Bir Yüksek içerik<em&gt; İn Vitro</em&gt; Pankreas Adacık β-hücre çoğaltma Keşif Platformu

Özet

diyabet araştırma alanı için kritik zorluklar adacık β-hücre çoğalmasını düzenleyen ve β-hücre yenilenmesini teşvik etmek için yöntemler geliştirmek moleküler mekanizmalarını anlamak için vardır. Burada yüksek içeriği tarama yöntemi belirlemek ve küçük moleküllerin β-hücresi replikasyon teşvik aktivitesi sunulmuştur değerlendirmek.

Özet

Loss of insulin-producing β-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet β-cells remains an attractive strategy. β-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain β-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify β-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a β-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on β-cells and the molecular mechanisms that regulate β-cell growth.

Giriş

Diyabet bozulmuş glikoz dengesinin ortak uç noktasını paylaşan bozuklukların bir koleksiyon kapsar. Diyabet alt tiplerinin patojenik mekanizma belirgin olmasına rağmen, azalmış β-hücresi kütlesi, yani insülin üretim kapasitesi ^1,2 kaybı sonucu paylaşır. Halen, diyabet tedavi stratejileri eksojen insülin, insülin üretimi veya insülin duyarlılığı geliştirme farmakolojik stimülasyon kronik idaresi itimat ve nadiren, pankreas adacık ya da tüm pankreas ^3,4 nakli. Ne yazık ki, bu stratejilerin başarısı kısa sürelidir ve / veya yeterince endojen insülin üretiminin işlevini özetlemek için başarısız olur. β-hücre yenilenmesini teşvik etmek için bir yöntem geliştirme programı olmasına rağmen, böyle bir yaklaşım var. Sonuç olarak, büyük bir şeker araştırma hedefi, yeni bir β-hücrelerinin üretilmesi için ya da endojen β-hücresi kütlesi ⁵ genişletmek için yöntemler geliştirmektir . Bu embriyonik kök hücreleri gibi yenilenebilir kaynaklardan β-hücresi rejenerasyonu ilerlemektedir, ancak, güvenlik ve etkinlik ilgilidir olgun β-hücrelerinin genişlemesi, bir öncelik ^6,7 dahil olmak üzere alternatif stratejileri, takip edin. Önemli olarak, in vivo olarak, yeni β-hücrelerinin baskın kaynağı önceden var olan β-hücrelerinin yerine özel bir progenitör hücreler ^8,9 olan. β-hücrelerinin, sınırlı çoğaltma kapasitesine, β-hücresi kütlesindeki küçük bir artış sahip gibi görünmektedir, ancak (~% 30) pek çok diyabet hastası glukoz homeostazisin yeniden için yeterli olabilir. Ayrıca, β-hücresi kütlesi yerinde farmakolojik stimülasyon potansiyel olarak pahalı olmayan ve ölçeklenebilir bir tedavi stratejisidir. Burada β-hücresi büyümesini teşvik küçük molekülleri tanımlamak ve ayırt etmek için yüksek içerik tarama yöntemi sunulmaktadır.

In vitro deney yöntemleri çeşitli gen ürünlerini ve / veya molekülleri tha tanımlamak için kullanılabilirt birincil β-hücre çoğalmasını teşvik. Β-hücre replikasyonu indüksiyonunu ölçen ilk ^çabalar, belirli bir tedavi koşullarında ¹⁰ yanıt olarak aldehit tiyonin veya insülin lekeli nüfus içinde ^[3H] timidin eklenmesini, BrdU dahil ve mitotik organları ölçmek için, fetal kemirgen pankreası kültürü ya da dokunulmamış izole adacığı kültürleri kullanılan ^11. Bunlar in vitro yaklaşımlar ve yakın varyantları birkaç sınırlamaları vardır. Tanınmış eksiklikler olgun β-hücrelerinin aksine, yüksek bazal β-hücre çoğaltma oranı görüntüleyebilir ve farklı bir şekilde ¹² düzenlenen büyümesi, fetal hücrelerin (1) kullanımını içerir; (2) β-hücre çoğaltma olaylarının deneyci bağımlı yargı öznel doğası; (3) β-hücre çoğaltma olaylarının deneyci bağımlı sayım emek ve zaman yoğun doğa deneysel verim geciktirir; Nükleer kuruluş / leke / görünüm (4) kullanımı bile çoğaltma tanımlamak içints ve β-hücreleri belirlemek için bir üst üste binmeyen sitoplazmik leke hücreleri olan B için yakın olmayan β-hücre replikasyonu etkinlikleri yanlış atıf yol açar.

Daha yakın zamanda, olgun primer β-hücrelerinin β-hücresi çoğaltma ^13-16 aşırı ifade transgenin etkisini hem de gen ürünü ya da bileşim tedavisi değerlendirmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu çalışmalar, çoğaltma etkinlikleri, β-hücresi tanımlama ve / veya hacmini sınırlayan bağımlı adımlar, örneğin, hücre ya da sağlam adacık bir kayma oyuklu kaplama için sitoplazmik staining- veya spesifik olmayan yöntemlerin ilgili sayımı dayanmıştır parafin gömme ve işleme ^17. Özellikle, burada sunulan birine benzer bir görüntü tabanlı insan β-hücre çoğaltma tarama yöntemi, ¹⁸ yayımlanmıştır; FEA Ancak, bu testin başarılı bir kullanımı ortaya konmamıştır ve birinci tarama için insan adacık kullanımı genel olarak olmayabilirsible.

replikasyon teşvik maddelerin belirlenmesi için alternatif bir strateji, β-hücresi çizgilerinin büyümesi indüksiyonunu değerlendirmek için. İlk çabaları dönüştürülmüş β-hücre hatları gibi min6 hücreleri ya da INS 832/13 hücreleri ^14,19-21 kullanılır. Ancak, bu hücre hatları kontrolsüz büyüme gösteren ve iyi diferansiye β-hücreleri ²² az benzerlik taşımaktadır. Sonuç olarak, büyüme-indüksiyon kapasitesi, en az belirsiz alaka ve recapitulate bazen zordur. Hücre satırı tabanlı tarama için geliştirilmiş bir strateji tetrasiklin (doksisiklin) yokluğunda tutuklanan büyüme bağımlı SV40 T antijeni ifade ^23,24 olan hücreler "geri dönülebilir dönüştürülmüş" kullanmaktadır. Ancak, bu hücrelerin doksisiklin kaldırılması üzerine "normal" bir β-hücre benzeri duruma dönmek belirsizdir. Ne yazık ki, bu hücrelerin kullanımı derhal kullanıma sahip görünmüyor genelleştirilmiş büyüme destekleyici bileşikler vermiştir24. Genel olarak, en az spontan replikasyon aktivitesi gösteren bir hücre tipi büyüme düzenleme çalışma hücre çizgilerinin kullanımı kısıtlı kullanımı olabilir.

Burada sunulan β-hücre çoğaltma tarama platformu mümkün olduğu ölçüde, soy-kısıtlı büyüme destekleyici faaliyetlerin tanımlanmasını sağlamak için karma hücre tipi bileşiminin adacık hücre kültürleri, multi canlılarda büyüme yönetmelikte korumak için olgun birincil sıçan β-hücreleri kullanır eh verimlilik ve otomatik analiz maksimize etmek biçimlendirme önyargı ortadan kaldırmak ve verimi kolaylaştırmak için. Bu platformun başarılı kullanımı β-hücre çoğaltma ^25,26 teşvik birkaç bileşiklerin belirlenmesini sağladı. Ayrıca, tahlil β-hücre çoğaltma moleküler regülasyonu içine mekanistik anlayış sağlamak için yapı-aktivite ilişkisi çalışmaları ve kimyasal epistasi deneyleri için kullanılır olmuştur. sunulan platformu başarıyla fo uyarlanmıştırβ-hücre çoğalmasının r lentiviral RNAi tabanlı soruşturma ²⁵ yolaklarıyla. tahlilinde sınırlamaları (birincil hücre kullanımının) ölçeklenebilirlik Kısıtlı'dır yerine antikor bazlı görüntüleme ve primer adacık kullanım, kullanım ile bağlantılı (deney insan doku adacığı çalışmaları için adapte edebilir) insan doku adacığı hücrelerinden, giderleri daha kemirgen kullanımı görüntü elde etme ve analiz yeteneği ile otomatik mikroskop doluluk durumuna bağlı olarak otomatik görüntü toplama ve bağımlılığını kolaylaştırmak için dağınık adacıklar (bozulmuş adacık mimarisi). Gen ürünlerinin ya da in situ β-hücresi rejenerasyonunu teşvik eden bileşiklerin belirlenmesi için basit, in vivo bir tarama yöntemi ideal olacaktır, ancak bu platform yapılmamış ²⁷ kullanılamaz. Sonuç olarak, açıklanan platformu β-hücre çoğalmasının en yönlerini araştıran ilgilenen araştırmacı için uygundur.

Protokol

Bu protokol, Stanford Üniversitesi Tıp Okulu Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. adacık hücre replikasyonu değerlendirilmesi için 384 oyuklu plakanın 228 kuyu üretilmesi için yeterli olan - (9 haftalık 8) erkek Sprague Dawley sıçanlarında, 300 g - açıklanan protokol altı 250 doku adacığı izolasyonu ölçeklenir.

1. Malzeme Hazırlama

1. 15 cm'lik bir doku kültürü kabı ²⁸ 3 gün birleştiği noktada muhafaza 804G fare mesane kanseri hücre koşullu ortam (RPMI-1640 20 mi) toplayarak doku adacığı izolasyonu başlatmadan önce kaplama ortamı hazırlar. Steril filtre ve mağaza (-20 ° C), daha sonra kullanılmak üzere koşullu ortam.
2. cerrahi aletleri sterilize (bir 12 cm dişli doku forseps, bir 11.5 cm ince makas, bir 14.5 cm cerrahi makas, iki 16 cm kavisli forseps, bir 12 cm kavisli hemostat, bir 12 cm neşter sapı) ve init önce bir 30 gözlü doku elekadacık izolasyon iating.
3. Bir% 60 eritilerek pankreatik sindirim çözeltisi hazırlayın: Saflaştırılmış sınıf I% 40 karışımı: sınıf II kollajenazlar (300.000 toplam kolajenaz aktivitesi - 400.000 birim), kalsiyum ve magnezyum ile desteklenmiş 1 x Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS), 60 ml. Yük buz üzerinde 1 "22 G iğne ve yerine 10 ml şırınga (altı) olarak pankreas sindirim tamponu, 10 ml.
   Not: sindirim çözeltisi, 10 ml sıçan başına enjekte edilmiştir. buna göre Scale.
4. ketamin 1.3 ml (100 mg / ml), ksilazin 0.2 ml (100 mg / ml) ve 3 mL PBS karıştırılarak bir havalandırılmış başlığı içinde anestezi kokteyl 4.5 ml hazırlayın. adacık izolasyonu başlatılması 1 saat içinde anestezik kokteyl hazırlayın.
5. HBSS 500 ml yeni doğmuş dana serumu, 25 ml ekleyerek yıkama tamponu hazırlayın. daha sonra kullanmak için buz üzerinde yıkama tamponu yerleştirin.
6. Düşük glukoz Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM), 5, 500 ml adacık ortamın 1 şişesi hazırlayın0 ml cenin sığır serumu (FBS), penisilin 5000 ünite / ml streptomisin 5.000 ug / ml olmuştur.
7. % 2 FBS, 2 mM glutamin, 5 mM glukoz, penisilin 5000 ünite / ml streptomisin 5.000 ug / ml işlevsellik / canlılığı çözeltisi (500 mi) doku adacığı fonksiyonu orta hazırlayın. Daha sonra kullanmak üzere adacık fonksiyonu medya (4 ° C) saklayın.
8. 1X fosfat tamponlu salin içinde 37.38 ml (PBS) 2.5 mi eşek serumu ve 0.12 ml Triton X-100 eklenmesi ile bloke edici tampon 40 mi hazırlayın. daha sonra kullanmak için mağazası bloke tamponu (4 ° C).
9. protokolü başlamadan önce gerekli antikorları edinin.
   Not: PDX-1 (TRITC), Ki-67 (FITC) eş boyama primer β-hücresi çoğaltma taranması için kullanılır. nükleer (DAPI), PDX (Cy5) ve KI-67 (FITC) boyama ile birlikte, soya özel çoğaltma analiz edilmesi için ilave hücre kimliği belirteçleri (TRITC insülin, glukagon, vimentin ya da somatostatin) için immünofloresan boyama yapar. alternatif temsilcisilication belirteçler, örneğin, PCNA, de kullanılabilir.
10. dört nüsha olarak gerçekleştirilen her tedavi koşulu ile bir 228-kuyu tedavi planı hazırlayın. (: 666 seyreltme DMSO 1) kuyular pozitif-(5-iyodotübersidindir [1 uM] veya dipiridamol [15 mM]) ve araç kontrolü ekleyin.

Pankreas 2. perfüzyon

1. seyreltilmiş anestezik kokteyl çözeltisi (0.30 mL / 100 g vücut ağırlığı) IP enjeksiyonu ile sıçanlarda anestezisi. Sıçan tam anestezi ve ağrılı uyarılara tepkisiz sonra, servikal dislokasyon gerçekleştirin.
2. kağıt havlu bir yığın yatar pozisyon (kranial-kaudal yönde) ötenazi sıçan yerleştirin ve% 70 etanol ile karın bölgesini püskürtün.
3. U-kesi (kasık bölgesinde baz) ile karın boşluğuna açın ve karın boşluğuna maruz göğüs üzerinde rostral yönde cildi geri çekin.
4. Dikkatle, kavisli bir forseps iki çift kullanarak duodenum kapmak ortak b duodenum girdisini bulunile kanal (Oddi sfinkter) ve kavisli hemostatla papillada duodenum açılış kelepçe.
5. koledok papilla kelepçe ve kavisli bir forseps kullanarak karaciğere yakın safra kanalı kapmak için kullanılan kavisli hemostat kaldırın. yalıtmak ve safra kanalı ortaya çıkarmak için kavisli bir forseps ile künt diseksiyon kullanın.
6. Baş proksimal ve ayak distal ile sıçan yerleştirin.
7. Bir pankreas sindirim çözeltisi ile kistik ve hepatik kanalların birleştiği ortak safra kanalı da (MİA) ya da sadece uzak cannulate 10 ml şırınga -yüklü ve yavaş yavaş pankreas sindirim çözeltisi 10 ml enjekte edilir. enjekte ederken, bir neşter sapı ile CBD destek. kanal ve pankreas şişirmek için başarısız olursa iğne yerleştirin.
8. inen kolon, bağırsak, mide ve dalak ayırmak için kavisli bir forseps ve ince makas kullanarak şişirilmiş pankreas kaldırın. 5 ml içeren 50 ml'lik bir tüp içinde buz üzerinde, şişirilmiş pankreas yerleştirin pankreas sindirim çözüm.
   Not: Maksimum adacık verimi için, her biri 50 mi sindirim tüp içinde 30 dakika ve yerine, sadece 1 veya 2 pankreası içindeki tüm pancreata toplar.

Pankreas 3. Ayrışma

1. Bir kez tüm pankreata, toplanan 15 dakika süreyle 37 ° C su banyosu içine sindirim tüpü yerleştirmek edilir. Tüpleri yavaşça her 3 dk girdap.
2. 15 dakika sonra, şiddetle boruları (dikey) 10 kez sallayın ve soğuk yıkama tamponu 10 ml ekleyin. Şiddetle boruları ek 5 kez sallayın ve buz üzerine yerleştirin.
3. Tüpler, 5 kez ters yüz edilerek gibi soğuk yıkama tamponu ile bir karışımı, 50 ml sindirim tüpü doldurmak.
4. 1 dakika boyunca 4 ° C'de 97 x g'de tüpler santrifüj ve süpernatant dökün. pelet haline doku çıkarmak için dikkatli olun.
5. 25 ml yıkama tamponu ekleyin ve hafifçe karıştırın doku yeniden askıya. Tekrarlayın iki kez daha 3.4 ve 3.5 adımları tekrarlayın.
6. Bir st üzerinde 30 gözlü doku elek yerleştirin250 ml beher erile ve elek üzerine doku süspansiyonu dökün. Yıkama tamponu ilave 20 ml ile sindirim borusunu yıkayın ve örgü üzerine dökün. sindirilmemiş pankreas ve yağ dokuları bu aşamada çıkarılır.
7. İki yeni bir 50 ml'lik tüplere süzüldü malzeme dökün ve 4 ° C'de 1 dakika için 97 x g'de iplik doku topağı. Durusu süpernatant ve invert tüpleri aşırı tampon süzün.

Adacık 4. saflaştırılması

1. tanelenmiş pankreas dokusu soğuk polisükroz / sodyum Diatrizoate çözeltisinin 20 ml (1.119 ug / ml yoğunlukta) eklenir. Homojen hafifçe yukarı pipetleme ve beş kat aşağı her tüpün içeriğini yeniden askıya.
2. Yavaşça 10 ml HBSS ile polisükroz / sodyum diatrizoate çözümü kaplaması. yavaş yavaş tüp duvarı boyunca HBSS ekleyerek keskin bir sıvı arayüzü koruyun.
3. Yavaş hızlanma ve hiçbir fren 15 dakika (4 ° C) 560 xg'de sindirilmiş pancreata santrifüj.
4. CoTaze 50 ml tüpler içinde 10 ml pipet ve yer adacıklar kullanarak arayüzü adacık katmanı llect. Bu aşamada adacıklar havuz yok.
5. 4 ° C'de 140 x g'de 1 dakika boyunca, her bir 50 ml tüp ve spin yıkama tamponu 40 ml ekleyin.
6. Süpernatantı dökün ve boruları birkaç kez ters yüz edilerek yıkama tamponu 50 ml toplanmış adacıklar yeniden askıya. Bir pelet adacıklar toplamak için 4 ° C'de 97 x g'de 1 dakika için tüpler santrifüjleyin.
7. Yıkama tamponu dökün ve yıkama tekrarlayın. doku kültürü kaputu içine adacıklar getirin ve süpernatant aspire.
8. Adacık orta 6 ml adacıkların her tüp yeniden askıya.
9. Altı oyuklu doku kültürü kabına her bir 50 ml tüp adacıklar aktarın. Kuyunun ortasına adacıklar toplamak ve bir mikroskop altında adacık kalite ve saflıkta gözlemlemek için 6-çukurlu bir tabak döndürülür.
10. El ile 1 ml pipet kullanarak adacıklar toplamak ve bitişik içine aldı adacıklar transferide doku adacığı ortam 6 ml ihtiva etmektedir. Tekrarlayın adacık dönen ve 90> kadar% saflık toplama elde edilir.
11. Adacık ortamı 20 ml içeren 10 cm'lik bir doku kültürü kabı saflaştırılmıştır adacıklar aktarın.
12. Bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde yer adacıklar (37 ° C,% 5 _CO2), gece boyunca (Şekil 1A).
13. Adacık hücrelerinin, her kat de 804G koşullu ortamın 40 ul 384 gözlü bir levhanın gözleri kaplama hazırlanmasında. bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde bir gece boyunca inkübe edin.

5. Dağılma ve adacık hücresi Kaplama

1. Ertesi gün, nazikçe hücre kazıyıcı ile 10 cm çanak adacıklar ayırmak ve 50 ml'lik bir tüp içine adacıklar aktarın.
2. Oda sıcaklığında 22 xg'de 1 dakika için santrifüjleme ile adacıklar Pelet. süpernatant aspire.
3. ılık PBS, 20 ml adacıklar yıkanır ve yukarıdaki gibi süzün.
4. % 0.25 tripsin adacıklar (sıçan pankreas başına 150 ul yeniden askıya10 dakika için 37 ° C 'de) ile inkübe edilir. Pipet adacıklar ve aşağı 10 kat inkübasyondan 5 ve 10 dakika sonra 1 mL pipet kullanılarak.
5. 10 dakika sonra, tam bir sindirim sağlamak ve bir hemositometre kullanılarak adacık hücreleri saymak için mikroskop altında tripsinize adacık 20 ul örnek değerlendirir. 5 dakika ve pipet yukarı ve aşağı 10 kez daha - sindirilmemiş adacıklar kalırsa, ek 3 inkübasyon devam ediyor. Gerektiği kadar tekrarlayın.
   Not: Tipik verim ~ 125.000 olan - sıçan başına 150.000 adacık hücreleri.
6. inkübatör 804G klimalı ortam kaplı 384-plaka çıkarın ve bir 12-iyi manifoldu aspiratörü kullanarak ortamı çıkarın.
7. Adacık fonksiyonu ortamı içinde ml başına 45.000 hücre yoğunluğunda doku adacığı hücre askıya alma ve çok kanallı bir pipet (Şekil 1B) ile oyuk başına 70 ul (3.150 hücre) plaka.
   Not: Dış kuyularda bulunan β-hücrelerinin N ve sütunlar 4 plaka kullanım satırlar C çevresine doğru göç eğilimi nedeniyle21 6 sıçanlardan izole edilen adacık hücreleri ile 228 kuyu plaka.
8. hücre yapışmasını sağlamak için 48 saat boyunca doku kültür inkübatörü içinde plaka koyun.

6. Adacık hücre Kültür Tedavi Tespit ve Boyama

1. Adacık fonksiyonu ortamında 2x konsantrasyonda (muamele koşulları dört kez yapılır) araç ve bileşik 200 ul hazırlayın. Çok-çukurlu pipetleme kolaylaştırmak için bir steril 96 oyuklu plaka içinde bileşikleri düzenlemek.
2. Dikkatli bir şekilde 12 oyuklu manifoldu aspiratör adacık orta kaldırmak ve 12 oyuklu bir pipet kullanarak doku adacığı fonksiyonu ortamında (35 ul / oyuk) ile değiştirin. Çıkarın ve (Şekil 1C) kuruma riskini sınırlamak için bir defada bir satır ortamı değiştirin.
3. 35 ul / transfer kuyunun 2x bileşik çözeltileri ile muamele başlatın. 48 saat tedavi süresi için inkübatör plaka dönün.
4. Tedavinin 48 saat sonra, plakayı baş aşağı çevirerek işleme ortamı süzün.
5. Yavaşça 1 x PBS (1 dakika) oyuk başına 50 ul adacık hücrelerinin yıkayın. Çok kanallı bir pipet kullanılarak PBS ekleyin.
6. PBS süzün ve 1 x PBS içinde seyreltilmiş, soğuk% 4 paraformaldehit (PFA), oyuk başına 50 ul ilave edilerek hücrelerin tespit. 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe hücreleri.
7. PFA çıkması için plakayı baş aşağı çevrilerek ve yavaşça yukarıdaki gibi göz başına PBS 60 ul ekleyerek hücreleri üç kez (her biri 5 dakika) yıkanır.
8. formamid 14.25 ml ve 0.75 mL, 0.15 M sodyum sitrat (pH 6) karıştırılarak 15 mi antijen alma çözeltisi hazırlayın. Kullanmadan önce hemen antijen alma çözüm olun.
9. plakayı baş aşağı çevirerek oyuklardan çıkarın PBS ve her bir oyuğa 60 ul, antijen alma çözeltisi ilave edilir. 45 dakika süre ile 70 ° C su banyosu içinde plaka ısıtılır. Çok-çukurlu plaka kırışmayı önlemek için Bu kuluçka sırasında plaka üzerine bir ısıtıcı blok yerleştirin.
   Not: Su yarım yukarı plaka etek olmalıdır; Plaka batık edilmemelidir.
10. Su banyosu plaka çıkarın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca soğumaya bırakın. plaka görsel muayene ile çarpık olmadığından emin olun.
11. 1x PBS üç kez oyuk başına 60 ul (her biri 5 dakika) ile hücrelerin yıkayın. Çok kanallı bir pipet ile PBS ilave edin ve plakayı baş aşağı çevirerek PBS süzün.
12. Bloke edici tamponun oyuk başına 40 ul ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmek çok kanallı bir pipet kullanın. plakayı baş aşağı ve aktarma yoluyla Bloklama tamponunu çıkarın.
13. ve keçi anti-insan PDX-1 (1: 100): Fare Ki-67 (200 1) anti-insan 40 ul ekle her oyuğa blokaj tamponunda seyreltilmiş antikor ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
14. Bir sonraki gün, yukarıda tarif edildiği gibi üç kez (her biri 5 dakika), anti-vücut çözeltisi süzün ve 1 x PBS ile yıkama hücreleri. PBS Durusu.
15. bloke edici tampon içinde (200 1) biyotinile edilmiş eşek anti-fare IgG ve rodamin-konjüge edilmiş eşek anti-keçi IgG seyreltilmiş oyuk başına 40 ul ekle. 1 saat süre ile inkübeoda sıcaklığında.
16. 1x PBS ile üç kez, her biri 5 dakika hücreleri yıkayın. Her kuyucuğa Flüoresanla Birleşik streptavidin (bloke edici tampon içinde 400 1) ile seyreltildi ve 40 ul ekle. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkalayın.
17. 1x PBS ile üç kez, her biri 5 dakika hücreleri yıkayın. DAPI oyuk (bloklama tamponu içinde 300 nM) başına 40 ul ilave edilir ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
18. 1x PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve PBS 1x 40 ul hücreleri bırakın. Plaka hemen analiz için hazırdır.

7. β-hücre çoğaltma Analizi

Not: Bir deney protokolü β-hücre çoğaltma ölçmek için kullanılan yüksek içerik tarama mikroskop için oluşturulmalıdır. En basit bileşim, bu protokol, bir kimlik markör β-hücrelerinin tanımlamak için kullanılan bir iki-renkli deneyidir (PDX-1 ⁺ p-hücreleri) ve bir çoğaltma işaret (Ki-67), hücre bölünmesi olayları tanımlamak için kullanılır.

1. ORTALAMA dayanan nesne (β-hücreleri) belirlenmesiBir β-hücresi çekirdeğine (Şekil 2A) beklenen piksel alanı içinde: (genişlik <1.6 uzunluğu) yaklaşık daire içinde PDX-1 boyama (549 nm filtre) e flüoresans şiddeti.
2. Sonraki, PDX-1 ⁺ alanda (Şekil 2B) içinde ortalama floresan yoğunluğu (485 nm filtresi) dayalı çoğaltma olayları (Ki-67-pozitifliği) tanımlamak için ayarları oluşturmak.
   Not: Pozlama süreleri görüntüler arasında piksel yoğunluğu karşılaştırmalar izin sabitlenmelidir. Deney protokol parametreleri makine çağrıları sürekli olumsuz veri kalitesini etkileyecek spesifik olmayan boyama, enkaz ve hücre agrega hariç şekilde ayarlanır.
3. doğruluğu ve limit değişkenliği en üst düzeye çıkarmak için, göz başına 500 β-hücrelerinin en az analiz edin.
   Not: Sıçan adacık kültürlerde bazal β-hücre replikasyonu indeksi 0.5 olması beklenmektedir -% 3. Tipik olarak, kuyu başına 40 resim 500 β-hücreleri tanımlamak için fazlasıyla yeterli.
4. analiz öncesindetüm plaka, seçilen negatif-(DMSO-tedavi) ve pozitif kontrol analiz (5-iyodotübersidindir [1 uM] veya dipiridamol [15 mM]) tahlil protokolü geçerliliğini değerlendirmek için kuyu ile tedavi edilen. Deney doğru kurulduğunda, pozitif kontrol bileşikleri, β-hücrelerinin replike yüzdesi en az iki kat artışa neden olur.
5. tahlil protokolü doğrulandıktan sonra tüm plaka okuyun.

Sonuçlar

β-hücre ya da α-hücresi çoğalmasını değerlendirmek için, dört renkli bir deney protokolü gereklidir. İlk olarak, nesnelerin DAPI lekelemesi (kanal 1, 386 nm) ile belirlenmiştir. Sonraki, β-hücreleri (olay 1) sayılır: nesneleri PDX-1 ⁺ (kanal 2, 650 nm) ve peri-nükleer insülin (kanal 3, 549 nm) co-ifade eder. Daha sonra, kopyalayan β-hücreleri (olay 2) sayılır: (olay 1) co-express Ki-67 (kanal 4, 485 nm) (Şekil 3)-hücreleri ß. β-hüc...

Tartışmalar

β-hücre büyümesini ve yenilenmesini kontrol moleküler yollarını inceleyerek için deneysel yöntemler diyabet araştırmacılar için önemli araçlardır. Burada, bir fare-adacık bazlı tarama platformu sunulmuştur β-hücresi çoğalmasının küçük moleküllü uyarıcıları belirlemek ve karakterize etmek.

Bu protokolün en yönlerini kolaylıkla deneyimli araştırmacılar tarafından yerine getirirken, bir kaç adım belirli teknik gerektirir. İlk olarak, adacık izolasyonu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 g male Male Sprague Dawly Rat	Charles River	Stain # 400
12 cm teeth tisuue forceps	Fine Science Tools	11021-12
11.5 cm fine scissors	Fine Science Tools	14058-11
14.5 cm surgical scissors	Fine Science Tools	14001-14
16 cm curved forceps	Fine Science Tools	11003-16
12 cm curved hepostat	Fine Science Tools	13011-12
12 cm scalpel handle	Fine Science Tools	10003-12
Tissue sieve-30 mesh	Bellco Glass	1985-85000
Cizyme RI, 375,000 CDA units	VitaCyte	005-1030
Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++)	Gibco	24020-117
Ketamine HCl (200 mg/20 ml)	JHP Pharmaceuticals	NDC# 42023-113-10	to make anesthetic cocktail
Xylazine (5 g/50 ml)	LLOYD	NADA# 139-236	to make anesthetic cocktail
Histopaque 1077	Sigma	H-1077	to make histopaque 1100
Histopaque 1119	Sigma	H-1119	to make histopaque 1100
Newborn Calf Serum 500 ml	Hyclone	SH30118.03
Hanks' Balanced Salt solution	Hyclone	SH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose	Hyclone	SH30021.01
Functionality/Viability Solution	Mediatech	99-768-CV
RPMI1640 media	Hyclone	SH30096.01	to make conditioned medium
804G rat bladder carcinoma cell-line	Available upon request		to make conditioned medium
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	26160
GlutaMax-I	Gibco	35050-061
Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)	MP Biomedicals	1670049
Formamide 500 ml	Fisher BioReagents	BP227-500
Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0)	Vector Laboratories	H-3300	to make 0.15 M Sodium Sitrate solution
Dextrose, Anhydrous	EMD Chemicals	DX0145-1	to make 1 M glucose solution
Nomal Donkey Serum (Powder)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
Mouse anti-human Ki67 antibody	BD Biosciences	556003
Goat anti-human PDX-1 antibody	R&D Systems	AF2419
Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody	Dako	2016-08
Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody	Dako	2014-06
Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody	Dako	2011-08
Polyclonal chicken anti-vimentin antibody	abcam	ab24525
Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	715-065-150
StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated	Invitrogen	S32354
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG	Jackson ImmunoResearch	705-025-147
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG	Jackson ImmunoResearch	706-025-148
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	711-025-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG	Jackson ImmunoResearch	706-175-148
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG	Jackson ImmunoResearch	705-175-147
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	711-175-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG	Jackson ImmunoResearch	703-175-155
DAPI	Millipore	S7113
Disposable Reagent Reservoir 25 ml	Sorenson BioScience	39900
384 well, black/clear, tissue culture treated plate	BD Falcon	353962
96 well, black/clear, tissue culture treated plate	Costar	3603
Multi-channel pipettor	Costar	4880
12-channel vaccume aspirator	Drummond	3-000-096
Cell Scraper	Falcon	353085
Isotemp Water Bath Model 2223	Fisher Scientific
High-content screening instrument: ArrayScan VTI	Thermo Scientific