Tek molekülün yapısal bilgiler Hızlı Nano konumlandırma Sisteminin Kullanılması Deneyler FRET

Özet

We present the setup and experimental procedure to obtain smFRET data from large donor-acceptor networks with a TIRF microscope. The step-by-step analysis of these measurements with the Bayesian inference software Fast-NPS yields high-resolved structural information via the application of adapted dye models.

Özet

Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. Thereby, multiple smFRET measurements are used to localize an unknown dye position inside a protein complex by means of trilateration. In order to obtain quantitative information, the Nano-Positioning System (NPS) uses probabilistic data analysis to combine structural information from X-ray crystallography with single-molecule fluorescence data to calculate not only the most probable position but the complete three-dimensional probability distribution, termed posterior, which indicates the experimental uncertainty. The concept was generalized for the analysis of smFRET networks containing numerous dye molecules. The latest version of NPS, Fast-NPS, features a new algorithm using Bayesian parameter estimation based on Markov Chain Monte Carlo sampling and parallel tempering that allows for the analysis of large smFRET networks in a comparably short time. Moreover, Fast-NPS allows the calculation of the posterior by choosing one of five different models for each dye, that account for the different spatial and orientational behavior exhibited by the dye molecules due to their local environment.

Here we present a detailed protocol for obtaining smFRET data and applying the Fast-NPS. We provide detailed instructions for the acquisition of the three input parameters of Fast-NPS: the smFRET values, as well as the quantum yield and anisotropy of the dye molecules. Recently, the NPS has been used to elucidate the architecture of an archaeal open promotor complex. This data is used to demonstrate the influence of the five different dye models on the posterior distribution.

Giriş

Bir biyomolekül yapısını belirleme işlevini anlamak için bir anahtar önkoşuldur. Yapı tayini için iki köklü yöntemler cryo-elektron mikroskobu ve X-ışını kristalografisi ^{1, 2.} Bugün, her iki yöntem angstrom düzeyine kadar bir çözünürlüğe sahip yüksek çözünürlüklü yapısal bilgi sağlar. Bu iki yöntem, bu protein kompleksleri gibi büyük biyomoleküllerin yapısının aydınlatmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Mevcut yöntemler sürekli son yıllarda boyunca geliştirilmiş olmasına rağmen, geniş bir dinamik ve geçici kompleksleri ³ incelenmiştir zaman, biyolojik yapıların karmaşıklığı hala, özellikle yapısal biyoloji için büyük bir sorun teşkil etmektedir.

makromoleküler kompleksleri dinamiklerini ve özellikle yapı-fonksiyon ilişkisini incelemek amacıyla, tek-molekül metodolojileri prov vararyans yararlı bilgiler ^4. Birkaç yeni stratejiler yapısal ve dinamik bilgi edinme ile ilgili bir ortogonal bir yaklaşım sağlayarak geliştirilmiştir. Örnekler, yüksek hızlı AFM ^5, mekanik manipülasyon ^6, floresans mikroskopisi yeri ^7, hem de tek-molekül Förster Rezonans Enerji Transferi (smFRET) ^{8, 9} vardır. Oldukça erken FRET üzerinde beri nedeniyle biomacromolecules ¹⁰ uzunluğu ölçekte mesafe bağımlılığı, moleküler cetvel olarak adlandırılmıştır.

SmFRET özellikle ilginç bir uygulama sonucuna smFRET ölçümlerden elde edilen mesafe bilgileri kullanmak bilgileri ^{11, 12, 13, 14, 15,} yapısal >, ^{16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23.} Nedeniyle smFRET yüksek zaman çözünürlüğü, bir protein yapısının hareketli parçaları konumu lokalize edilebilir. Ancak, boya molekülleri hakkında smFRET veri önemli düzeltme parametreleri kantitatif bilgileri ayıklamak için ölçüm ²⁴ sırasında tespit edilmesi gerekmektedir. Bu düzeltme faktörleri ile, verimliliği FRET E _FRET formülü kullanılarak hesaplanabilir

,

Nerede _Bir ve ben _D sırasıyla donör ve akseptör molekülünün floresan yoğunlukları (bakınız Şekil 2) vardır. β-faktör alıcı kanalı içine, çapraz konuşma için donör emisyon sızmasını hesapları ve hesaplanır

Ben _A ve ben _D nerede donör floresan yoğunlukları ve alıcı molekülün fotoğraf beyazlatma sonra alıcı molekül vardır.

γ-faktörü iki kanal nispi algılama verimliliği farkı olarak vericinin flüoresan verim ve alıcı boya farkları düzeltir. Bu her bireyin zaman iz hesaplanır

Bu açıklama, bazen önemli hale gelir ve yanı düzeltilmiş olması gerekir alıcı molekül, doğrudan uyarma ihmal olduğunu unutmayın. Bu düzeltme faktörleri belirlemek için foto-fiziksel değişiklikler ve yapısal dinamikleri ayırt etmek için bir alternatif şema ²⁵ donör yanı sıra alıcısını hem heyecanlandırmak için yararlıdır.

Nicel smFRET verimlilik değil, aynı zamanda niceliksel yapısal bilgi elde etmek değil, sadece sırayla, Nano-Konumlandırma Sistemi (NPS) 2008 ²⁶ tanıtıldı. adı uydu tabanlı Küresel Konumlandırma Sistemi (GPS) olan benzerliklerine göre seçildi. NPS biomacromolecular kompleksleri bilinmeyen boya pozisyonları lokalizasyonu için smFRET ve X-ışını kristalografisi verilerin birleştirilmesi melez bir tekniktir. crystal yapı referans çerçevesi olarak hizmet vermekte ve smFRET sonuçları bilinmeyen bir fluorofor konumunda (anten) ve kristal yapısının (uydu) bilinen bir pozisyon arasındaki mesafe bilgilerini elde etmek için kullanılır. üst üste deneylerde anten ve çeşitli uydu arasındaki mesafeler ölçülür ve anten konumu Bayesian parametre kestirimi göre istatistiksel olarak sıkı bir analiz düzeni vasıtası ile tespit edilir. Bunun bir sonucu olarak, antenin en muhtemel konumunu sadece hesaplanır, ancak tam bir 3D belirsizliği dağılımı denilen arka inanılır hacim ile görüntülenmiştir. Ayrıca, NPS tam smFRET ağları ²⁷ analiz için genişletilmiştir.

NPS ökaryotik transkripsiyon önemli sorular, yukarı DNA, şablon olmayan DNA ve RNA Polimeraz II uzama co içinde doğmakta olan mRNA yani tabii bir dizi çözmek için kullanılır olmuşturAyrıca transkripsiyon başlama etkisini gösteren mplex ^{12, 28, 26} faktörleri ve ²⁹ açık promotundan dinamik mimari kompleks. Ayrıca, NPS transkripsiyon uzama faktörü Spt4 / 5 ³¹ ile aynı merkezine yarışmalı olarak bağlandığı transkripsiyon başlatma faktörü TFE pozisyonuna arke RNA polimeraz açık kompleks ³⁰ ve özellikle de bir yapı ortaya çıkarmak için kullanıldı.

O zamandan beri, smFRET göre yapısal yaklaşımlar bir takım ^{15, 18, 21, 23} yayınlanmıştır. Farklı smFRET merkezli yapısal yöntemleri karşılaştırıldığında, yöntemin belirgin hassas boya modelleri özellikle tercih son derece bağımlı olduğu ortaya çıkıyor. Bir dikkat etmelisinizboya molekülleri kendi yerel ortama bağlı olarak farklı mekansal ve yönelim davranışlar gösterebilir.

Bu amaçla, Fast-NPS ³² tanıtıldı. Hızlı NPS ölçüde hesaplama sürelerini azaltarak gelişmiş bir örnekleme algoritması kullanır. Ayrıca, Hızlı NPS bir yapısal analiz yapmak ve her boya molekülü için kullanıcının bir sonraki tarif edilecektir beş farklı boya modelleri bir dizi seçebilirsiniz sağlar. Klasik olarak adlandırılan en muhafazakar model, boya tek, ancak bilinmeyen, konuma sahiptir varsayar. Bu pozisyonda, flüorofor, büyüklüğü, ilgili (zamana bağlı) Fosforlu anisotropi, belirlenen bir koni içinde serbest dönebilir. koni oryantasyon mesafeler içine ölçülen smFRET verimlilik dönüştürürken büyük belirsizlikler yol açar, bilinmemektedir. diğer boya moduna göre en küçük hassas yol açacaktır çünkü bu bağlamda, modeli, muhafazakarls. Sadece çok kısa mesafeler için gereken farkedilir yanlış pozisyon tayin klasik modeli kurşun tarafından yapılan varsayımlar. Tipik smFRET değerleri için doğru pozisyonu her zaman nispeten büyük inandırıcı hacim içine alınır.

Daha yüksek hassasiyet arzu edilir çünkü Ancak, geliştirmek ve hassasiyeti geliştirmek için yardımcı olabilir alternatif boya modelleri, test etmek önemlidir. Boya içsel floresans ömrü çok daha hızlı dönerse, sözde ISO modeli uygulanabilir. Burada, ² k yönlenme faktörü (karakteristik izotropik Förster çapındaki hesaplanması için gerekli olan ) 2/3 olarak ayarlanır. Klasik modeli ³² ile karşılaştırıldığında bir sonucu olarak, hesaplanan güvenilir bir hacim küçük büyüklük yaklaşık iki emirleri. Hızlı reori sadece sağlayan fluorofor bir ortamda bulunması halindetüm erişilebilir hacmi üzerinde entation, ancak ek olarak, hızlı hareket, meanpos-izo modeli kullanılır. Bu modelde, boya etkin bir mekansal ortalama bir polinom mesafe dönüşüm ¹⁵ ile açıklanabilir sadece bir ortalama konumunu kaplar. (Örneğin, genel olarak hidrofobik) boyası bir hidrofilik bölge, örneğin, DNA eklenmiş, bu model, geçerlidir. Meanpos-izo modeli uygulaması yaklaşık iki faktörü ile güvenilir bir hacim büyüklüğünde daha da azalmasına neden olmaktadır. Bununla birlikte, bir proteine ​​bağlı bir boya olarak, sterik olarak erişilebilir birim (AV) çeşitli hidrofobik yamalara tersinir olarak bağlanan olabilir. Anında bu bölgeler arasındaki geçiş, ancak bir bölgede serbest rotasyon uğrar ve içinde hızlı lokalize hareket en iyi var-meanpos-iso modeli ile tarif edilen bir fluorofor. Benzer bir durum için hangi boya modeli geçerlidir var-meanpos döndürmek için özgür değildir. Daha d Bu modelleri hakkında etails bizim son yayında ³² bulunabilir.

Bu modeller, özellikle boya karşılaşabileceğiniz çeşitli ortamlarda hesabını ve bunları uygulamak akıllıca yerelleştirme hassasiyetini optimize etmek kapsamlı bir repertuar sunar. Hızlı NPS içinde belirli bir konuma bağlı her boya molekülü FRET ortakları farklı modelleri var izin verilen şekilde, tek bir modele atanabilir. Bu sınırsız ve yakın-doğa modelleme sağlar. Ancak, son bir modelin kombinasyonu ile elde edilen sonuçlar deneysel verilerle uyum içinde hala olduğundan emin olmak için sıkı istatistiksel testler gerçekleştirir önemlidir. Bu testler Hızlı NPS yazılım yer almaktadır.

deneysel verilere Hızlı NPS uygulamak için (sadece) üç giriş parametreleri ölçümü gereklidir. İlk olarak, boya çift, spesifik bir izotropik Förster yarıçapları (/54782/54782eq5.jpg "/>) Tespit edilecek olan donör boya. Bu nedenle, kuantum verimi (QY), donör floresans emisyon spektrumu ve alıcı absorpsiyon spektrumları ölçülmüş olması gerekir. Bu ölçümler de gerçekleştirilebilir standart bir spektrometre ve standart bir floresan spektrometresi kullanılarak toplu. her bir çiftin, R, _0, sonra ücretsiz PhotochemCAD kullanılarak hesaplanır ve NPS analizinde kullanılabilir. Ayrıca, boya moleküllerinin (zaman çözüldü) floresans, anizotropik mi bir polarizasyon (ve zaman) duyarlı flüoresan spektrometresi kullanılarak elde edilmesi. Bununla birlikte, hızlı-NPS için en önemli giriş parametreleri, toplam iç yansıma flüoresans mikroskobu (TIRFM) gibi tek moleküllü floresan mikroskopi kurulum ölçülen smFRET verimliliği vardır .

Burada, smFRET verileri elde etmek ve Hızlı NPS (Şekil 1) uygulamak için bir adım adım protokol mevcut.

Protokol

1. Ön Laboratuar Ekipmanları

Not: ölçüm haznesinin düzeneği, Şekil 3'te gösterilmiştir. bir kuvars camı (erimiş silika) slayt, bir sızdırmazlık film ve akış odası kapatan bir lamel: ölçüm odasının sandviç tasarımı üç ana bileşenden oluşur. Ölçüm odası özelleştirilmiş örnek tutucu üzerine monte edilir. numune odasına ve metal tutucu boyutları standart mikroskopi kuvars cam slayt (76 mm x 26 mm) sığacak şekilde içindir.

1. Kesme kuvars Şekil 4'te gösterilen pozisyonda bir elmas matkap (0.75 mm) kullanılarak cam slaytlar. kuvars cam slaytlar tasarımı her slaydın iki tarafı arasında bir ayırım yapmak amacıyla asimetriktir.
   NOT: Yüzey çizilmiş haline gelene kadar kuvars slaytlar ölçümden sonra yeniden kullanılabilir.
2. Şekil 5 gibi odaları monte etmek için, özel metal örnek tutucuları kullanın/ Strong>. örnek tutucuları bir giriş ve akış bölmesi için bir çıkış boru bağlamak için iki yiv (M4) içerir. Ayrıca, metal tutucu alt yarısına üzerine prizma yuvasını düzeltmek için, metal tutucu yanı sıra iş parçacığı (M3) üzerine numune odasına monte etmek Konuları (M3) kullanın.
3. Bir prizma tipi toplam iç yansıma floresan mikroskop (TIRFM) (Şekil 6) üzerine smFRET ölçümler yapmak.
   NOT: donör uyarma ve alıcı boya molekülleri yanı sıra mavi lazer (491 nm ve bir kırmızı lazer (643 nm, diyot lazer): Yeşil (YAG lazer 532 nm Nd:) TIRFM üç lazer özellikleri smFRET ölçümü öncesinde numune odasının arka plan floresan kirleri ağartmak için, diyot pompalı katı-hal lazer). Üç lazer ışınları mekansal kombine ve acousto optik ayarlanabilir filtre (AOTF) üzerinden seçilebilir. Floresan ışığı yüksek diyafram amacı ile toplanır, bir vericiden bölünmüş ve kabulya da iki EM-CCD kamera üzerine bir dikroik ayna ve yansıtılan kullanarak kanalı. numune odası, iki kademeli motor ile x ve y-yönünde hareket etmesine izin verir, bir mikrometre aşamasına eklenir. Üçüncü piezo motorlu deney boyunca optimum odak sağlamak için otomatik odaklama sistemi oluşturmak için bir IR-lazer ve bir pozisyon duyarlı detektör ile birlikte kullanılır.
   1. FRET zaman yörüngelerde dinamikleri ²⁵ gözlenmektedir alternatif lazer uyarma (ALEX) kullanın. Bu tür dinamikler moleküller içinde ya yapısal değişiklikler veya alıcı parlaklık ve alıcı yanıp sönen dalgalanmalara neden olabilir.
      Not: ALEX bu iki olası nedenleri arasında ayrım sağlar ve dinamik FRET yörüngeleri yanlış yorumlanmasına önler. Bununla birlikte, basitlik için, protokol bölümü ALEX alınmayan filmlerin analizi ile sınırlandırılmıştır.
      Dikkat: Sınıf 3B lazerler tek-molekül floresan kurulumunda kullanılır. yeterli la olunSistem çalıştırılmadan önce ser güvenlik önlemleri, yerel yönetim düzenlemelerine göre, alınmıştır.
4. (Malzemeler ve Yöntemler bakınız) UV-VIS Spektrometre üzerinde kuantum verimi belirlemek için kullanılan emme ölçümü yapın.
5. (Materyaller ve Yöntemler bölümüne bakınız) donör floresans emisyon spektrumu, alıcı emilme tayfı ve bir floresan spektrometresi üzerinde floresan anizotropi ölçümü yapın.
6. Yayımlanmış prosedürlere ^33'e göre örnek odalarında hazırlayın. Alternatif bir şekilde prosedür ^[34] kullanılabilir tarif.
7. smFRET için uygun bir verici-alıcı boya molekülü çifti ile incelenmiştir örnekleri etiketleyin ve numune odasının yüzeyi üzerinde hareketsizleştirilmesi için bir biyotin parçası olduğundan emin olun.
   NOT: Farklı örnek yapıları ihtiyaç vardır Hızlı NPS yazılım ile bilinmeyen bir anten boya konumunu lokalize etmek için. Her yapı needs bilinmeyen anten boya pozisyonunda bir etiket ve kristal yapısı bilinen bir uydu pozisyonunda bir etiket var. Anten konumuna bağlanmış boyalar ve üç farklı uydu pozisyonları olan en az üç farklı yapılar doğru sonuçlar için gereklidir. antenler arasında yanı sıra uydular arasında ölçümleri de doğruluğunu artırmak için yararlıdır, ancak bu doğru analiz girilmesi gerekir boya molekülleri alışverişini gerektirir.

Özel bir Tutucu Akış Chambers 2. montajı

1. içi boş sekme vidalarla (M4) içine silikon tüp (0.8 mm ID, 2.4 mm OD) çekin ve hem düz hem keskin jilet kullanarak her iki taraftan 1 cm çıkıntı bırakarak biter üzerinde tüp kesti. sekme vidanın bir tarafta yaklaşık 2 mm'ye kadar boru çıkıntı ayarlayın.
2. kuvars cam slayt delikler numune tutucuya konuları eşleşen bir şekilde numune tutucu içine akış odası monte edin. sıkmakGiriş ve çıkış vidaları hafifçe örnek odasının giriş ve çıkış hala nüfuz olduğundan emin olmak için. Yavaşça akış odasının konumunu düzeltmek için akrilik cam sahibinin dört vidayı sıkın.
3. Kesme silikon tüp 20 cm uzunluğunda parçalar halinde (0.58 mm İD, 0.96 mm OD). giriş ve ölçüm bölmesinin çıkış vidasına parçalarından birini yerleştirin. bir kelepçe ile giriş ve çıkış boru kapatın.
   NOT: monte örnek odaları en fazla iki hafta boyunca oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.

TIRF Mikroskop 3. smFRET Ölçümü

1. 500 ul PBS ile Örnek odası yıkamak için bir şırınga kullanın. Farklı tampon çözeltisine değiştirmeden önce, giriş hortumunun ucuna bir damlacık oluşturarak her zaman Örnek odasına giren hava kabarcıkları önler.
2. 100 uL nötravidin (0.5 mg / ml'lik son yoğunluğa seyreltildi) solüsyonu ile Örnek odası yıkayın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
3. YıkamaPBS 500 mcL nötravidin solüsyonu dışarı.
4. Numune odasının üzerine prizma metal tutucu vida.
5. TIRF-mikroskop mikrometre aşamasına örnek odasına monte edin. taranması sırasında defocusing önlemek için objektif önünde yatay mümkün olduğunca düz numune odasına monte edildiğinden emin olun.
6. EM-CCD kamera ve sahne piezo-motoru kontrol etmek için yazılım kontrol yazılımını başlatın.
7. IR lazer yansımaları bakarak mikroskop objektif odağı ayarlayın.
8. Metal prizma tutucu üstündeki prizma (PS991, n = 1.52) yerleştirin. lazer ışınları prizma sonra bir yapışkan kullanın ve 5 dakika boyunca UV ışığı ile inkübe vurmak emin olmak için prizma yanal konumunu ayarlayın.
   NOT: Atlı prizma temizleyerek yeniden kullanılabilir.
9. Kamera kontrol yazılımı için tıklayın "Kur Acquisition" ve aşağıdaki toplama parametreleri tanımlayın: 100 ms bütünleşikiyon saati, 401 kare / film (yeşil kamera), 400 kare / film (kırmızı kamera), elektron çoğaltıcı 14 bit 225, pre-amplifikatör kazanç 5x ve okuma hızı 3 MHz kazanır.
10. ölçümü için yerel sabit diskinizde bir klasör oluşturun. Yıl-Ay-Gün, örneğin, ölçüm dosyaları için istenen ad seçin. ayarlar "Otomatik Kaydet" binici gitmek yazılımında, "Otomatik kayıt" etkinleştirmek ve * film edinimi için .sif dosya formatı seçin. Sabit diskte klasörü seçin. filestem olarak klasör adını kullanın.
11. "Autoıncrement" fonksiyonu (1 set başlangıç ​​değeri) etkinleştirin. dosya için bir operatör eki etkinleştirin. sırasıyla, donör ve alıcı kanalı için "DON" ve "ACC" kullanın. ayırıcı olarak "_" i seçin.
12. "Video" kamera kontrol yazılımı tıklamayla com üç lazerlerin maksimum lazer yoğunluğu (kullanarak örnek odasını tarayarak kamera ve ağartıcı eşiğe canlı görüntüsünü başlatmak içinkombine ≈3,000 W / cm görüş alanı başına ² 10 s).
13. mavi lazer kapatın. Lazer uyarma (ALEX) alternatif kullanılması durumunda kırmızı lazer için yaklaşık 200 W / cm ² ve yaklaşık 40 mW / cm ² yeşil lazer şiddetini azaltmak.
14. 50-100 pM bir konsantrasyona biyotinlenmiş floresan örnek seyreltilir. çözeltinin yüklenebilir 100 uL. Örnek bağlanması üzerine odası yüzeyi üzerinde immobilize edilir.
    NOT: odasını aşırı değil emin olun. Komşu moleküllerin birbirinden ayrılmalıdır.
15. Gerekirse, bölmeye, bir 2 kat daha fazla konsantre edilmiş numunenin ek bir 100 uL yükleyin.
16. Yükleme tamamlandıktan sonra kelepçeler kullanarak ölçüm odasının giriş ve çıkış boruları Seal.
17. tüm lazerler kapatın ve daha fazla akış bölmesini görüş iki alanı taşımak için piezo-motorlar kullanın.
18. Kamera kontrol yazılımı film kayıt ve geçiş başlamak için "Take sinyali" üzerine tıklayınAynı anda lazer. moleküllerin% 80'den fazla lazer gücünü ayarlayarak filmin sonunda ağartılmış emin olun.
19. Yineleyin bütün prebleached örnek odası bölge için 3.17 ve 3.18 adımları.

Dönüşüm Harita 4. Toplama ( "beadmap")

1. Bölüm 1.1, 1.2 ve 2 de tarif edildiği gibi bir akış odası hazırlayın.
2. donör floresan emisyon ve alıcı kanalı göstermek avidin kaplı floresan bantlı boncuk kullanın. 1 dakika için hazır, daha sonra 1 dakika boyunca daha 50 uL GKD ₂ O Vortex stoklar 50 uL seyreltilmiş Vorteks, 1-2 dakika, daha sonra başka bir 10 s girdap sonikasyon.
3. smFRET ölçümlerinin (Bölüm 3,5-3,10) için açıklanan adımları uygulayın.
4. Akış odasına 2 seyreltilmiş floresan boncuk: 1 Yük 100 ul (1 kamara hacmi). floresan boncuk yüzeyine bağlamak için 10 dakika bekleyin.
5. 3.9 ama chan içinde elde etme parametrelerini kullanınge filmi 26 uzunluk (yeşil kamera) ve 25 (kırmızı kamera) ve 10 elektron çoğaltıcı kazanç.
6. 20 W / ^cm2 'lik bir değere Yeşil lazer yoğunluğunu ayarlar.
7. Yaklaşık 50-100 boncuklarla bir görüş alanına bir film çekmek.

5. İşleme ve Analiz smFRET Verilerin

1. ve kazanılmış filmleri (Materyaller ve Yöntemler bölümüne bakınız) beadmap analizi için özel yazılmış yazılım SM FRET kullanın. programı viewPlot1.m başlatın.
2. Kullanıldığı edilmemiş ise seçeneği "ALEX" işaretini kaldırın, Toplu Analizi | Analiz tıklayın. En iyi performans için "yüksek" zirve bulma eşiğini seçin. "OK".
3. Bir beadmap zaten analiz edilmiş sorulduğunda "HAYIR" seçin. edinilen beadmap içeren klasörü tarayın ve (üzerinde çift tıklayarak) * .sif dosyasını seçin. Bir sonraki diyalog penceresinde basında "Tamam".
   NOT: Bir beadmap zaten önceki bir ölçü analiz edilirsement, burada "EVET" seçmek ve beadmap * .map dosya üzerinde doğru klasöre ve çift tıklayarak göz atarak kurtardı beadmap seçin. Adım 5.8 ile devam edin.
4. görüş alanının karşıt köşelerine yerleştirilmiş iki tek boncuk seçin. Piksel yoğunlukları renk kodlu koyu mavi (düşük yoğunluklu) koyu kırmızı (yüksek yoğunluklu) için vardır.
5. İlk boncuk ortasına tıklayın. molekülün merkez renk kodlaması ile açıkça yer ise, "EVET" i seçin ya da başka "HAYIR" linkine tıklayın ve farklı bir molekül çifti seçin.
6. "KEEP" maksimum yoğunluğu ve basın gösteren piksel üzerinde çarpı yerleştirin. İkinci kanal ile bu işlemi tekrarlayın.
7. ters köşe molekülün tıklayın ve tekrar 5.5 ve 5.6 adımları tekrarlayın.
   NOT: İki kanal göreceli piksel kaydırma komut penceresinde görüntülenir ve dönüşüm haritası otomatik olarak dosya .sif beadmap * içeren klasöre * .map dosyası olarak kaydedilir <./ Li>
8. "Toplu analizi" için donör ve alıcı filmleri (* .sif) yüklemek için, analiz edilecektir bütün filmleri seçmek, klasöre gidin ve "Tamam" a tıklayın. Bir sonraki diyalog penceresinde, "OK".
   Not: komut penceresinde görüntülenen son şeritli ile başladığında toplu analizi tamamlandı "Bitmiş analiz ...". tespit edilen moleküller de donörün göreli kayması ve dönüşüm haritası belirlenen alıcı kanalını gösteren yeni bir pencerede, görüntülenir.
9. Yük | Toplu film dosyaları Dosya tıklayın yüklemek için. seçeneği kullanılmadığı edilmemiş ise "ALEX" işaretini kaldırın. 10 smoothwidth ayarlayın ve "Tamam" a tıklayın. * .ttr Dosyaları içeren klasörü seçin ve bir sonraki bağlam menüsünde "OK" "tümünü seç" ve tıklayın.
10. Görüntülenen iz değiştirme tuşunda karakteristik smFRET fazları (Şekil 2) basın özellikleri ise "seçili değil" ve ilkFare imleci ile çizgiyi hareket ve farenin sol tuşuna tıklayarak FRET Olayın başladığı zaman noktasını seçin. Sonraki alıcı molekülün ağartma ve donör molekül beyazlatma nihayet zaman noktasında zaman noktasını seçin.
11. Bir sonraki pencerede FRET verimliliği mavi çizilir. iz seçmek için "Evet" butonuna aksi takdirde "Hayır" seçeneğini seçin. Bir süre iz "Önceki" düğmesini tıklayın yeniden erişin.
12. Filmin son molekülü kadar aynı işlemi tekrarlayın.
13. "| Kaydet Dosya" Bir filmde geçen molekülü analiz ettikten sonra tıklayarak seçilen izlerini kaydedin. * .sif Dosyaları aynı klasöre seçilen izleri kaydedin.
14. Tümünü tekrarla edinilen filmler için 5.10-5.13 adımları.
15. Program combine_fret_results.m yürütün. * .res Dosyaları ve tüm * .FRETonly_trace dosyalarını içeren klasörü seçin. MW.dat olarak molekül-bilge FRET ve çerçeve bilge FRET dosyaları kaydedin vesırasıyla FRW.dat.
    NOT: * .dat dosyaları ASCII dosyaları olarak kaydedilir. FRW.dat dosyası altı sütun ve her FRET-çerçeve için bir satır içerir. Altıncı sütun düzeltilmiş çerçeve bilge FRET verimliliği içerir. MW.dat dosyası 21 sütun ve seçilen FRET molekül başına bir satır içerir. Üçüncü sütun molekülü-bilge FRET verimliliği içerir.

6. Histogramlar içinde smFRET Verileri Görüntüleme

NOT: Tüm kaydedilen smFRET verileri çerçeve bilge veri veya molekül-bilge veri histogramlar çizilen ve Gauss (çoklu) doruklarına uyan kullanılarak analiz edilmektedir ortalama smFRET verimliliğini elde etmek için. Aşağıda, protokol (Malzeme Listesi bakınız) ticari bir veri analiz yazılımı kullanır. Bununla birlikte, herhangi bir başka uygun bir yazılım yerine kullanılabilir.

1. Bir veri analiz yazılımı açın (Malzeme listesi bakınız). İthalat | | çoklu ASCII Dosya tıklayın. FRW.dat dosyasını içeren klasörü seçin. Dosyayı seçin ve tuşuna basın "Tamam & #34 ;. Bir değişiklik olmadan "OK" ile giriş seçeneği kabul edin.
2. İstatistikler | | Histogram düzeltilmiş FRET verimliliği içeren üçüncü sütun C (Y) seçin, sütunun basıp Arsa üzerinde sağ tıklayın. Histogram penceresinde sütun üzerine çift tıklayın ve "otomatik binning" seçimini ve istenen bin-boyutu, örneğin, 0.05 seçin. Ayrıca, örneğin, -0.025 ve 1.025 başlangıç ve bitiş değerlerini seçin.
3. Onlara sol tıklayarak histogram sütunları seçin. Sonra sağ tıklayın ve "Bin çalışma sayfasına gidin" seçin. Bunun üzerine sol tıklayarak "Sayımlar" sütunu seçin ve ardından sağ tıklayın ve seçin Arsa | Sütun / Bar / Pie | Sütun.
4. Uydurma | | Doğrusal olmayan eğri fit | Aç iletişim sütun çubuğu arsa Analiz gidin. İşlevi altında "Gauss" seçiniz ardından "Parametre" binici gidin. Otomatik parametre başlatma kaldırın. "Fit" konulu 0. tıklayın ofset değeri (y0) sabitleyin.
   NOT: fit fonksiyonu yanı sıra uydurma dekuyrukları artık sütun arsa görüntülenir. "Xc" değeri uygun fonksiyon, yani, NPS yazılımı için giriş parametresi olarak hizmet vermektedir ortalama FRET verimliliği merkezini verir.

Kuantum Verimi 7. ölçümü

1. Würth ve arkadaşları tarafından tarif edilen prosedüre benzer nispi yöntemle kuantum verimi tayin edilir. ^35, bir standart olarak, etanol (QY =% 91.5) içinde eritilmiş kullanılarak rodamin 101.
2. 1 cm uzunluğunda bir emme küvet içinde 80 uL hacmi kullanılarak bir UV spektrometresi Telaffuz absorpsiyon spektrumları. Floresan eksitasyon için kullanılacak dalga-boyunda emicilik ≤ 0.05 olması gerekir.
3. foton sayma modunda çalışan lamba kalibre spektrometresi kayıt emisyon spektrumları. Bir spectr kullanarak uyarma (0 °) ve emisyon (54.7 °) yolu (sihirli açı şartlar) Glan-Thompson polarize olan ölçümleri gerçekleştirmek sırasıyla 5 nm uyarma ve emisyon monokromatör 2.5 nm, al bant genişliği. Ölçü örnekleri sayım hızı 10 ⁶ sn ^-1 aşmadığı 3 mm yol uzunluğu alarak özenle bir floresan küvetine aktardıktan sonra.
   1. göre kuantum verimi hesaplamak

n ve n _Std sırasıyla numune ve standardın çözücü kırılma indisleri nerede. f (λ) ve f_Std (λ) örnek floresan yoğunlukları ve dalgaboyu l standarttır. A (λ _ex) ve A ^std (λ _eski) uyarma dalga boyunda numune ve referans absorbans ve Φ _std standardının kuantum verimi olduğunu.

le "> 8. İzotropik Förster Radius hesaplanması

1. (Izotropik Förster yarıçapı hesaplamak ) Verici molekül emisyon spektrumunda gelen kabul edici molekülünün absorpsiyon spektrumu, verici kuantum verimi ve ortamın kırılma endeksi. Hesaplanması için ücretsiz PhotochemCAD kullanın . Ancak herhangi bir diğer müsait bir yazılım yerine ³⁶ kullanılabilir.

Anizotropilerin 9. Ölçümü

1. Çeşitli uyarma / emisyon polarize ayarlarına (V / V, V / H, H / V, H / H) ³⁶ ile floresan spektrumları kayıtları kararlı durum floresan anizotropilerin belirleyin.
2. Her dalgaboyu için, aletin polarizasyon eserlerin düzeltir G-faktörü, hesaplamakoran

ve her dalga boyu için anizotropi değerini hesaplamak için kullanabilirsiniz:

nerede _xy uyarım polarizasyon x ve emisyon polarizasyon Y yoğunluğunu gösterir.

3. kararlı durum floresans anizotropi hesaplamak için emisyon spektral aralığında değerlerinin ortalamasını alın.

Hızlı NPS Yazılımı 10. Kurulum

1. http://www.cgl.ucsf.edu/chimera gelen UCSF Chimera indirin ve kurulum rehberini takip edin.
2. "Biyofizik Enstitüsü" web sitesine gitmekhttps://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html: Ulm Üniversitesi'nde. Hızlı NPS geçerli sürümünü indirin ve seçtiğiniz bir klasöre ayıklamak. "Yeniden Dağıtılabilir" alt klasörü açın ve sisteminize uygun olan Visual C ++ Redistributable yükleyin.

11. Pdb Dosya Merkezleme

1. Chimera ilgi pdb dosya (lar) açın. centroid koordinatlarını makromoleküler kompleks tüm atomları seçip hesaplamak (Araçlar | Yapı Analizi | Eksen / Uçaklar / Sentroidler | Define ağırlık merkezi ... | Tamam).
2. ve Dönüşüm Aracı (Araçlar | Hareket | Koordinatları Transform) | Cevap Log (Oturum Cevap Sık) açın. Koordinatları Transform pencerenin metin kutusu "Shift" içine Cevap Giriş gösterilen centroid koordinatlarını girin ve her koordinat işaretini değiştirmek. Basın "Uygula" ve "Kaydet PDB" (Dosya | Kaydet PDB) ile dosyayı kaydedin.

12. AyarPozisyon Priors kadar

NOT: Tüm değerler angstrom olarak kabul edilir.

1. teknik hesaplama dili başlatın ve yerel Hızlı NPS klasörü geçerli klasörü değiştirmek. komut penceresinde girin: FastNPS.
2. Proje Yöneticisi (| Yeni Projesi) yeni bir jobfile oluşturun.
3. (| Önceki model boya Araçları) pozisyonu öncesinde ayarlayın.
4. Panel "önceki temelleri" değerini girerek önce pozisyon uzaysal çözünürlüğü define (2 tavsiye edilir).
5. onay kutusunu aktive ve "yük PDB" butonuna tıklayarak makromolekül iç hariç. Seçin ve Bölüm 11'de açıklandığı gibi merkezli Pdb dosyasını yüklemek.
6. değerini girerek boya (tartışma, 13 Å tavsiye edilir) Yaklaşık çapı belirtin.
7. Yani iskeletleştirme mesafe, boya molekülü makromolekül nüfuz edebilir mesafeyi girin (2 Å tavsiye edilir).
8. İçindePanel "maksimum önceki boyut" pozisyon öncesinde minimal ve maksimal koordinatları girin (önerilir: in [-150,150] y ve z [-150,150] olarak x [-150150]).
9. Bir uyduyu tanımlarken, panel "önceki temelleri" onay kutusunu "esnek bağlayıcı yoluyla eki" etkinleştirmek ve boya molekülü takılı olduğu panel "bağlayıcı" (merkezli pdb dosyası) atomun koordinatları girin. Dahası, (tartışma, 13 Å ve 4.5 Å önerilir) değerlerini girerek uzunluğu ve bağlayıcı çapını belirtin. anten durumunda bu noktaya atlayın.
10. "Erişilebilir hacmi hesaplamak" düğmesine basın.
11. önceki konumunu kaydetmek ve isteğe bağlı olarak Chimera gibi yazılımları kullanarak görselleştirme amacıyla verebilirsiniz.

13. Ağ Geometri tanımlama

1. Ölçüm Pencere (| Düzenleme Geometri Modu) tanımlayın açın.
2. popo basarak yeni bir boya molekülü oluşturPanel "Boyaları" in "Yeni".
3. Bir değer girerek floresan anizotropi (Bölüm 9) ayarlayın ve açılır menüden "Boya modeli" içinde bir boya modelini seçin.
4. , Buton "Load" tuşuna önce gelen konumunu seçmek ve boya aktive onay kutusunu işaretleyin. Tüm antenler için yanı sıra tüm uydular için, yani tüm boyalar için bu işlemi tekrarlayın.
5. Tüm boyalar oluşturduktan sonra ölçümleri tanımlar. Panel "Ölçümler" bölümündeki "Yeni" tıklayarak yeni bir ölçüm oluşturun.
6. Açılır menülerden "Dye1" ve aşağıda "Dye2" kendi FRET ortaklarını seçin.
7. hata smFRET etkinlik ve bu boya çiftinin izotropik Förster çapındaki girin.
8. Son olarak, ölçüm etkinleştir onay kutusunu işaretleyin. Tüm ölçümler için bu işlemi tekrarlayın.
   NOT: Kullanıcı karışık olabilir böylece Çoğu zaman ağ, giderek daha karmaşık hale gelir. PREVEN içinHataları t "Ağ Kontrol" düğmesine basarak görsel ağı kontrol edin. Şekil aktif boyalar görüntüler ve FRET boyalar birbirine hattı vasıtasıyla ölçümler göstermektedir.

14. Hesaplama

1. (| Hesaplama Modu) Hesaplama penceresini açın.
2. ağdaki her boya atanan özel bir modeli varsa, "Kullanıcı tanımlı" seçin ve "Hesaplama" tuşuna basarak hesaplama işlemini başlatın. Aynı modeldeki tüm boyalar sahip olmak, beş modelleri (klasik, iso, meanpos-iso, var-meanpos-iso ve var-meanpos) birini seçin ve devam edin.
   NOT: Komut penceresi hesaplama ilerlemesini gösterecektir. hesaplama tamamlandığında Hızlı NPS, bir pop-up mesaj ile yapacaktır.

Sonuçların 15. Görselleştirme

1. (| Sonuçlarını Modeli) Sonuçlarını Pencere, boyaların inandırıcı hacimleri ihracat açmak için.
2. İhracat boya yoğunlukları:
   1. İhracattek başına ya da hepsi aynı anda boyamaktadır. Tek bir boya panelde "Görüntülenen Boyaları" ve basın "İhracat Yoğunluğu" bunu seçin ihracat için. çözünürlüğü girin (2 tavsiye edilir) ve ihracata yönelik bir dosya türü seçin. Sağ tarafta yoğunluk önizlemesi ve matematiksel bazı özelliklerini gösterilmiştir.
   2. Tüm boyalar aynı anda "Toplu Export" itmek ihracat için.
3. Chimera sonuçlanan yoğunluk dosyaları açmak.

Seçilmiş Modeli Kombinasyon 16. Tutarlılık Kontrolü

1. (| Sonuçlarını Modeli) Sonuçlarını penceresini açın. panelde "Hesaplama Bilgisi" metin kutusuna "tutarlılık" bir değer daha düşük% 90 görüntülerse şimdiki model yeterince ölçülen smFRET verimliliği temsil ve böylece tutarsız değildir.
2. tutarsızlık olması durumunda düğmeye "Ayrıntılı Tutarlılık" itin. % 90 altında bir değere sahip ölçümler için arayın. bir veya daha fazla boya varsas ağırlıklı bu ölçümlerin katılan, kendi modelleri tutarsızlığı neden muhtemeldir. Bu boyalar için farklı boya modellerini dikkate ve Fast-NPS hesaplama yeniden çalıştırın.

Sonuçlar

Transkripsiyon bütün organizmalarda gen ifadesi ilk adımdır. Archaea olarak, transkripsiyon, tek bir RNA polimeraz (rnap) tarafından yürütülmektedir. ökaryotlar ile karşılaştırıldığında, arke rnap basit bir transkripsiyonel makine yaparken kendi ökaryotik meslektaşları çarpıcı bir yapısal benzerlik taşımaktadır. Bu nedenle, Archaea, RNA polimeraz II (pol II), ökaryotik transkripsiyon inisiyasyon çalışmak için bir model sistem olarak kullanılır. Son zamanlarda, arke RNA polimeraz açık kompleksinin tam mimarisi, tek moleküllü FRET ve NPS tespit edilmiştir. NPS analiz veri transkripsiyon başlama mekanizması yararlı bilgiler sağlar tam arke açık yükseltici kompleksi, bir model oluşturmak için kullanıldı.

Bu yapıyı aydınlatmak için smFRET verimlilikleri açık yükseltici com içinde yer alan bilinmeyen anten boya molekülleri arasında ölçüldüplex ve pozisyonları kristalografik yapıların (pdb-ID: 2WAQ) bilinmektedir rnap, beş referans sitelerinde dahil edildi bilinen çeşitli uydu boya molekülleri ^37. Anten boyalar olmayan şablon DNA, Araç kullanmayın, TBP ve TFE farklı pozisyonların biri birine bağlanmıştır. Bu çalışmada kullanılan network 60'dan ölçülen uzaklığın oluşturmaktadır.

Şekil 7 NPS analizi yapılmış tam arke açık yükseltici kompleksinin modelini göstermektedir. Bu çift sarmallı promoter DNA (açık ve koyu mavi), (gri) RNA Polimeraz ve transkripsiyon başlatma (mor) TBP faktörleri içermektedir, TFB (yeşil) ve TFE (sarı). Model, klasik bir model (A), ISO modeli (B) kullanılarak hesaplandı NPS analizi, güvenilir bir hacim, meanpos-izo modeli (C), var-meanpos-izo modelinden elde edilen sonuçlar ile üstüste bindirilmiştir (D) ve var-meanpos modeli (E).

Şekil 1: Hızlı NPS hesaplanması için gerekli parametrelerin elde edilmesi ve işlenmesi iş akışı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: smFRET olayı örnek floresan yoğunluğu zaman iz. smFRET II: verici (yeşil) ve üç karakteristik faz, yani bir gösteren alıcı molekül (kırmızı) floresans yoğunlukları verici floresans alıcı ışıkla ağartma sonra III donör Photobleaching sonra eşiğe.g2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: smFRET deneyler için akış odasının şematik gösterimi. Akış odası akrilik cam tutucular ile özelleştirilmiş metal tutucu üzerine monte edilir. akış odasının sandviç tasarımı kuvars cam (erimiş silika) giriş ve çıkış boruları, bir sızdırmazlık filmi ve akış odası kapatan bir lamel bağlanması için iki delikli slayt oluşmaktadır. TIRF aydınlatma için prizma akış odasının alt yarısına üzerine monte edilir. Içi boş sekme vidalar akış odasına için giriş ve çıkışları sağlamak. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

alt = "Şekil 4" src = "/ files / ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg" />
Şekil 4: kuvars cam slayt ve conta filmin hazırlanması. (Milimetre verilen) deliklerin konumlarını gösteren kuvars cam slayt mekanik çizim. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5: akış odasının mekanik çizim. cam tutucular ve alüminyum montaj çerçevesi akrilik alüminyum prizma tutucu önlemler, milimetre olarak verilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ŞEKIL 6 "src =" / files / ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg "/>
Şekil 6: smFRET deneyleri için kullanılan prizma tipi TIRF kurulum şematik gösterimi. Optik bileşenlerin kısaltmaları: A, diyafram; DM, dikroik ayna; F emisyon filtresi; L, lens; M, ayna; Objektif O; P, prizma; PSD, pozisyon duyarlı foto-diyot; S, örnek; PS, konumlandırma aşaması; T, teleskop. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7: Farklı model varsayımlarının Simülasyon sonuçları. Tüm resimler arke RNA polimeraz gösterir: birlikte geliştirici DNA (sırasıyla T-DNA ve mavi ntDNA ve mavi) için model ile (pdb-ID 2WAQ, üstten görünüm), TBP (mor), TFB (yeşil) ve TFE (sarı)arke karmaşık ³⁰ açın. Güvenilir hacimleri (A) klasik modeli, (B) iso modeli, (C) meanpos-iso modeli, (D) var-meanpos-iso modeli ve (E) değişkenin NPS simülasyon sonuçları için üst üste -meanpos modeli. Tüm birimler% 68 güvenilirlik gösterilmektedir. Klasik ve var-meanpos ağları smFRET verileri ile uyumludur. Buna karşılık, bütün boyalar için iso, meanpos-iso veya var-meanpos-iso modeli seçilir ağlar ölçülen verilerle tutarsız. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Doğru olarak örneğin biomacromolecules, nükleik asitler ve / veya proteinler esnek bağlayıcılar yoluyla bağlanmış boyalar arasında FRET verimliliğini belirlemek için setup ve deney prosedürü sunulmuştur.

hassas smFRET ölçümleri (bölüm 3) sağlamak için, ölçüm sırasında herhangi bir zamanda akış odasından havayı uzak tutmak için çok önemlidir. Ayrıca, fluorophores akış odasına aşırı yüklenmeyin emin olun. fluorophores açıkça doğru analiz sağlamak için ayrılmalıdır. donörün beyazlatma görünmüyor smFRET çiftleri, analize dahil olmak zorunda olduğu gibi, görüş alanında moleküllerin>% 80 filmin sonunda ağartılmış emin olun. Verici ve alıcı kanal cross-talk ve bağıl algılama verimliliği düzeltme, numune β-faktörü ve γ-faktörü homojen olmayan hesaba katılması için, sırasıyla, her biri için ayrı ayrı hesaplanır çifti FRET.

kamera ayarları (entegrasyon süresi, elektron çoğaltıcı kazanç, pre-amplifikatör kazanç ve Bölüm 3.9'da açıklanan okuma oranı) gürültü oranı, dinamik aralık ve zaman çözünürlüğü sinyali arasındaki en iyi dengeyi sağlayan değerlere ayarlanması gerekir. Farklı deneyler için ya da farklı donanım kullanıldığında yeniden ayarlanması gerekir. kare sayısı verici en gözlem süresi içinde ağartma maddesi molekülleri sağlamak için yeterince yüksek olması gerekir.

floresan spektrometresi (Bölüm 7 ila 9) üzerine ölçümler için sinyal yoğunluğu ve kaydedilen verilerin spektral çözünürlüğü arasında iyi bir uzlaşma bulunmalıdır. Bu amaçla, flüoresan spektrometresi eksitasyon ve emisyon yolu yarıklar kullanılan aletin ve örnek konsantrasyonuna bağlıdır adapte edilmesi gerekir.

Ayrıca, biz geçici veya dinamik MACROM yapısal bilgi almak için Hızlı NPS analiz yöntem mevcutolecular kompleksleri. NPS olmayan model DNA sarmalının yolu ve arkeal RNA polimeraz açık karmaşık transkripsiyon başlatma faktörleri konumunu göstermek için uygulanmıştır. 60'dan fazla farklı mesafe ölçümlerinin ağını kullanarak, bunu bir yeni uygulamaya örnekleme motoru (hazırlık Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., ve Michaelis, J.) ile donatılmış Hızlı NPS, gösterdi orijinal küresel NPS yöntemine ²⁷ ile karşılaştırıldığında, büyüklük ≈2 emriyle bu karmaşık smFRET ağının analizi için gerekli süreyi azaltır. algoritmanın sağlamlığı paralel tavlama şeması ile birlikte Metropolis-içinde-Gibbs örnekleyici yatmaktadır. Hızlı NPS ağ sonuçlarının tam tekrarlanabilirlik göstermektedir ve önceki ³⁰ yayınlanan sonuçlarla tutarlıdır.

Birçok farklı yöntem smFRET ölçümlerinden ¹¹ yapısal bilgi anlaması nişan yayınlandı Yukarıya>, ^{12, 13, 14, 15, 16, 17, 18.} Bu yaklaşımların her yalnızca belirli bir boya modelini sağlamaktadır. Bu nedenle, söz konusu modele göre yapılan varsayımlara yerine getirmeyen renklendiriciler, kullanılmış veya sahte yapısal bilgi yol edilemez. Hızlı NPS, tam tersine, her boya molekülü farklı bir model için seçmenize izin verir. Bu, her iki farklı yapısal davranışı için hesap olur, boya molekülü kendisi olarak yapışması için kullanılan bağlayıcı. boya molekülü lokal moleküler çevresi, hem de fiziksel özellikleri en uygun olan bir model belirler.

arke başlatma kompleksinin analiz smFRET ağı için, tüm boya molekülleri için izotropik varsayım ciddi bir azalma i yol açarn güvenilir hacimlerinin büyüklüğü klasik modele kıyasla. Tüm boya için ortalama dinamik pozisyonu ile kombinasyon halinde (% 95) tüm güvenilir ses boyutları medyan molekülleri en az 0.5 nM ila ³ azaltır. Bununla birlikte, bu boya molekülü posteriors varsayımlar sahte yapısal bilgilere adına yapılan işaret, kendi smFRET ölçümleri artık tutarlıdır. Bunun aksine, klasik modelinde belirlenen posteriors tespit smFRET verim ile tutarlıdır.

Tüm boyalar için ortalama izotropik ve / veya dinamik pozisyon varsayımı Fast-NPS her boya beş modellerden biri atanabilir hangi boya molekülü sabıkası sağlayan, tutarsızlıklara yol açar. Her model aynı erişilebilir hacmi kullanır. boya AVS hesaplanması için algoritma çeşitli varsayımlar yapar. İlk başta, fluorofor mekansal şekil bir küre ile yaklaşılır. Bu durumda, bir çapa hesabı flüorofor en wid alarakinci, boy ve kalınlıkta (Bölüm 12) kullanılmalıdır. Ayrıca, linker'ın şekli esnek bir çubuk ile yaklaşılır. Bölüm 12'de sunulan değerler, 12-Cı bağlayıcı ile bağlanmış boya Alexa 647 için hesaplanmıştır. Bugüne kadar, deneysel geometrisi verilen doğru model en uygundur önsel tespit etmek mümkün değildir, ve bu nedenle tüm modeller test edilmelidir. Hala veriler ile tutarlı olurken, genel olarak, bir, mümkün olan en küçük arka boyutunu verir modelini seçecektir. modellerin bir seçim smFRET verileri ile tutarlı olup olmadığını sınamak için, biz posterior ve olasılığını hem de hesaplar. Tutarlılık posterior alınan örneklerin% 90'dan fazla olasılığının% 95 güven aralığında olduğu anlamına gelir.

Bu doğru ise, boya moleküllerinin smFRET ağında, mesafe belirsizliği küçük, anizotropi düşük geometrik düzenlemeler de dikkate alınması gerektiğini. Bu nedenle, ise rTipik bir ilk tercihi bir iso modeli ile düşük floresan anizotropi ile boya molekülleri olan epresenting, tutarlılık testi doğru boya modelini seçmek için daha doğrudan bir araç sağlar. boya modelleri optimal seçim yerelleştirme hassas ciddi bir artışa yol ve aynı zamanda onun FRET verilerle ağın tutarlılık koruyabilirsiniz.

Özetlemek gerekirse, Fast-NPS büyük makromoleküler kompleksleri yapısal ve dinamik bilgiler kazanç sağlar. X-ışını kristalografisi veya bu nedenle büyük ölçüde karmaşık biyolojik süreçlerin mekanistik anlama genişleyen son derece esnek veya geçici kompleksleri izleme sağlar kriyo elektron mikroskopisi gibi ortak yapısal yöntemlerin aksine.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flowchamber preparation
Customized metall sample holder	self-built	n/a
quartz-glass slides, 76 mm x 26 mm	Technical Glass Products	26007
coverslips, 60 mm x 24 mm	Marienfeld	101242
detergent, Hellmanex II	Hellma	320.001
ultra-pure water from Synergy UV	Millipore	2512600
Zepto plasma cleaner	Diener	n/a
(3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a.	Sigma-Aldrich	A3648
methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa	Laysan Bio Inc.	MPEG-SVA-5000-1g
biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa	Laysan Bio Inc.	BIOTIN-PEG-SVA-5000
Sodium biocarbonate	Sigma-Aldrich	S5761 Sigma
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S2127 Sigma-Aldrich
sealing film (Nescofilm)	Fisher Scientific	12981805
Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8 mm ID, 2.4 mm OD	Saint-Gobain Performance Plastics	720958
Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical)	Fisher Scientific	12665497
Neutravidin	Life Technologies	A2666
Total internal reflection fluorescence microscope
Nd:YAG Laser, 532 nm	Newport Spectra-Physics	EXLSR-532-100-CDRH
diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso	Cobolt	904010050
diode laser 643 nm, iBeam smart	Toptica	iBEAM-SMART-640-S
dichroic mirror, 532 RDC	Chroma	F33-540
dichroic mirror, 476 RDC	Chroma	F33-476z
acousto-optic tunable filter	AA Opto-Electronic	AOTFnC-VIS
plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm	Thorlabs	LJ1703L1-A
plano-concave cylindrical, f = -300 mm	Thorlabs
prism, PS 991	Thorlabs	PS991
focusing lens, f = 75 mm	Thorlabs	LA1608-B
syringe pump, PHD 2000	Harvard Apparatus	70-2002
2 stepper motors, Z812B	Thorlabs	Z812B
piezoelectric actuator, PE4	Thorlabs	PE4
IR diode laser	Edmund Optics	CPS808	part of the autofocus system
dichroic mirror, 775 DCXR	Chroma	775 DCXR
position-sensing detector (PSD), PDP90A	Thorlabs	PDP90A	part of the autofocus system
water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2	Nikon		MRD07601
dichroic mirror, 645 DCXR	Chroma	645 DCXR	part of the emission pathway
emission filter, 3RD550-510	Omega Optical	3RD550-510	green channel in the emission pathway
emission filter, 3RD660-760	Omega Optical	3RD660-760	red channel in the emission pathway
EMCCD camera, iXon+ DU897EBV	Andor	AND-20-00032
EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV	Andor	AND-20-000141
Miscellaneous
Varian 50	Cary		UV-VIS spectrometer
Fluorolog2	SPEX		fluorescence spectrometer
Solis (V4.15)	Andor		control software for the EM-CCD camera
Apt user utility  (V1.022)	Thorlabs		control software for the piezo-motors
Norland Optical Adhesive 68	Thorlabs		adhesive
PC-AFN-0.8 Nile red	Kisker Biotech		avidin-coated fluorescent multispec beads
Matlab	Mathworks		technical computing language for custon written software
Origin (V9.0)	Originlab		scientific graphing and data analysis software
Hellma 105-202-15-40	Hellma	105-202-15-40	absorption cuvette of 1 cm path length
Hellma 105-251-15-40	Hellma	105-251-15-40	fluorescence cuvette with 3 mm path length