lerine toplamı) olarak ilk tur mutajenik PCR ürünleri seyreltilmiş.
      1. su, bir pipet lavabo doldurun ve üç 96-yuvalı plakalar üzerinde 263 kuyu 198 ul aktarmak için bir çok kanallı pipet kullanın.
      2. Birleştirin ve sulandırmak çok kanallı pipet kullanarak her bir amino asit pozisyonu için mutajenik PCR ürünleri 100 katilk transfer su ihtiva eden plakalar aynı kökenli oyuklarına sens mutagenez primerler elde edilen PCR ürünleri ihtiva eden 96 gözlü PCR plakaları 1 ul. Daha sonra anti-duyu primerleri mutagenez kaynaklanan PCR ürünleri için transferi tekrarlayın.
      3. 15 ml konik tüp, Tablo 5'ten reaktifler ekleyerek PCR "ana karışımı" hazırlayın. Bir pipet havzasına aktarın. Üç 96 gözlü PCR plakaları üzerinde 263 gözlere 24 ul transfer etmek için bir çok kanallı pipet kullanın. Karışık ihtiva eden 96 oyuklu plakalar 1 ul transfer etmek için bir çok kanallı pipet kullanarak ve PCR plakaları aynı kökenli çukurlara ilk tur mutajenik PCR ürünleri seyreltilmiştir.
      4. 96 oyuklu bir plaka conta ile her PCR plakası kapatılır. Santrifüj yaklaşık 200 x g, 2 dakika için. Transfer plakaları thermocyclerda protokol aşamasında 2.2.1.3 aynı programı çalıştırmak için.
   3. jel elektroforezi ile ikinci tur mutajenik PCR'ler sonuçlarını analiz.tüm ürünler doğru boyutta olduğundan emin olun ve ürünleri kontamine yoktur.
      1. Bir pipet havzasına 2x jel yükleme boyası 2 ml ilave edilir ve daha sonra, üç 96-kuyu tabak üzerinde 263 oyuklara 6 ul aktarmak için bir çok kanallı pipet kullanın. boya içeren 96 oyuklu plakalar aynı kökenli oyuklarına ikincil mutajenik PCR ürünlerini ihtiva eden 96 gözlü PCR plakaları 6 ul transfer etmek için bir çok kanallı pipet kullanın.
      2. 0.2 ug / ml etidyum bromür (DİKKAT) ile% 1.5 agaroz jeli hazırlayın.
      3. Her satırın ilk ve son şerit yük DNA merdiveni. Sonra protokol adımı 2.2.3.1 örneklerinin 10 ul yüklemek için bir çok kanallı pipet kullanın.
      4. UV transilluminator 40 dakika ve görüntü için 100 V jel çalıştırın.
      5. Tüm numuneler analiz kadar 2.2.3.4 - tekrarlayın protokol 2.2.3.2 adımları.
   4. Doğru bir dsDNA kantitatif reaktif kullanılarak her bir NNS alt kütüphane PCR ürününün konsantrasyonu ölçmek.
      1. transferBir pipet havzası yaklaşık 15 ml EB tampon. Üç 96 oyuklu siyah duvarlı, şeffaf tabanlı deney levhaları üzerinde 263 gözlere 49 ul transfer etmek için bir çok kanallı pipet kullanın.
      2. 96 oyuklu deney plakaları aynı kökenli oyuklarına her bir ikinci adımlı PCR ürünü (Protokol Adım 2.2.2) 1 ul aktarmak için bir çok kanallı pipet kullanın.
      3. 300 ul EB tamponu içinde 2 ng / ul lamda-faj DNA'sını seyrelterek bir DNA konsantrasyonu, bir standart eğri hazırlamak ve daha sonra (11 konsantrasyonlarının toplam) 1002-kat seyreltiler. Resim örneğini içeren önceki adımda elde edilen 96 oyuklu deney plakaları birine göre bir üst üste ilk on sütununa başına 50 ul; on ikinci kolonda EB tamponu 50 ul (boş tepkin maddesi) ilave edin.
      4. Reaktif 75 ul ekleyerek dsDNA kantitatif reaktif hazırlayın ardından EB tampon 15 ml ekleyin, 15 ml konik tüp (Malzeme Tablo). Tersine tüp karıştırın ve daha sonra bir pipet havzasına transfer. Işıktan reaktifi koruyun.
      5. deney plakalarının her çukuruna hazırlanan dsDNA kantitasyonu reaktifi 50 ul transfer etmek için bir çok kanallı pipet kullanın. yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. ışıktan korunmuş bir 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
      6. Mikrolevha okuyucu ve standart floresan dalga boyunda (0.1 sn eksitasyon 485 nm, emisyon 520 nm) kullanılarak her numunenin floresan ölçülür.
      7. Bütün numuneler Reaktif boş floresans değeri çıkarın. Lambda faj örnekleri fluoresans ölçümleri ile ilgili standart bir eğri oluşturur. ilgili floresans ölçümleri ve standart eğri kullanılarak her numune konsantrasyonu hesaplanır.
3. Seçim vektörleri içine NNS alt kütüphanelerinin Klonlama
   1. Beş NNS alt kütüphane gruba her NNS alt kütüphane PCR ürünü 100 ng karıştırın. üreticinin talimatlarına ardından, bir DNA saflaştırma kiti kullanılarak örnekleri temizlemek ve daha sonra bir ds kullanarak konsantrasyonu ölçmekDNA kantitatif reajanı.
      Not: Her bir grup (NNS alt kütüphane grupları 1 TEM-1 dizisi boyunca aralıklı yaklaşık 53 bitişik amino asit pozisyonları oluşur - 78, 79 - - 5 pozisyonları oluşmaktadır 26 132, 133-183, 184-236, ve 237-290 sırasıyla, numaralama) Ambler diğ ^19'a göre yöntem..
   2. Her NNS alt kütüphane grup için klonlama vektörleri oluşturun.
      1. Şablonu (pBR322_OP1 ile eşleştirilmiş AatII_OP1_R, vs.) AatII_OP5_R ve plazmidler pBR322_OP1-5 - primerler AvrII_F ve AatII_OP1_R kullanılarak Tablo 6'ya göre beş 100 ul PCR'ler hazırlayın.
      2. PCR ve aşağıdaki programı çalıştırmak için transfer: 30 saniye boyunca 98 ° C; 25 devir: 10 saniye boyunca 98 ° C, 20 sn için 55 ° C, 1.5 dakika 72 ° C; 2 dakika 72 ° C; 4 ° C'de tutun. AatII_R ve AvrII_F dizileri için malzemeler T mümkün bakın.
      3. 0.2 ug / ml etidyum bromür (DİKKAT) bir% 1 agaroz jeli hazırlayın.
      4. Her PCR örnek 6x jel yükleme boyası 20 ul ekle. DNA merdiveni ile jel ilk sokağın yükleyin; örnekler arasında iyi en azından bir atlama, her numunenin tüm hacmi yükleyin.
      5. 50 dakika boyunca 100 V jel çalıştırın.
      6. Uzun dalga boylu UV ışığı (DİKKAT) kullanarak jel gözünüzde canlandırın. ~ 3500 bp'lik PCR ürünü ihtiva eden Tüketim dilim; mikrofüj tüpleri ayrı aktarın. Jel dilimleri, -20 ° C'de saklanabilir.
      7. üreticinin talimatlarına ardından, bir jel ekstraksiyon kiti ve dsDNA kantitatif reaktif kullanılarak tedbir konsantrasyonu kullanılarak örnekleri arındırmak.
   3. Kısıtlama kurmak hem NNS alt kütüphane gruplar (protokol adım 2.3.1) ve klonlama vektörleri (protokol adım 2.3.2), 7 edebilmek T göre AatII ve Avrll enzimleri ile sindirir. 1 saat 37 ° C'de inkübe edin. üreticinin talimatlarına ardından, bir DNA saflaştırma kiti kullanılarak örnekleri temizlemek ve daha sonra bir dsDNA quantità kullanarak konsantrasyonu ölçmektion reajanı.
   4. Ligasyon reaksiyonları soydaş kısıtlama sindirilmiş klonlama vektörü (pBR322_OP1 ile NNS alt kütüphane grup 1, vs.) her kısıtlama sindirilmiş NNS alt kütüphane grup için Tablo 8'de aşağıdaki ayarlayın. 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. üreticinin talimatlarına göre bir DNA saflaştırma kiti kullanılarak reaksiyonlar temizleyin; su 20 ul DNA yıkayın.
   5. Kütüphane verimli E. içine saflaştırılmış ligasyon reaksiyonları bütününü Transform elektroporasyon ile E. coli hücreleri.
      1. Çözülme elektro-E. coli hücreleri ve daha sonra yer hücreleri ve buz üzerinde saflaştırılmış ligasyonu reaksiyonları.
      2. Aktarım 10 ul, her saflaştırılmış ligasyon reaksiyonu hücrelerin çözülmüş ve daha sonra elektroporasyon küvetine aktarılır. 1.8 kV electroporate.
      3. 1 ml SOB resuspending hücreleri kurtarın. 37 ° C'de 1 saat süreyle inkübe edin.
      4. 990 ul LB her kurtarma kültürü 10 ul yeniden süspanse; LB-agar plakaları c 100 ul yayıldıiçeren gruptur 12 ug / ml Tet. inkübe edin O / 37 ° C de N (~ 16 saat).
      5. Her bir geri kültür için 50 mi LB ve 50 ul Tet stoku 250 ml bir kültür şişesi hazırlayın. Kurtarma kültür kalan yaklaşık 1 ml'lik bir şişeye aktarın. kuvvetlice çalkalanarak (yaklaşık 200 rpm) ile 37 ° C 'de O / N (~ 16 saat) inkübe edin.
   6. Her plaka üzerinde koloni sayısını saymak. başarılı transformantların sayısını hesaplayın , nerede kolonilerin sayısı, bir geri kültür hacmi (1.000 ul) ve Kurtarma kültürün hacmi (1 ul) kaplı olduğunu.
      Not: Başarılı transformantların sayısı olmalıdır kural olarak, tüm mutasyonlar tam kapsama sağlamak için ≥1beklenen mutasyonların sayısının üzerinde 00 kat. Her NNS alt kütüphane ~ 53 pozisyon vardır, bu yüzden mutasyonlar beklenen sayısı 53 pozisyonları 32 × kodonlar / pozisyon ≈ 1.7 × 10 ^3'tür; Bir kütüphane büyüklüğü ≥100 kat (≥1.7 x 10 ⁵⁾ vermek üzere, her bir plaka üzerine ≥170 kolonileri olmalıdır.
   7. üreticinin talimatlarına göre, bir plazmid arındırma kiti kullanılarak kültürden plazmid DNA izole etmek ve daha sonra bir dsDNA kantitasyonu ayıracı kullanılarak ölçüldüğü. birlikte her bir plazmid, 100 ng karıştırın. Bu son Bütün protein doyma mutagenezi kitaplığı oluşturur.

Antibiyotik Direnci için TEM-1 Tüm-protein Doygunluk Mutagenez Kütüphanesi 3. Seçim

1. Ön seçim kültürünün hazırlanması.
   1. Suda 0.5 ng / ul protokol adımı 2.3.7 den plazmid sulandırmak ve bir mikrosantrifüj tüp 20 ul aktarın. yeniden, dönüşümü gerçekleştirmeköğrenilmesidir, kaplama ve daha önce 999 ul LB transfer dışında, protokol aşamasında 2.3.5 yılında SOB kurtarma kültürü 1 ul açıklandığı gibi O / N büyüme
   2. koloni sayısını sayın. Tüm mutasyonların tam kapsama sağlamak için ≥10 ⁶ başarılı transformantları (10 ⁶ ≈ 32 kodonlar / pozisyon × 100 × 263 pozisyonlar) belirten ≥100 koloni olmalıdır.
   3. 50 mi O / N kültür konsantrasyonu ölçümü.
      1. Bir spektrofotometre küvete 1 mL LB ekleyerek LB boş hazırlayın. bir spektrofotometre ile OD600 ölçün.
      2. 900 ul LB 100 ul yeniden süspanse O / N kültür 10 kat seyreltilir OD600 ölçün. Boş bir OD600 okumasını çıkart ve O / N kültür OD600 vermek üzere 10 ile çarpın.
   4. 37 ° C'de ~ 30 dakika boyunca protokolün adım 1.1 üç kültür şişeleri önceden ısıtın. OD600 = 0.1 için O / N kültürünü sulandırmak ve bir şişede (son OD600 = 0.001) 1 ml ekleyin. Tonun "ön seçim kültürü" dir.
   5. çalkalama (200 rpm) ile 37 ° C 'de "ön seçim kültür" inkübe edin. Periyodik OD600 = 0.1 (~ 2.5 saat) kadar (kültür 10 kat seyreltilmesi gerekli değildir) protokolü Adım 3.1.3 gibi OD600 ölçülerek büyüme izlemek.
   6. iki adet 50 ml konik tüp ön seçim kültür 100 ml aktarın. 4 ° C'de 6 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüjleyin. süpernatant en çıkarmak ve tek 15 konik tüp içine birleştirmek. santrifüj tekrarlayın ve tüm süpernatant kaldırmak. -20 ° C'de saklayın.
2. Ampisilin direnci için seçme.
   1. ön seçim kültürü kuluçka iken, 10 ml su içinde 0.5 g sodyum ampisilin çözülmesiyle su içinde Amp 50 mg / ml stok hazırlama. 4 ° C 'de 0.2 um filtresi ve deposunu kullanan sterilize edin.
   2. Diğer iki şişelere mL, 12 ug / bir son konsantrasyona ve ön seçim kültürü gibi tha bir hacme kadar Tet ekle Nihai OD600 = 0.001 t. Bir şişeye, 50 ug / ml'lik nihai bir konsantrasyon için, 1 ml Amp - bu "seçme kültürü".
   3. çalkalama (200 rpm) ile 37 ° C 'de kültür inkübe edin. OD600 = 0.1 (~ 2.5 saat) kadar hiçbir ampisilin önceki adımda ilave edildiği için kültür büyümesini izlemek. Şu anda, aynı zamanda seçim kültürünün OD600 ölçmek.
   4. 0.1 içine seçim kültürünün OD600 bölün ve 100 ml ile çarpın. 4 ° C'de 6 dakika boyunca 4000 x g'de 50 ml konik tüp ve santrifüj Bu hacim (~ 400 mi) aktarın. süpernatant en çıkarmak ve tek 15 konik tüp içine birleştirmek. santrifüj tekrarlayın ve tüm süpernatant kaldırmak.
   5. üreticinin talimatlarına göre, ön seçim (Protokol Adım 3.1.6) ve seçim (Protokol Adım 3.2.4) kültürü hücre pelletleri plazmid DNA izole etmek ve daha sonra bir dsDNA kantitasyonu ayıracı kullanılarak ölçüldüğü.

> 4 tle ". Yüksek verim Sıralama Mutasyonların Fitness Etkileri belirleme

1. Yüksek sekanslama için numunelerin hazırlanması
   1. ortogonal primerleri ile NNS alt kütüphane grupları de-multiplex 25 ul PCRlar hazırlayın
      1. Tablo 9 'a göre bir PCR master karışımı hazırlamak; On PCR tüplerine 23 ul transfer.
      2. 10 - 6 tüpleri 5 ve seçme kültüründen - 1 tüpleri PCR için ön seçim kültüründen 0.5 ng / ml saflaştırılmış plazmid DNA 1 ul ekleyin.
      3. ilgili ters ortogonal primerler OP1_R ile OP5_F - - birlikte, 50 50 uM ileri ortogonal primerler OP1_F ul karıştırın OP5_R. Aynı sırayla, PCR tüplerine transferi 1 ul 1 - 5 ve 6 - OP5_F ve OP1_R - - OP5_R OP1_F dizileri için Materyallerin 10. Bknz Tablo.
      4. PCR PCR tüpleri aktarın. Aşağıdaki programı çalıştır: 30 saniye boyunca 98 ° C; 20 devir: 10 sn, 55 ° 98 ° C; 20 sn için Cı, 1.5 dakika 72 ° C; 2 dakika 72 ° C; 4 ° C'de tutun.
   2. NNS alt kütüphane gruplarının her biri izole etmek 25 ul PCRlar hazırlayın
      1. -100 kat sulandırmak PCR tüpleri ayırmak için her 1 ul aktarılması ve su 99 ul ekleyerek protokol adım 4.1.1.4 on PCRlar. Mix, daha sonra 99 ul dışarı pipet ve atın.
      2. ilgili ters primerler Group1_R ile Group5_F - - birlikte 50 uM ileri primerler Group1_F 50 ul karıştırın Group5_R. Aynı sırayla transfer 1 ul tüpleri PCR 1 - 5 ve 6 - Group5_F ve Group1_R - - Group5_R Group1_F dizileri için Materyallerin 10. Bknz Tablo.
      3. Tablo 9'a göre bir PCR master karışımı hazırlayın Her bir PCR tüpü 23 ul transfer. PCR PCR tüpleri aktarın; protokol aşamasında 2.2.1.3 aynı programı çalıştırın.
   3. indeksleme dizileri eklemek için son 25 ul PCRlar yürütmek
      1. diUd PCR tüpleri ayırmak için her 1 ul aktarılması ve su 99 ul ekleyerek protokol adım 4.1.2.3 on PCRlar 100 kat. Mix, daha sonra 99 ul dışarı pipet ve atın.
      2. Tablo 9'a göre bir PCR master karışımı hazırlayın Her bir PCR tüpü 23 ul transfer.
      3. 505_F sırasıyla - NNS alt kütüphane gruplardan 1-5, kaynaklanan şablonuyla borular için 501_F tüp ileri primerler başına 0.5 ul aktarın. seçim öncesi ve seçim kültürlerinden kaynaklanan şablonuyla borular için, tüp başına 0.5 ul sırasıyla primerleri 701_R ve 702_R ters aktarın. 501_F dizileri için malzemeler İçindekiler'i izle - 505_F ve 701_R ve 702_R.
      4. PCR PCR tüpleri aktarın ve adım 2.2.1.3 programı çalıştırın.
   4. Mix ve örnekleri arındırmak
      1. Ölçü konsantrasyonları, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir dsDNA kantitasyonu reaktif kullanılarak hazırlanabilir. Her PCR ürünü int 100 ng Mixoa tek mikrosantrifüj tüp.
      2. 0.2 ug / ml etidyum bromür (DİKKAT) bir% 2 agaroz jel hazırlayın.
      3. Karışık PCR ürünleri örnek 6x jel yükleme boyası ekleyin. DNA merdiveni ile jel ilk sokağın yükleyin; numunenin tüm hacmi yükleyin.
      4. 50 dakika boyunca 100 V jel çalıştırın. Uzun dalga boylu UV ışığı (DİKKAT) kullanarak jel gözünüzde canlandırın. ~ 360 bp PCR ürünü içeren tüketim dilim; tüp mikrofuge'de transfer. Jel dilimi 20 ° C'de saklanabilir.
      5. üreticilerin talimatlarını izleyerek, bir jel ekstraksiyon kiti kullanılarak örnek arındırmak ve dsDNA kantitatif ayıracı kullanılarak konsantrasyonu ölçmek. Bu yüksek sekanslama için son örnek.
   5. Yüksek verim sıralama platformu üzerinde Dizisi (Bu protokolde kullanılan platform için Malzemelerin Tablo).
      1. nM olarak örnek konsantrasyonunu hesaplamak , Burada olan ng / ul numune konsantrasyonu ve Örnek DNA (~ 360 bp) sekansı uzunluğudur. EB tamponunda 4 nM örnek sulandırmak.
      2. örnek denatüre ve melezleme tamponunda 9 pM sulandırmak için üreticinin talimatlarına uyun.
      3. Yük reaktif kartuşu içine numune 600 ul. üreticinin talimatlarına ve ekrandaki istemleri aşağıdaki dizisi.
2. Dizileme veri analizi
   1. Flash (Short hızlı Uzunluğu Ayarı okur) ²⁰ indirin sıralama elde fastq.gz dosya ile birlikte klasöre koyun.
   2. Kullanım Flaş eşleştirilmiş sonuna tekabül fastq.gz dosyaları endeksleri her çifti için okur (ileri ve geri ön seçim ve seçim kültürleri için her NNS alt kütüphane grubu için okuma) katılmak için.
      1. Açık Komut İstemi ve değişim dizini protokol aşamasında 4.2.1 klasöre. komutunu kullanarak okur her çift katılın: Flaş , mates1.fastq.gz ve mates2.fastq.gz ileri içeren dosyaları ve sırasıyla okur ters nerede.
   3. okur her çift katıldıktan sonra, ön seçim veya seçim kültürlerden sonuçları için ayrı klasörler halinde out.extendedFrags.fastq çıktı dosyası yerleştirin. Için o tekabül eden (yani., 1.fastq, 2.fastq, vb) NNS alt kütüphane grubuna göre out.extendedFrags.fastq çıktı dosyasını yeniden adlandırın.
   4. hesaplamalı komut NNS_DataAnalyzer.m çalıştırın her NNS alt kütüphane grup için, yabani tip için, tek tek her bir amino asit mutasyon sayıları ve sayıları hesaplamak için her klasörden (Ek kod dosyası bakınız).
   5. Fitness etkisi hesaplamak Her mutasyon Her pozisyonda / seçimde elde edilen sayım oranı baz on logaritma (as ) Ön seçim karşı ( vahşi tipe göre) durumu:
      .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Ortogonal hazırlama siteleri içeren beş modifiye pBR322 plazmid plazmid haritası (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) Şekil 2A'da gösterilmiştir. Ortogonal primerler PCR beş pBR322_OP1-5 plazmid ile birlikte, ayrı ayrı dik primerlerin her çifti kullanılarak gerçekleştirilebilir veya tüm plazmidler eksi ortogonal primer çifti uyan plazmid olan edildi özel olup olmadığını test etmek için. Uygun plazmid dahil, doğru ürün sadece elde edildi ve herhangi bir ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada bir protokol, yüksek verimli DNA dizilemesi kullanılarak, tüm protein doyma mutagenezi kütüphaneleri fonksiyonel değerlendirme yapmak için tarif edilmektedir. yöntemin önemli bir özelliği, klonlama işlemi sırasında dik primerler kullanılmasıdır. Kısaca, her bir amino asit pozisyonu, mutajenik PCR ile randomize edilir ve birleştirilen dizi uzunluğu, yüksek verimli sekanslama ile yerleştirilmiştir pozisyonları gruba karıştırılır. Bu gruplar, ortogonal hazırlama yerleri, karıştırıl?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Typtone	Research Products Intl. Corp.	T60060-1000.0
Yeast extract	Research Products Intl. Corp.	Y20020-500.0
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506-500G
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
Tetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	T7660-5G
Petri plates	Corning	351029
MATLAB	Mathworks	http://www.mathworks.com/products/matlab/
Oligonucleotide primers	Integrated DNA Technologies	https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos	25 nmol scale, standard desalting
pBR322_AvrII	available upon request		pBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene
pBR322_OP1 – pBR322_OP5	available upon request		five modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites
Q5 high-fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0491L	includes 5x PCR buffer and PCR additive (GC enhancer)
15 ml conical tube	Corning	430025
Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus)	Eppendorf
PCR plate, 96 well	Fisher Scientific	14230232
96 well plate seal	Excel Scientific	F-96-100
Veriti 96-well thermal cycler	Applied Biosystems	4375786
6x gel loading dye	New England Biolabs	B7024S
Agarose	Research Products Intl. Corp.	20090-500.0
Ethidium bromide	Bio-Rad	161-0433
UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech)	Fotodyne Inc.	http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation
EB buffer	Qiagen	19086
96-well black-walled, clear bottom assay plates	Corning	3651
Lambda phage DNA	New England Biolabs	N3011S
PicoGreen dsDNA reagent	Invitrogen	P7581	dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4
Victor 3 V microplate reader	PerkinElmer
DNA purification kit	Zymo Research	D4003
Microcentrifuge tubes	Corning	3621
Long-wavelength UV illuminator	Fisher Scientific	FBUVLS-80
Agarose gel DNA extraction buffer	Zymo Research	D4001-1-100
AatII	New England Biolabs	R0117S
AvrII	New England Biolabs	R0174L
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S
EVB100 electrocompetent E. coli	Avidity	EVB100
Electroporator (E. coli Pulser)	Bio-Rad	1652102
Electroporation cuvettes	Bio-Rad	165-2089
Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro)	Amersham Biosciences	80211237
50 ml conical tubes	Corning	430828
Plasmid purification kit	Macherey-Nagel	740588.25
8 well PCR strip tubes	Axygen	321-10-551
Qubit dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q32854	dsDNA quantitation reagent
Qubit assay tubes	Invitrogen	Q32856
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q32866
Ampicillin sodium salt	Akron Biotechnology	50824296
MiSeq reagent kit v2 (500 cycles)	Illumina	MS-102-2003
MiSeq desktop sequencer	Illumina	http://www.illumina.com/systems/miseq.html	alternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform
FLASh software	John Hopkins University - open source	http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/	software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data
AatII_F			GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC
AvrII_R			CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG
AvrII_F			CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG
AatII_OP1_R			ACCTGACGTCCGTATTTCAAC TGTCCGGTCTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP2_R			ACCTGACGTCCGCTCACGGA GTGTACTAATTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP3_R			ACCTGACGTCGTACGTCTGA ACTTGGGACTTAAGAAACCA TTATTATCATGACATTAAC
AatII_OP4_R			ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT ACCAAGTGATAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP5_R			ACCTGACGTCGTCCGTCGGA GTAACAATCTTAAGAAACCAT TATTATCATGACATTAAC
OP1_F			GACCGGACAGTTGAAATACG
OP1_R			CGACGTACAGGACAATTTCC
OP2_F			ATTAGTACACTCCGTGAGCG
OP2_R			AGTATTAGGCGTCAAGGTCC
OP3_F			AGTCCCAAGTTCAGACGTAC
OP3_R			GAAAAGTCCCAATGAGTGCC
OP4_F			TCACTTGGTATCGAGAACGG
OP4_R			TATCACGGAAGGACTCAACG
OP5_F			AGATTGTTACTCCGACGGAC
OP5_R			TATAACAGGCTGCTGAGACC
Group1_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGC ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC
Group1_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC TTGCCCGGCGTCAAC
Group2_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGA ACGTTTTCCAATGATGAGCAC
Group2_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT CCTCCGATCGTTGTCAGAAG
Group3_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNAG TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC
Group3_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC GCCAGTTAATAGTTTGCGC
Group4_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCC AAACGACGAGCGTGACAC
Group4_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC AATGATACCGCGAGACCC
Group5_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCG GCTGGCTGGTTTATTGC
Group5_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG
501_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTATAGCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC
502_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACATAGAGGCACA CTCTTTCCCTACACGAC
503_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACCCTATCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC
504_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACGGCTCTGAACA CTCTTTCCCTACACGAC
505_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACAGGCGAAGACA CTCTTTCCCTACACGAC
701_R			CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATCGAGTAATGTGACTG GAGTTCAGACGTG
702_R			CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATTCTCCGGAGTGACTG GAGTTCAGACGTG