Yer Alan Ana Faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler<em&gt; Brucella</em&gt; Hela Hücrelerinin Enfeksiyon

Özet

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

Özet

Brucella türleri doğal olarak ana hayvanları enfekte fakültatif hücre içi patojenlerdir. insanlara İletim en sık enfekte hayvanlarla doğrudan temas yoluyla veya kontamine gıda tüketilmesi neden olmaktadır ve şiddetli kronik enfeksiyonlara yol açabilir.

Brucella profesyonel ve profesyonel olmayan fagositik hücreleri istila ve endoplazmik retikulum (ER) türevi vakuollerde içinde çoğaltır olabilir. ER-benzeri bölmeye Brucella konakçı hücreler içine giriş lızozomal degradasyon kaçınma ve replikasyon için gereken ana faktörler büyük ölçüde bilinmemektedir. Burada HeLa hücrelerinde Brucella giriş ve replikasyonda rol oynayan konak faktörleri tanımlamak için iki analizler açıklanmaktadır. Alternatif tarama yöntemleri uygulanabilir ise protokolleri, RNA interferansı kullanımını tarif eder. deneyler, floresan etiketli bakterilerin saptanması otomatik kullanarak floresan etiketli konakçı hücreler dayanmaktadırgeniş alan mikroskobu. floresan görüntüler tek bir hücre bazlı enfeksiyonu puanlama sağlar CellProfiler standart bir görüntü analiz boru hattı kullanılarak analiz edilir.

uç nokta deneyi olarak, hücre içi çoğaltma enfeksiyondan iki gün sonra ölçülür. Bu çoğalma başarıyla böylece güçlü konak hücreler içinde çoğaldı olacak bir hücre içi niş kurduk bakteriyel giriş. Brucella sonra 12 saat civarında başlatılan onların replikatif niş trafik bakterileri sağlar. hücre içi bakteri büyük ölçüde bireysel hücre dışı ya da hücre içi replikatif olmayan bakteri sayıca bu yana, kurucu GFP eksprese eden bir suş kullanılabilir. Güçlü GFP sinyali daha sonra enfekte olmuş hücreleri tanımlamak için kullanılır.

Buna karşılık, giriş analizi için hücre içi ve hücre dışı bakteriler arasında ayırt etmek için gereklidir. Burada, bir tetrasiklin-indüklenebilir GFP için bir suş kodlaması kullanılır. indüksiyonGentamisin ile hücre dışı bakterilerin eşzamanlı inaktivasyonu ile GFP tek hücre içi bakteriler GFP ifade edememek ile, hücre içi ve GFP sinyaline dayalı dışı bakteriler arasındaki farklılaşma sağlar. hücre içi çoğalması başlamadan önce bu tek hücre içi bakteri sağlam algılanmasını sağlar.

Giriş

Brucella türleri α-proteobakteride sınıfına ait gram-negatif, fakültatif hücre içi patojenlerdir. Bunlar endemik bölgelerde ciddi ekonomik kayıplara neden sığır, keçi veya koyun gibi kendi doğal hosts kürtaj ve kısırlığa neden olur. Bruselloz tüm dünyada her yıl yarım milyon yeni insan enfeksiyonları üzerinde ¹ yol açan en önemli zoonoz hastalıklardan biridir. insana İletim en yaygın pastörize olmamış süt gibi enfekte hayvanlarla doğrudan temas yoluyla veya kontamine gıda tüketilmesi neden olmaktadır. ateşli hastalık belirtileri bruselloz tanısında zorluklar neden olan belirsiz bulunmaktadır. Eğer tedavi edilmezse, hasta artrit, endokardit ve nöropati ² gibi daha ciddi semptomları olan bir kronik enfeksiyon gelişebilir.

Hücresel düzeyde Brucella fagositik ve fagositik olmayan hücreleri istila edebilir ve bir hücre içi içinde çoğaltırBrucella içeren yeni vakuol (BCV) olarak bilinen bölme. Bakterilerin içselleştirilmesi Rac, Rho ve Cdc42 ³ direkt aktivasyonu ile aktin hücre iskeletinin düzenlenmeleri gerekmektedir. Ökaryotik konak hücre içinde, BCV endositik yolu boyunca trafik işlemlerini ve lizozomlar ile etkileşim rağmen, bakteriler bozulmasını ⁴ önlemek için yönetmek. Veziküler ATPaz ile BCV asitleştirilmesi bakteriyel tip IV salgılama sistemine (T4SS) ⁵ ekspresyonunu indüklemek için gereklidir. Brucella onun replikatif niş kurmak için T4SS salgıladığı bakteriyel efektörler hücre içi niş ⁷ kurulması kusurlara T4SS ⁶ silinmesi veya vesiküler ATPaz kurşun inhibisyonu için, gerekli olan inanılmaktadır. Bakteriler onlar kadar insan ticareti aşamasında çoğaltmak yok bir ER-kaynaklı vakuoler bölmesini ⁸ ulaşır. Hücre içi çoğalması meydana geldiğinde, BCV cl bulunanBu calnexin ve glukoz-6-fosfataz ⁶ olarak ER işaretleri ile ose birliği.

Brucella bir ER-benzeri bölmeye, hücrelere girer lizozomal bozulması önler ve nihayet çoğaltır hangi moleküler mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. Enfeksiyon farklı aşamalarında yer alan konak faktörleri esas hedeflenen yaklaşımlar veya Drosophila hücreleri ⁹ gerçekleştirilen küçük ölçekli bir küçük müdahale edici RNA (siRNA) ekran tarafından tespit edilmiştir. Bunlar, Brucella enfeksiyonu sırasında bireysel konak faktörleri katkısı ışık tutmuştur ama biz tüm sürecin kapsamlı bir anlayış uzak hala.

Burada, otomatik geniş alan, flüoresans mikroskopisi ve otomatik görüntü analizi ile kombinasyon halinde, büyük ölçekli RNA interferans (RNAi) tarama kullanılarak insan konakçı faktörlerin tanımlanmasını sağlar protokolleri sunulmaktadır. HeLa hücrelerinin ters siRNA transfeksiyon describ olarak gerçekleştirilired önce ^10,11 küçük değişikliklerle. Son nokta tahlil çıkış ve komşu hücrelerin enfeksiyon dışında Brucella hücre içi yaşam döngüsünün büyük bir kısmını kapsamaktadır. daha uç nokta deneyi tanımlanan isabet karakterize etmek için, enfeksiyonun erken dönemlerinde yer faktörleri tanımlamak için değiştirilmiş bir protokol kullanılmıştır.

Yapısal olarak GFP eksprese eden bir Brucella abortus suşu bakteri iki gün hücrelerini enfekte etmek için izin verilen nokta deneyi için kullanılmaktadır. Bu süre boyunca, bakteri ER-türevi replikatif niş hücreleri, trafik butonu ve peri-nükleer alanı içinde replike. GFP sinyali yüksek düzeyde daha sonra güvenli bir çoğaltma bakteriler içeren tek tek hücrelerin tespit etmek için kullanılabilir.

Bir yüksek verimli bir deney Brucella giriş incelemek için, hücre içi ve hücre dışı bakteriler ayırt edebilmek için önemlidir. yöntem, burada circumv sunulmaktadırhücre içi ve hücre dışı bakteri-oranları farklı antikor boyama. Bu DsRed yapısal ifadesi ile bir arada bir tetrasiklin indüklenebilir GFP eksprese eden bir Brucella suşunun dayanır. bir kurucu DsRed markör mevcudiyeti numunede mevcut olan tüm bakteri belirlenmesini sağlar. GFP tanımı gentamisin aynı anda hücre dışı bakteri inaktivasyonu ile toksik olmayan tetrasiklin analog anhydrotetracycline (ATC) ilave (GM) tarafından indüklenir. Hücre geçirmez antibiyotik Gm dışı bakterileri öldürür iken, ATC konak hücre içine girer ve hücre içi bakteriler seçici GFP ifade uyarabilir. Bu ikili raportör geniş alan mikroskopi kullanılarak hücre dışı bakteriler (sadece DsRed sinyali) ile ilgili bir hücre içi bakteri (GFP ve DsRed sinyali) sağlam ayrılmasını sağlar. Hücre içi Brucella ile tespit GFP ifade ulaşmak için biz ATC tarafından indüksiyon 4 saat bir dinleri sonuçlanır buldukmümkün sinyali. Seçici hücre içi bakteriler GFP ifade Benzer indüksiyon şemaları hücre içi Shigella ¹² incelemek için önceden kullanılır olmuştur.

Protokol

Not: Canlı Brucella abortus suşları ile tüm çalışmalar gerekli tüm düzenlemeleri ve güvenlik önlemlerini göz önünde biyogüvenlik seviye 3 (BSL3) laboratuvar içinde yapılmalıdır.

1. Eleme Tabaklar hazırlanması ve Bakteri ve Hücre ekimi

1. Brucella abortus Starter Kültürlerin Hazırlanması
   1. Şerit Brucella 50 ug / ml kanamisin (TSA / Km) ihtiva eden bir triptik soya agar (TSA) plaka üzerinde -80 ° C, süt stoktan 2308 (B. abortus) abortus. 37 ° C'de 3-4 gün süreyle inkübe levhasını. Giriş tahlil için 2308 pJC43 (aft :: GFP) abortus suşu Brucella uç nokta deneyi için ¹³ ve zorlanma Brucella abortus pAC042.08 (aft :: DsRed, TETO :: tetR-GFP) kullanın.
      Not: Brucella abortus düzgün lipopolisakkarid (LPS) önemli bir virülans belirleyicisi olan ancak pürüzlü mutantlar nispeten yüksek frekanslarda ¹⁴ oluşabilir. WE böylece bu deneyle başlamadan önce kültür suşu durumunu test öneriyoruz.
   2. tam plaka kapsayan dört TSA / Km tabakalarına Restreak bakteriler 37 ° C'de 2-3 gün süreyle inkübe edilir.
   3. 10 ml% 10 otoklava yağsız süt TSA / Km plakaları atılabilir plastik döngü, transferi ve tekrar süspansiyon bakteri kullanma. Bakteriler de tüm starter kültürler tutarlı bakteri konsantrasyonları sağlamak için yeniden süspanse emin olun.
   4. 2 ml bakteriyel süspansiyon kısım 250 ul -80 ° C de kap tüpleri ve donma vidalayın.
   5. kültürlü bir kısım çözülme ile kapak şişe 25 ul, 50 ul ve 250 ml ayırmak için bakteriyel başlangıç ​​kültürü, 100 ul transfer vidası 50 mi Tryptic Soy Broth (TSB) içeren 50 | ig / ml kanamisin (TSB / Km) . Parafilm ile şişeleri mühür.
   6. 100 rpm'de ve 37 ° C'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde gece boyunca şişe inkübe edin.
   7. 600 n optik yoğunluğu ölçmekm (OD ₆₀₀₎ gece kültürden sonra bir OD ₆₀₀ = 0,8-1,1 ulaşmak için gerekli olan starter kültür hacmini belirlemek.
2. HeLa hücrelerinin hazırlanması
   1. Dulbecco HeLa hücreleri büyümek _2.% 80 konfluansa kadar hücreler büyümek% 5 CO ile 37 ° C, nemli bir inkübatörde% 10 fetal buzağı serumu (FCS) (DMEM /% 10 FCS) ile takviye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) değiştirildi.
3. siRNA'lar ile Tarama Tabaklar hazırlayın.
   1. 0.32 uM'lik bir son konsantrasyona kadar, RNaz içermeyen su içinde siRNA'lar seyreltilir. Aktarım 5 ul / kuyucuktan Siyah temiz-gözlü düz dipli 384 oyuklu plakalar.
      1. sütun 1, 2, 23, ve standart kontroller için 24 kullanımı. Negatif kontroller için siRNA'lar (transfeksiyon reaktif sadece) olmadan siRNA (şifreli) olmayan hedefleme ve sahte kuyuları kullanın. Transfeksiyon kontrol için, bir hücre ölümüne neden olur siRNA (KIF11) yanı sıra, Brucella enfeksiyonu (ör ARPC3 dahil bilinen bir ev sahibi faktörlerinin pozitif kontrol kullanımıaktin polimerizasyonu katılan ARP2 / 3 kompleksinin) bir bileşeni. Kalan kuyulara siRNA kütüphaneleri veya özel siRNA'lar piyasadan temin aktarın.
      2. soyulabilir alüminyum folyo ile mühür plakalar. -20 ° C'de saklayın plakalar.
         Not: Levhalar, üreticinin tavsiyelerine göre yıl en az 6 ay boyunca ve en fazla -20 ° C 'de muhafaza edilebilir.

2. Ters siRNA Transfeksiyon

1. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile siyah 384 oyuklu plaka çözülme.
   Not: Bu kapak veya kuyuların tarafına bağlı olabilecek tüm sıvıyı aşağı getirecek.
2. transfeksiyon reaktifi 1 seyreltilerek transfeksiyon ortamı hazırlayın: 200 DMEM FCS olmaksızın oda sıcaklığında karıştırılmıştır. artık kullanımdan önce 20 dakika daha transfeksiyon ortamı hazırlayın. Kullanmadan önce çözüm karıştırın.
3. de reaktif dağıtıcı kullanarak her transfeksiyon ortamı ul 25 eklemeve ileri geri hareket ettirerek plakayı çözüm karıştırın.
4. siRNA / transfeksiyon reaktif kompleksi oluşumuna imkan verecek, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona bırakılır.
5. Bu süre içinde, PBS içinde 2.5 mi% 0.05 tripsin-EDTA (tripsin) ile bir kez 75 cm ² şişenin alt konfluent hücreler yıkanarak HeLa hücreleri hazırlamak.
6. 1.5 ml taze tripsin ekleyin ve hücreler yuvarlak kadar 2-3 dakika süreyle 37 ° C şişeyi aktarın.
7. 10 ml önceden ısıtılmış DMEM /% 16 FCS hücrelerinin yeniden süspanse.
8. otomatik bir hücre sayacı hücrelerin sayısı ve DMEM /% 16 FCS içinde 10,000 hücre / ml'lik bir hücre süspansiyonu.
9. her bir / oyuk 500 hücre ile sonuçlanan bir reaktif dağıtıcı kullanılarak 50 ul hücre süspansiyonu ekleyin.
10. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için ileri ve geri plaka hareket ettirin. Hücreler yerleşmek için izin vermek için 5-10 dakika oda sıcaklığında plaka bırakın.
11. Parafilm ile plaka kapatılır ve ısıtılmış bir alüminyum üzerinde 72 saat için inkübe% 5 CO ₂ ile 37 ° C nemli inkübatör plaka.
    Not: önceden ısıtılmış alüminyum levha, tüm 384 oyuklu plaka içinde eşit ısı dağılımı sağlar.

3. Enfeksiyon ve Fixation

1. Bir gün önce, enfeksiyon, B. 1.1.7 belirlenen miktarda inoküle 250 ml lik bir 50 ml TSB / Km ortamı abortus başlatıcı kültür vida kapaklı şişeye. Parafilm ile şişe kapatılır ve = 0,8-1,1 OD _600, 37 ° C ve orbital bir karıştırıcı üzerinde 100 rpm'de bir gece boyunca bakteri büyür.
2. Bakteri kültürü _OD600 ölçün ve enfeksiyon istenen çokluğu (İB) elde etmek için, DMEM /% 10 FCS içinde bakteri kültürü seyreltilmesiyle enfeksiyon ortamı hazırlar.
   Not: HeLa hücrelerinde% 5-10 arasında bir enfeksiyon oranını elde etmek için, 10.000 bir İçişleri Bakanlığı kullanılır. MOI titrasyon eğrisi uygun enfeksiyon oranı elde etmek için, her hücre türü için gerçekleştirilmelidir.
3. 384 plaka transfeksiyon ortam değişikliğiEnfeksiyon işlemi sıvının 50 ul bir otomatik plaka yıkayıcı kullanılarak.
4. 400 x g'de 384 oyuklu plaka santrifüj ve 20 dakika boyunca 4 ° C.
   Not: Bu enfeksiyon sürecini senkronize yardımcı olur.
5. Parafilm ile plaka kapatılır ve 4 saat% 5 _CO2 içeren bir 37 ° C, nemli inkübatör içinde önceden ısıtılmış alüminyum plaka üzerinde inkübe.
6. 100 ug / ml Gm otomatik plaka yıkayıcı kullanılarak hücre dışı bakteriler etkisiz hale getirmek için ihtiva eden DMEM /% 10 FCS ile yıkama hücreleri (200 ul / göz, taşma yıkama kullanımı).
   Not: Bir taşma yıkama sırasında, otomatik plaka yıkayıcı aynı anda dağıtır ve orta aspire.
7. Giriş deneyi için, hücreler otomatik plaka yıkayıcı kullanılarak 100 ug / ml GM ve 100 ng / ml ATC ihtiva eden DMEM /% 10 FCS ile ikinci kez (200 ul / göz, taşma yıkama kullanın) yıkayın.
8. Parafilm ile plaka kapatılır ve bir% 5 _CO2 ile 37 ° C, nemli inkübatör içinde önceden ısıtılmış alüminyum plaka iade40 saat ya da sırasıyla son nokta deneyi ve giriş deneyi, 4 saat.
9. tespit için, otomatik plaka yıkayıcı (200 ul / göz, taşma yıkama kullanımı) PBS ile yıkayın.
10. pH 7.4 0.2 M HEPES 50 ul% 3.7 paraformaldehid (PFA) otomatik plaka yıkayıcı kullanılarak Exchange PBS.
    Not: Dikkat: yutulduğunda PFA, cilt ile temasında, inhalasyon yoluyla toksik ve.
11. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
12. otomatik plaka yıkayıcı kullanılarak 50 ul PBS ile tespit orta değişimi. Not: Numuneler artık gerekirse BSL3 dışarı alınması için hazır.
    Dikkat: BSL3 tesisi herhangi bir numunenin çıkarılması işleminin risk değerlendirmesi ve doğrulama tabidir ve biyogüvenlik için yürürlükteki kanunlara bağlıdır.

4. Boyama

1. 50 ul PBS ile iki kez hücreleri yıkayın.
2. 10 dakika boyunca 50 ul% 0.1 Triton-X-100 PBS içinde hücrelerin geçirgenliği.
3. WKül hücreler PBS ile üç kez. 1 ug / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) içeren PBS ile 20 ul ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
4. PBS içinde hücreleri üç kez yıkayın ve alüminyum folyo ile ışıktan boyama korur.

5. Görüntüleme

1. görüntü elde etmek için otomatik geniş alan mikroskobu ayarlayın.
   Not: Metaxpress yazılımı kullanılarak bir Molecular Devices Imagexpress mikroskop ayarları aşağıda tarif edilmiştir. uygun donanım özellikleri ve görüntüleme yazılımı ile alternatif 2D geniş alan mikroskopisi cihazları (detaylar için Malzeme / Ekipman Tablo) kullanılabilir.
   1. 10X objektif, kamera binning = 1, kazanç = 1 seçin.
   2. 384 plaka karşılık gelen plaka formatı seçin.
   3. kuyu başına 9 siteleri kazanır.
   4. "Lazer bazlı odak Etkin" ve "plaka ve iyi alt odaklanın" kullanın.
   5. İlk kuyu gibi "Önce iyi" SetSite otofokus için "Tüm siteler" örnek bulma ve.
   6. DAPI kanal kullanın elle Z-Ofset odak için ayarlayın.
   7. El ile Z-Offset tüm diğer kanallar için DAPI seçin.
   8. El ile tüm kanallar düşük aşırı maruz geniş bir dinamik aralık sağlamak için pozlama süresini düzeltin.
      1. otomatik pozlama işlevini kullanarak bir temsilci sitenin bir görüntü kazanır. görüntü plaka boyunca 3-5 siteleri bu pozlama süresini kullanın ve parlak piksel ulaşana kadar tüm siteler üzerinde ~ elle maksimal parlaklık% 80 pozlama süresini ayarlayın.
   9. Görüntü uç nokta deneyi için DAPI ve GFP kanalları kullanarak tam plaka. giriş deneyi için ek RFP kanalı seçin.

6. Otomatik Görüntü Analizi

Not: CellProfiler 2 ¹⁵ hücre segment ve bakteriyel nesnelere görüntü analiz yazılımı olarak kullanılır ve kuv otomatik gerçekleştirmekbelirlenen nesneler içinde EMENTS. Yazılım otomatik olarak belirli bir görüntü analizi görevi gerçekleştirmek için, tüm görüntüleri art arda modülleri çalıştırır bir boru hattına kombine edilebilir bireysel modülleri, görüntü analiz algoritmaları sağlar. protokolünü takip etmek, CellProfiler 2.1.1 veya daha yeni bir sürümünü yükleyin. Ardından, sağlanan boru hattı yüklemek ve modülleri içinde gerekli parametreleri ayarlamak için aşağıdaki talimatları izleyin. tüm boru hatlarının bireysel modüllerin açıklaması Yan Files bulunabilir.

Not: iki ayrı boru hatları, her tahlil için kullanılmıştır. İlk boru hattı analiz öncesi görüntüleri düzeltmek için ikinci boru hattı ile kullanılan bir gölgeleme modeli, hesaplar. Gölgeleme düzeltme mikroskop homojen olmayan bir ışık yolu etkilerini azaltmak için görüntülere uygulanır. İlk boru hattı gölgeleme modeli Computing uzun bir süreçtir, ancak sonuçlar daha yüksek doğruluk olacaktır.

1. Endpoint Deneyi
   1. gölgeleme modeli hesaplamak
      1. "Al" → "Dosyadan Boru Hattı ..." seçeneğini Menü "Dosya" gidin ve sağlanan boru hattı "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007" seçeneğini seçin. , Eski boru hattı dönüştürmek cevap olmadığı sorulduğunda "dönüştürmek" Do not.
      2. "Çıkış" → "Görünüm çıkış ayarları" bölümüne gidin ve görüntüleri ile giriş klasörü ve elde edilen gölgeleme modelleri için bir çıkış klasörü seçin.
      3. Modülünde (1) "LoadImages", görüntü adlarını maç için "bu görüntüler ortak sahip olduğu Metin" adını ayarlayın.
      4. modüllerin hiçbiri önceki modüllerinin yanında tüm göz sembolleri işaretini kaldırarak tam analizini çalışan kendi ekran gösterdiğinden emin olun. Not: Bu önemli ölçüde gereklidir azaltır hesaplama kaynaklarını boru hattı işlenirken.
      5. Basın gölgeleme modeli hesaplamaya başlamak için "Görüntüleri Analiz".
   2. Run Görüntü Analizi
      1. "Al" → "Dosyadan Boru Hattı ..." seçeneğini Menü "Dosya" gidin ve sağlanan boru hattı "BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007" seçeneğini seçin. , Eski boru hattı dönüştürmek cevap olmadığı sorulduğunda "dönüştürmek" Do not.
      2. "Çıkış" → "Görünüm çıkış ayarları" bölümüne gidin ve görüntüleri ile giriş klasörü ve elde edilen e-tablo için bir çıkış klasörü seçin.
      3. modülde (1) "LoadImages", görüntü adlarını maç için "bu görüntüler ortak sahip olduğu Metin" adını ayarlayın.
      4. modül (2) "LoadSingleImage" in, konum ve iki gölgeleme modelleri dosya seçerek 6.1.1 altında hesaplanan gölgeleme modelleri yükleyin.
      5. modülleri (4) - (5) "ImageMath", parametreyi ayarlamak mikroskop kameranın bit derinliğini eşleşen "ilk görüntü çarpın". 8 ve 16 bit içingörüntüleri 12 bit görüntüleri parametresini ayarlamak için, "1.0" için "16.0" parametresini ayarlayın.
      6. Modülde (9) "ImageMath" parametreyi ayarlamak Çekirdeği bastırmak olmadan DAPI boyama Brucella sinyalini bastırır bir değere (0.25 ile başlar) için "ikinci görüntüyü çarpın".
         1. "Testi Başlat Modu" tıklayın, ardından modülün ilgili ikonları tıklayarak duraklama sembolü ve modül (9) için ekran işlevini etkinleştirmek.
            Not: aktif edilirse göz sembolü, bir gözü açık gösterecektir ise duraklama sembol, sarı görünür.
         2. Aktif duraklatma simgesi (9) Modül kadar analiz çalıştırmak için "Çalıştır" a tıklayın. modül, basın "Adım" değerlerini test etmek için.
         3. Yeni açılan görüntüyü sağ tıklayın ve "normalize Log" için "Görüntü kontrastını" olarak ayarlayın. Tekrar tekrar modüle adım (9), parametreyi ayarlamak "ikinci görüntüyü çarpın" ve t üzerinde adımaşırı çıkarma işaret aynı zamanda siyah alanlar sonuç görüntüde en aza indirilmiştir iken Brusella sinyali tamamen bastırılır dek, tekrar modül.
      7. modülde (10) "IdentifyPrimaryObjects", çekirdekler segmente edilmiş ve arka plan göz ardı edilir, böylece yeterince yüksek parametresini "alt eşiğinde bağlı" (sıfır ile başlayan) ayarlayın.
         1. modülü üzerinden modül (10), adım için iyi bir değer belirlemek ve adım 6.1.2.6.1 ve 6.1.2.6.2 açıklandığı gibi giriş görüntüsünü görüntülemek için.
         2. giriş görüntüsünü sağ tıklayın ve histogram görüntüler.
            Not: histogram zirve tipik arka gösterir.
         3. çıkış görüntü görüntülenen çekirdeklerin iyi bir segmentasyon elde edilene kadar arka plan yoğunluğu başlayarak parametre artırmak.
            Not: Arka plan yoğunluğu daha yüksek eşik boş siteler için özellikle önemlidir Ayar.
      8. modülde (15)4; çekirdeğinde açıkça görünür Brucella ile hücreler tutulur, ve tüm diğerleri uzak süzülür böylece FilterObjects "Asgari değer" parametresi ayarlamak "Bu aşamada, çekirdeğin dışında Brucella görmezden..
         1. modül üzerinde iyi bir değer, bir adım belirlemek ve adım 6.1.2.6.1 ve 6.1.2.6.2 açıklandığı gibi çıktı görüntüyü göstermek için. Enfekte olarak tüm hücreleri tanımlayan sıfır, başlayın, ve tutulur çekirdekte açıkça görünür Brucella ile sadece hücreleri kadar küçük adımlarla değerini artırın.
      9. Modülü (16) "FilterObjects" olarak perinucleus açıkça görülebilir Brucella ile hücrelerin tutulur, böylece parametresi "Asgari değer" ayarlamak, ve diğer tüm hücreleri uzak süzülür. Bir önceki modülde olduğu gibi benzer bir yaklaşım kullanın.
      10. Modül (17) "FilterObjects", parametre "Asgari değer" ayarlamak, böylece Vor açıkça görülebilir Brucella ile hücreleronoi hücre gövdesi tutulur, ve diğer tüm hücreler kaldı filtrelenir. Bir önceki modülde olduğu gibi benzer bir yaklaşım kullanın.
          Not: Voronoi hücre gövdesi Voronoi hücre gövdeleri komşu ile hiçbir çakışma ile 25 piksel çekirdeğin radyal uzantısıdır.
      11. Test modundan çıkmak ve modüllerin hiçbiri önceki modüllerinin yanında tüm göz sembolleri işaretini kaldırarak tam analizini çalışan kendi ekran göstermek emin olun.
          Not: Bu önemli ölçüde gereklidir azaltır hesaplama kaynaklarını boru hattı işlenirken.
      12. Basın analizine başlamak için "Görüntüleri Analiz".
      13. Analiz tamamlandığında, analiz plaka boyunca güvenilir çalıştı sağlamak için ortaya çıkan PNG görüntülerin yanı sıra CSV sayfasını inceleyin.
2. giriş Testi
   1. gölgeleme modeli hesaplamak
      1. "Al" → "Dosyadan Boru Hattı ..." seçeneğini Menü "Dosya" gidin ve sağlamak seçind boru hattı "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". , Eski boru hattı dönüştürmek cevap olmadığı sorulduğunda "dönüştürmek" Do not.
      2. "Çıkış" → "Görünüm çıkış ayarları" bölümüne gidin ve görüntüleri ile giriş klasörü ve elde edilen gölgeleme modelleri için bir çıkış klasörü seçin.
      3. modülde (1) "LoadImages", görüntü adlarını maç için "bu görüntüler ortak sahip olduğu Metin" adını ayarlayın.
      4. modüllerin hiçbiri önceki modüllerinin yanında tüm göz sembolleri işaretini kaldırarak tam analizini çalışan kendi ekran gösterdiğinden emin olun.
         Not: Bu önemli ölçüde gereklidir azaltır hesaplama kaynaklarını boru hattı işlenirken.
      5. Basın gölgeleme modeli hesaplamaya başlamak için "Görüntüleri Analiz".
   2. Run Görüntü Analizi
      1. "Al" → "Dosyadan Boru Hattı ..." seçeneğini Menü "Dosya" gidin ve seçin.İkinciEd boru hattı "BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007". , Eski boru hattı dönüştürmek cevap olmadığı sorulduğunda "dönüştürmek" Do not.
      2. "Çıkış" → "Görünüm çıkış ayarları" bölümüne gidin ve görüntüleri ile giriş klasörü ve elde edilen e-tablo için bir çıkış klasörü seçin.
      3. modülde (1) "LoadImages", görüntü adlarını maç için "bu görüntüler ortak sahip olduğu Metin" adını ayarlayın.
      4. modül (2) "LoadSingleImage" in, konum ve iki gölgeleme modelleri dosya seçerek 6.2.1 altında hesaplanan gölgeleme modelleri yükleyin.
      5. modülleri (4) - (5) "ImageMath", parametreyi ayarlamak mikroskop kameranın bit derinliğini eşleşen "ilk görüntü çarpın". 8 ve 16 bit görüntüleri 12 bit görüntü parametre için "1.0", set İçin "16.0" parametresini ayarlayın.
      6. modülde (6) "IdentifyPrimaryObjects", parametre "Lo setwer sadece çekirdekleri segmente edilmiş ve arka plan göz ardı edilir yeterince yüksek "eşiğinde bağlı.
         1. modülü (6), modül üzerinde adım için iyi bir değer belirlemek ve adım 6.1.2.6.1 ve 6.1.2.6.2 açıklandığı gibi giriş görüntüsünü görüntülemek için.
         2. giriş görüntüsünü sağ tıklayın ve histogram görüntüler.
            Not: histogram zirve tipik arka gösterir.
         3. çıkış görüntü görüntülenen çekirdeklerin iyi bir segmentasyon elde edilene kadar arka plan yoğunluğu başlayarak parametre artırmak.
            Not: arka plan üzerinde eşik ayarı boş siteler için önemlidir.
      7. Modülde (8) "IdentifyPrimaryObjects", sadece Brucella segmente edilmiş ve arka plan göz ardı edilir yeterince yüksek parametresini "alt eşiğinde bağlı" olarak ayarlayın.
         1. modül (8), modül üzerinde adım için iyi bir değer belirlemek ve adım 6.1.2.6.1 ve 6.1.2.6.2 açıklandığı gibi giriş görüntüsünü görüntülemek için.
         2. giriş görüntüsünü sağ tıklayın ve histogram görüntüler.
            Not: histogram zirve tipik arka gösterir.
         3. Çıkış görüntü görüntülenen Brucella iyi segmentasyon elde edilene kadar arka plan yoğunluğu başlayarak parametre artırmak.
            Not: arka plan üzerinde eşik ayarı boş siteler için önemlidir.
      8. Modülü (11) "FilterObjects", parametre "Asgari değer" o arka plan ve eserler uzakta süzülür ve sadece Brucella kolonileri tutulur şekilde ayarlayın.
         1. modül üzerinde iyi bir değer, bir adım belirlemek ve adım 6.1.2.6.1 ve 6.1.2.6.2 açıklandığı gibi çıktı görüntüyü göstermek için. Sadece Brucella nesneleri tutulur kadar artış 6.2.2.7 ve adım adım seçilen değer ile başlayın.
      9. Test modundan çıkmak ve önceki unche tam analiz çalıştıran modüllerin hiçbiri kendi görüntüsünü göstermek emin olunmodüllerin yanında tüm göz sembolleri cking.
         Not: Bu önemli ölçüde gereklidir azaltır hesaplama kaynaklarını boru hattı işlenirken.
      10. Basın analizine başlamak için "Görüntüleri Analiz".
      11. Analiz tamamlandığında, analiz plaka boyunca iyi çalıştı emin olmak için ortaya çıkan PNG görüntülerin yanı sıra CSV sayfasını inceleyin.

7. Enfeksiyon Puanlama

Not: hücre canlılığı üzerinde önemli bir etkiye sahip siRNA'lar dikkatle düşünülmesi gerekir, bu yanlış pozitif keşifler teşvik beri. Değiştirilmiş bir hücre sayısı, gerçek İçişleri Bakanlığı etkiler ve gerekli genlerin hedef patojen enfeksiyon pleiotropik etkileri olabilir. SiRNA'lar tarafından eksik tükenmesi temel genlerin çalışması için izin verirken, bu tür hedefler alternatif yöntemler (örneğin, ilaç parazit) ana faktörler olarak rollerini doğrulayacak tarafından onaylanmış olması varenfeksiyon sırasında.

1. uç nokta deneyi
   1. Adım 6.1.2.12 oluşturulan CSV sayfasını açın ve enfekte hücrelerin sayısını (CellProfiler okuma: "Count_InfectedCells") bölünmesi ile de enfeksiyon oranı başına hesaplamak hücrelerin toplam sayısı (: "CountNuclei" CellProfiler okuma) tarafından. kuyu başına birden fazla site görüntülü varsa, ilk enfekte hücreleri başına kuyu sayısı ve hücrelerin başına iyi toplam sayısını inşa etmek, her iyi için tüm siteleri özetlemek.
   2. Plakalar yeterli olmayan hit siRNA'lar içeriyorsa plaka-plaka farklılıkları hesaba katmak Z puanlama normalleştirme gerçekleştirin. Tam kütüphanelerinin tarandığı durumunda plaka başına olmayan isabet siRNA'lar yeterli sayıda varsayalım.
      
2. giriş Testi
   1. (CellProfiler okuma aşamasında 6.2.2.10 oluşturulan CSV sayfasını açın ve enfekte olmuş hücrelerin sayısına bölünmesiyle de enfeksiyon oranı başına hesaplamak: "Count_InfectedCeLLS "() toplam hücre sayısına göre CellProfiler okuma". oyuk başına birden fazla site görüntülenmiştir var CountNuclei "), ilk olarak bir başı da enfekte hücrelerin sayısını ve inşa etmek için, her bir seyahati sitesi özetler başına oyuklu Toplam hücre sayısı.
   2. enfekte hücrelerin bakteri yükünü ölçmek için, enfekte hücre başına hücre içi bakteriler tarafından işgal ortalama alanını tahmin ediyoruz. Bu sitedeki enfekte hücrelerin sayısına göre: Bu amaçla, hücre ile üst üste, tüm hücre içi bakteri entegre alanını ( "AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells" CellProfiler saati) bölün. eserler hesaba katılması için, iyi okuma olarak bu okuma tüm sitelerin medyan kullanın.
      Not: Bu deney Brucella enfeksiyonu ile ilişkili genlerin büyük bir sayısını içeren bir izleme deneyi olarak kullanılırsa, Z skoru normalleştirme geçerli değildir. Bunun yerine, plaka-plaka değişimi dikkate almak amacıyla bir referans olarak sahte kuyuları kullanarak normalleşme gerçekleştirin.

Sonuçlar

Şekil 1A, otomatik olarak uç nokta deneyi enfekte hücreleri tanımlamak için kullanılan görüntü analizinin bir örneği göstermektedir. DAPI ile boyanmış HeLa hücrelerin çekirdekleri tespit edildi, 25 piksel çekirdeğin uzantısı çekirdeğini çevreleyen 8 piksel genişliğinde bir peri-çekirdek ve bir Voronoi hücre gövdesi hesaplandı. bakteriler esas olarak peri-nükleer bir alanda prolifere için, hücrenin, bu alanda GFP yoğunluğu enfekte olan ve...

Tartışmalar

Bacterial pathogens have evolved numerous strategies to manipulate eukaryotic host cells to their benefit. Pathogens causing acute infections often show rapid proliferation which is accompanied by significant alarming of the immune system and loss of viability of infected cells. In contrast, Brucella and other pathogens that cause chronic infections manage to establish long-lasting interactions within host cells. Therefore, bacteria need to fine tune host cell functions to their benefit without disrupting cellul...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptic Soy Agar (TSA)	BD	236950
Tryptic Soy Broth (TSB)	Fluka	22092
Kanamycin sulfate	Sigma-Aldrich	60615
Skim milk
250 ml screw cap bottle	Corning	8396
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
Fetal Calf Serum (FCS)	Gibco	10270	Heat-inactivated
Trypsin-EDTA (0.5%)	Gibco	15400-054	10x stock solution, dilute 1:10 in PBS
Scepte 2.0 Cell Counter	Merck Milipore	PHCC20060	Alternative cell counting devices can be used
Greiner CELLSTAR 384-well plate	Sigma-Aldrich	M2062
Peelable aluminum foil	Costar	6570
Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser"	Thermo Scientific	5840150	Alternative reagent dispenser can be used.
Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778-150
Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16"	BioTek	ELX5016	This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used.
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	37919	100 μg/ml solution in 100% ethanol is kept at -20 °C protected from light in aluminum-foil
PBS	Gibco	20012
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20 °C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI	Roche	10236276001
Scrambled siRNA	Dharmacon	D-001810-10
Kif11 siRNA	Dharmacon	L-003317-00
ARPC3 siRNA	Dharmacon	L-005284-00
Brucella abortus 2308
pJC43 (apHT::GFP)			Celli et al.12
pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP)			Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector.
Primer prAC090	Sigma-Aldrich		TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC
Primer prAC092	Sigma-Aldrich		TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC
HeLa CCL-2	ATCC	CCL-2
ImageXpress Micro	Molecular Devices	IXM IMAGING MSCOPE	Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed.
High-Speed Laser Auto-Focus	Molecular Devices	1-2300-1037
CFI Super Fluor 10X objective	Nikon	MRF00100	N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Prism: 10X, Spring loaded
Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera	Molecular Devices	1-2300-1060	1,392 x 1,040 imaging pixels, 6.45 x 6.45 µm pixels, 12 bits digitization
MetaXpress software	Molecular Devices	9500-0100
LUI-Spectra-X-7	Lumencor	SPECTRA X V-XXX-YZ	Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP)
Single Band Exciter for DAPI	Semrock	FF01-377/50-25
Single Band Emitter for DAPI	Semrock	FF02-447/60-25
Single Band Dichroic for DAPI	Semrock	FF409-Di03-25x36
Single Band Exciter for GFP	Semrock	FF02-472/30-25
Single Band Emitter for GFP	Semrock	FF01-520/35-25
Single Band Dichroic for GFP	Semrock	FF495-Di03-25x36
Single Band Exciter for RFP	Semrock	FF01-562/40-25
Single Band Emitter for RFP	Semrock	FF01-624/40-25
Single Band Dichroic for RFP	Semrock	FF593-Di03-25x36