Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

Özet

Biz Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı readouts kullanarak protein etkileşimleri tahlil için otomatik floresans ömrü görüntüleme (Flim) kullanan açık kaynak kodlu bir yüksek içerik analizi (HCA) aleti sunuyoruz. Bu openFLIM-HCA cihaz için veri toplama yazılımı μManager yazılır ve veri analizi FLIMfit üstlenilmiştir tarafından kontrol edilir.

Özet

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in µManager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

Giriş

Tahlil bileşik kütüphanelerine ilaç keşfi ¹ otomatik yüksek içerik analizi (HCA) artan kullanımı siRNA kütüphanelerinin fenotipik ekranlar için sistematik çalışmalar, örneğin, için otomatik görüntüleme deneyleri doğru yaşam bilimleri temel araştırma trendi ile tamamlanmaktadır. Otomatik HCA ayrıca tipik olarak geleneksel mikroskoplar ile görüntülendi hücrelerin yemekleri onlarca manuel deneyler ile uygulanmakta olan daha küçük ölçekli biyolojik çalışmalar için giderek önem kazanmaktadır. Görüş alanları binlerce yüzlerce tahlil ve analiz yeteneği ile tanınan istatistiksel güç ve operatör önyargı ortadan kaldırmak ve sık sık yardımcı olabilir görüntü veri toplama ve geniş örneklem dizilerin analizi otomasyonu ( "biyolojik gürültü" dahil), deneysel gürültü ortalamasını sağlayan bu tür bir devir sırasında IRF profilinde bir değişiklik olarak, sistematik hatalar oluşumunu tespit etmek için de kullanılabilir. Floresans dayalı tahlilleryaygın olarak piyasada bulunan HCA aletleri nispi dağılım ve etiketli protein ko-lokalizasyonunu harita bir veya daha fazla spektral kanal flüoresans yoğunluğu görüntüleme özelliğine sahip olan, HCA uygulanmaktadır. Onlar protein etkileşimleri, örneğin güçlü nicel readouts, teklif olmasına rağmen böyle bir floresan ömrü görüntüleme (Flim), polarizasyon anizotropi görüntüleme ve zamana bağımlı floresan anizotropi görüntüleme gibi daha sofistike floresan görüntüleme yöntemleri, yaygın, ticari HCA aletleri istismar edilmez. Burada HCA için otomatik mikroskop flim uygulamak için bir açık kaynak yaklaşımı sunuyoruz.

Floresan süresi, farklı moleküler türler ayırt etmek ya da fluorofor lokal moleküler ortam prob ve uyarım / algılama verimliliği için, florofor konsantrasyonunun hassas olmayan kullanılabilecek bir doğal rasyometrik spektroskopik okunmasını sağlar ve scatte etkisiylehalka ve örnek emilimi ^2. floresans ömrü ölçümleri tek bir spektral kanal yapılabilir Dahası, onlar kalibrasyon olmadan farklı enstrümanlar ve örnekler arasındaki doğrudan karşılaştırılabilir. Bunlar, biyolojik süreçleri ve patolojilerin iç readouts sağlamak için bazı hücresel metabolitleri, lipidler ve hücre dışı matris bileşenleri de dahil olmak üzere, endojen fluoroforlar, uygulanabilir. Böylece etiket ücretsiz Flim hücrelerinde ^3,4 metabolik değişiklikler harita ve kök hücre farklılaşması ^5,6 ve kollajen iskeleleri ⁷ büyümesini izlemek için uygulanmıştır. Son zamanlarda FLIM HCA otoflüoresanı ⁸ kullanan hücresel metabolizmanın otomatik etiket bilgilerini deneyleri için kullanılabileceğini gösterdi. Daha genel olarak, ancak, floresans süresi ölçümleri ve FLIM genellikle Antikorların bağlanmış boyalar kullanarak, hücre bölmeleri leke boyalar kullanılarak uygulanan, belirli bir biyomoleküllerin etiket eksojen fluorophores uygulanırBelirli proteinlerine bağlanmış genetik olarak ifade florofor ile tespit hücrelerde spesifik proteinlerin hedef ya da S. Floresan süresi fiziksel ya da kimyasal bir ortam algılama flüoresan sağlam bir nicel readouts sağlamak için kullanılabilir. Örnekler için, boyalar dahil olmak üzere, sinyal molekülleri hücre konsantrasyonlarının rapor geliştirilmiştir hücre zarları ⁹ veya hücre viskozitesi ¹⁰ ve genetik olarak ifade floresan protein bazlı biyosensör lokal lipid fazın anlamda dağıtılan edilmiştir IP3 ¹¹ PIP2 ¹² ve kalpain ¹³ ya da kalsiyum ^14,15, potasyum ¹⁶ ve klorür ¹⁷ gibi iyonlar.

Bu tür birçok biyosensörler biyosensör yapısındaki değişikliklerin readouts sağlamak için Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) ^18,19 kullanmaktadır. "Donör" ve "alıcı" fluorophores arasında FRET bir kısa menzilli doğrudan dipol-dipol etkileşimi ile oluşurolan flüoroforlar, tipik olarak ~ 10 nM'nin altındadır ayrılır. Böylece FRET tespiti uygun şekilde etiketlenmiş proteinlerin yakın gösterir ve dolayısıyla bu tür bağlayıcı veya oligomerization olarak protein-protein etkileşimleri ^20, okumak için bir araç sağlar - ya canlı zaman ders ölçümlerinde sabit hücreler ya da dinamik olaylara uç noktaları olarak hücreler. Veya bölünme - - verici ve alıcı floroforlar hem uygun bir moleküler yapı etiketleyerek konformasyonel değişiklikleri okumak mümkündür FRET değişikliği yoluyla yapının ve bu birçok biyosensörler ²¹ temelini oluşturur. FRET verimliliği ölçümleri verici-alıcı mesafesi ve FRET geçiren donör fluorophores nüfus fraksiyonu hakkında bilgi verebilir. Böylece, FRET tabanlı görüntüleme teknikleri, hücre sinyal ²² süreçleri aydınlatmak için, uzay ve zamanda, örneğin moleküler etkileşimler harita ve ölçmek için kullanılabilir. otomating gibi görüntüleme teknikleri yolları veya sinyalizasyon ağları okumalanna dayalı yüksek verim deneyleri sağlayabilir.

HCA, en sık uygulanan FRET okuma donör yoğunluğu alıcısı oranında değişiklikler eşleştirilir spektral oranlı metrik görüntüleme vardır. Bu yaklaşım kolayca uygulanır iken - ve birçok piyasada mevcut multiwell plaka okuyucu mevcuttur - nicel Işıksal çözülmesi FRET ölçümleri sisteminin ²³ spektral tepki kalibrasyon gerektirir. Bu spektral boşaltma-through ve doğrudan uyarma alıcısının yanı sıra aracın şanzıman özellikleri ve örnek (iç filtre etkisi) kaynaklanan spektral çapraz konuşma içerir. Prensip olarak, bu da donör yalnızca ya da alıcı sadece ile etiketlenmiş ek "kontrol" numune ölçümü gerektirir.

Böyle spektral oranlı metrik FRET ölçümlerinden, etkili bir FRETverim (gerçek FRET verimliliği ve FRETing verici / alıcı moleküllerden fraksiyon ürünü), verici ve alıcı moleküller ²⁴ nispi oranı ile elde edilebilir. Spektral oranlı metrik FRET genellikle verici / alıcı stokiyometri bilinen kabul edilebilir unimolecular FRET biyosensörler, kullanılır. Bir doz-yanıt eğrisi elde etmek için, FRETing verici ve alıcı, örneğin toplum fraksiyonları belirlemek için, gerçek bir FRET verimliliği bilgisi gereklidir. Bilinen bu özelliklere sahip olan bir pozitif FRET kontrol örneğini ölçerek veya akseptor ışıkla ağartma ya Flim olarak, FRET etkinliğini ölçmek için farklı bir yöntem kullanılarak elde edilebilir.

floresans ömrü okumalarını kullanarak, FRET tespit edilir ve tek donör emisyon ölçümleri ile tayin edilebilir - spektral kalibrasyon ve daha fazla kontrol örnekleri ihtiyacını ortadan kaldırır. Böylece, Flim FRET readouts enstrümanlar arasında mukayese edilebilirve farklı numuneler arasında - endoskopi ya da canlı hastalık modellerinde ²⁵ tomografi sağlayan veri hücre bazlı deneyler ölçümleri ile kıyaslanabilir için. FRETing olmayan FRETing donör birikmeye tekabül eden uygun bir multi-eksponansiyel bozunma modeli verici floresans bozunma profilleri takılarak, verimlilik ve nüfus fraksiyonlar, ilke olarak, daha ölçümleri doğrudan elde edilebilir FRET. takılmasında zaman tek bir üstel bozulma modeli ve% 10 ömür boyu tespitinde bir doğruluk elde etmek için gerekli olan tipik foton yüzlerce - Bunlar önemli avantajlar, spektral çözülmesi yoğunluk görüntülemeden daha piksel başına daha tespit fotonları gerektiren Flim pahasına gelip karmaşık (çoklu eksponansiyel eksilme) modelleri uydurma floresan çürüme profilleri, tespit edilen fotonların sayısı binlerce artar gerekli. Bu, geleneksel olarak (onlarca vi alan başına saniye yüzlerce uzun kazanma zamanlan yol açmıştırew) Flim için, saati kullanarak özellikle lazer tarama mikroskopları sıralı piksel edinimi ile uygulanan tek foton sayma (TCSPC) korelasyon. önemli photobleaching ve / veya fototoksisite yol açabilir yüksek uyarma yoğunlukları kullanarak görüntüleme hızını artırmak için çalışır. Birlikte uygun piyasada mevcut enstrümantasyon ve yazılım araçları eksikliği ile, bu yüzlerce görüş alanlarına binlerce görüntülü edilecek ilaç keşif veya sistem biyolojisi için HCA kullanılan olmaktan flim engellemiştir. Lazer tarama TCSPC Flim paylaştığı hangi ile spektral oranlı metrik görüntüleme ²⁸ benzer görüntüleme hızlara ulaşabilir kararlı durum polarizasyon bağımlı floresans anizotropi görüntüleme ²⁷ ile "hit" belirlenmesi aşağıdaki ikincil ölçümler için otomatik multiwell plaka mikroskop ²⁶ uygulamaya konmuştur birçok avantaj ve dezavantajları. Floresans anisotropi görüntüleme azalma patlatırFRET mevcudiyetinde alıcısı flüoresan anizotropi ve ayrıca spektrum çapraz konuşma (alıcısı örneğin doğrudan uyarma) karşı duyarlıdır. Bu polarizasyon çapraz konuşma için hesap kalibrasyon gerektirir ve FRET verimliliği doğrudan ölçümünü sağlamaz.

HCA Flim avantajlarını gerçekleştirmek için, biz görüntü elde hızına ve teknolojiye daha geniş erişim sorunları gidermek için çalıştık. Burada, örnek FRET esaslı tahliller ile birlikte, aşağıda tarif edilmektedir otomatik hızlı Flim multiwell plaka okuyucu uygulamak için kullanılabilir açık kaynak yazılım ve donanım bileşenlerinin tam listesini sağlar. Bizim yaklaşımımız ^29, Flim nedeniyle tek ışınlı tarama TCSPC daha hızlı görüntüleme oranları ve daha düşük photobleaching sağlayabilir Şekil 1'de gösterilmiştir bir kapı optik görüntü yoğunlaştırıcı (GOI) kullanarak geniş alan zaman kapılı görüntüleme kullanarak gerçekleştirilmektedir paralel piksel içerisinde birbirineogation. Bizim openFLIM-HCA enstrüman (örneğin parlaklığına bağlı olarak) piksel başına bir kaç 100 fotonları tespit Flim verileri elde etmek için sadece birkaç saniye gerektiren, denetimsiz flim sağlayabilir. , Satın alma ayarlarını yapmak ve odak örnek korumak için, görüş önceki alanından örnek hareket ettirmek için gerekli süre ile kombine bu genellikle bakış ^25,28 alanı başına ~ ve multiwell plaka toplama zamanlarında 10 sn sonuçlanır. Optik kesit yarı-geniş alan Nipkow ( "dönen disk") Tarayıcı ³⁰ kullanılarak uygulanabilir.

Flim veri analizi için, hızla geleneksel PC iş istasyonları üzerinde multiwell plaka Flim veri setlerini analiz edebilir ve bir plug-in omero ³² için FLIMfit ³¹ adlı bir açık kaynak kodlu bir yazılım aracı geliştirdik. FLIMfit o karmaşık modellere monte edilecek Flim verileri sağlayacak (Bölüm 1.2'de ele alınmıştır) global analiz yetenekleri sağlarBu nedenle gerekli tespit fotonların sayısını, örnek ve görüntü elde etme süresi ışığa maruz azaltarak, floresan ömrü bileşenleri bir görüntü veya ilgi (ROI) bölgede değişmez olduğu varsayımı altında piksel başına bir kaç 100 fotonlar nLy. Standart bir masaüstü bilgisayarda FLIMfit Koşu, FOVs yüzlerce içeren veri setleri analiz etmek için hesaplamalı zaman saniye sadece 10s gerektirir. Böylece hem Flim veri toplama ve analiz HCA için pratik timescales üzerinde yapılabilir.

openFLIM-HCA donanım

Flim HCA Bizim uygulanması altı temel bileşenleri içerir: (i) optik otofokus ile bir floresan mikroskop çerçevesi; (Ii) motorlu (xyz) mikroskop sahne; (Iii) bir uyarım lazer kaynağı; (Iv) kapı optik yoğunlaştırıcı (GOI), gecikme jeneratör ve kamera ile bir geniş alan zaman kapılı Flim sistemi; (V) veri toplama ve analiz ve (vi) bir Nipkow disk tarayıcı için bir bilgisayaroptik kesitli görüntüleme için birim odak ışık dışarı bastırmak için. Lamelleri veya kültür ortamından sitoplazmik floresan veya arka plan katkılarıyla gömülmek olabilir hücre plazma membranında FRET biyosensörler, gelen, örneğin zayıf sinyalleri, görüntüleme Bu önemli olabilir. Zaman kapılı Flim verileri, ultra darbeli uyarma radyasyon ile örnek aydınlatıcı GOI photocathode floresan emisyonu görüntüleme ve zaman gecikmesi ayarları bir dizi için GOI fosfor CCD görüntüleri bir dizi kazanarak elde edilir uyarma bakliyat geldikten sonra optik yoğunlaştırıcı kapısı. uyarma aşağıdaki zaman kapısı gecikmesi arttıkça, floresan sinyali azaltmak için görülür ve CCD edinilen zaman kapılı floresan yoğunluğu görüntüleri serisi görüş alanında tüm fluorophores çürüme profillerini analiz etmek için gerekli olan veri seti oluşturmak . GOI yolluk uyarma darbeleri eşitlenirve CCD satın alma dizisi için, uyarılma atımlarına kadar zaman kapısı nisbetle geciktirmek istenen aralığın üzerindeki değerleri artan bir dizi olarak ayarlanır. Bu senkronizasyon bir "fast gecikme kutusu" (1 ps adımlarla 20 ns gecikmelere kadar sağlayan) ve 25 ps minimum adım gecikmeleri sağlayan bir "kaba gecikme kutusu" içermektedir gecikme jeneratörü kullanılarak elde edilir.

Flim için, uyarma bir ultra lazer ile sağlanabilir. kolaylık sağlamak için, tipik olarak uygun bir uyarım radyasyon, farklı bant geçiş filtresi olan bir motorlu filtre tekerleği kullanarak herhangi bir fluorofor için seçilebileceği görünür yelpazesinde pikosaniye darbeleri ayarlanabilir sağlayan bir fiber lazer pompalı supercontinuum kaynağı kullanır. Tipik olarak, biz 40 veya 60 MHz tekrarlama oranı darbeleri ile örnek de ~ 100-200 uW ortalama güç kullanımı. Böyle bir uyarma yetkileri de frekans iki katına dayalı ultra hızlı lazer kaynaklarından temin edilebilirmod-kilitli titanyum katkılı safir lazerler. ~ 100 ps altında bir uyarım darbe süresi en deneyler için yeterli olduğuna dikkat edin. nötr yoğunluk filtrelerle donatılmış ikinci bir motorlu filtre tekerleği uyarım yoğunluğunu ayarlamak için kullanılır. güvenlik ve rahatlık için, uyarma radyasyon bir tek modlu fiber optik ile teslim edilebilir. Geniş alan Flim optik olarak bölümlere ayrılmış Flim için yapılandırmalar, sırasıyla Şekiller 2 ve 3'te sunulmuştur. Kullanılan hassas bileşenlerin daha fazla ayrıntı için, openFLIM-HCA wiki ³³ ziyaret ediniz. Geçerli parça listesi bir kopyası Ek Malzeme verilmiştir.

geniş alan Flim için, uyarım radyasyon mümkün olduğu kadar eşit bir görünüm bütün alanını aydınlatmak için gereklidir. Bunun için dif düzlemi ile, zaman ortalama ile 10-50 Hz lazer benek döndürüldüğünde bir holografik "üst şapka" difüzör uyarma lazer ışını doğrudanIsıtıcı objektif mikroskop lens arka odak düzlemine görüntülü. mikroskop çıkış limanından floresan görüntü soğutulmuş bilimsel CCD (çip boyutu 10.2 mm x 8.3 mm) sensör üzerine görüntülü GOI photocathode ve GOI (aktif alan çapraz 18 mm) fosfor üzerine geçirilen 0.7 büyütme sağlayan kamera lensleri bir çift kullanarak kamera. Sistem RS232 protokollerini kullanarak enstrümantasyon için arabirim standart bir PC tarafından kontrol edilir. Buna ek olarak, bir çok çaba isteyen mikro işlemci CCD kamera FLIM veri edinme ve spektral filtre supercontinuum ortalama güç ölçümü için kullanılan bir fotodiyot sinyal kaydetmek için hariç kapalı uyarım ışık yolundaki bir kapı kontrol etmek için kullanılır uyarım kaynağı. optik kesitli Flim için, uyarma lazer radyasyonu s olarak, Nipkow disk tarayıcı ünitesine doğrudan bağlanan bir tek modlu kutuplaşma sürdürmek fiber optik içine bağlanmıştırhown Şekil 3'te. Nipkow tarayıcı birimden gelen çıktı floresan görüntü Goa Fotokatod üzerine geçirilen ve sistemin geri kalanı geniş alan Flim aynıdır.

openFLIM-HCA yazılım

Veri toplama yazılımı μManager ³⁴ yazılır. Otomatik ölçümler sırasında odağı korumak ve uyarma ve emisyon filtre jantlar ve dikroik değiştirici kontrol etmek için, herhangi bir FOV için zaman kursları elde etmek için, plakanın kuyu görüntülü sırayı değiştirmek için seçenekler dahil olmak üzere tam HCA veri toplama işlevselliği sağlar otomatik çok renkli görüntüleme için. Otomatik olarak yoğunluğuna dayalı olarak, örneğin kriterlerine göre, bir sonraki FLIM elde edilmesi için uygun bir FOVs konumlarını tespit etmek ve kaydetmek için floresan yoğunluğu, bir "ön tarama" satın alma çalıştırmak da mümkündür. Flim HCA verileri bir dizi olarak kaydedilebilirTIFF dosyalar, OME-TIFF dosyaları bir dizi olarak (yani, FOV başına bir) ya da bir multiwell plaka tüm verileri içeren tek bir OME-TIFF dosyası olarak. Daha fazla bilgi ve μManager yazılımı ayrıntılı bir açıklama openFLIM-HCA wiki ³³ bulunabilir.

Veri analiz yazılımı, ^31, omero görüntü veri yönetimi platformu ³² için bir açık kaynak MATLAB tabanlı istemci FLIMfit, Şekil 4'te gösterildiği gibi, bir omero sunucusundan veya bilgisayar diskten Flim verileri okuyabilir. TCSPC veya geniş alan zaman kapılı Flim araçlardan gelen verileri analiz etmek için tasarlanmıştır ve birçok yetenekleri çürüme profilleri monoexponential uydurma dahil openFLIM-HCA verileri sığdırmak için, ve gibi modelleri dahil olmak üzere üstel ve yüksek karmaşıklık çürüme profilleri, iki katına sağlar olmuştur polarizasyon bağımlı floresans çürüme profilleri. Aynı zamanda sabit ve zamanla değişen arka plan sinyalleri dikkate alabilir ve İYE olabilirlizedirler ölçülen uzay-zamansal enstrüman tepki fonksiyonu (IRF) veya zaman kaydırmalı tam deneysel IRF ölçümü belirlenen bir miktarda bir piksel akıllıca bazda olabilir idealize edilmiş bir IRF kullanarak sığabilir. IRF bir floresan örnek arasında genel bir zaman farkı (t = ₀₎ bir floresan standart bir ölçümünden tespit edilebilir. Arka plan sinyalleri ve IRF Mekansal değişimler de dikkate alınabilir. FLIMfit bir piksel akıllıca bazda Flim verileri sığdırmak mümkün ya da mütevazı (yüz) ile Flim verileri takılmasını kolaylaştırmak karmaşık çürüme modellerine numaraları foton "küresel binning" ya da "küresel uydurma" kullanıyor.

Küresel binning her zaman noktasında bir kullanıcı tanımlı ROI içinde piksel algılanan tüm fotonları toplayarak karmaşık çürüme modellerine uygun sağlamak için yeterli foton numaraları sağlamak için gerektirir. ROI görüş alanın tamamını (FOV) olabilir, d manuel olabilirKullanıcı tarafından efined ya da görüntü bölümleme araçları kullanılarak belirlenebilir. ROI ayrıca diğer görüntü segmentasyonu yazılım FLIMfit ithal maskeleri kullanılarak tanımlanabilir. FRET uygulamalarda, bir üzerine yerine takmak için daha sonra ROI genelinde mekansal değişmez olduğu varsayılır FRETing ve non-FRETing donör fluorophores karşılık gelen floresan ömrü bileşenlerini belirlemek için bir çift üstel çürüme modeline uyacak şekilde küresel binning kullanın ve yaygındır her piksel FRETing donör nüfus fraksiyonu elde etmek için sabit bu ömür boyu bileşeni vales piksel akıllıca temeli.

Genel bağlantı aynı zamanda bütün FOV- üzerinden veya çok oyuklu bir plaka deney veya floresan süresi görüntüleri bir zaman serisi, örneğin, birden fazla FOVs ihtiva olabilecek bir FLIM veri kümesi üzerinde süresi bileşenleri ve piksel-bazlı FRETing verici popülasyon fraksiyonlar montaj gerektirir. Küresel uydurma mekansal VARIATI istismar edebilirve bu nedenle daha güvenilir sonuçlar - - olsa önemli ölçüde daha fazla hesaplama ³⁵ pahasına bileşen ömrü tahmini daha güçlü kısıtlamalar sağlamak için küresel binning yaklaşımı kaybolur görüntü boyunca nüfus kesirler üzerinde. FLIMfit hızla örneğin geleneksel PC iş istasyonları üzerinde küresel montaj ile multiwell plaka Flim veri kümelerini, analiz edebilir, sadece 32 saniye gerektiren 672 x 512 piksel içeren 394 FOV her biri için beş zaman kapıları ile edinilen bir multiwell zaman kapılı Flim veri seti, ve 2 GB bellek, çift üstel çürüme modeli ³¹ sığdırmak için. Bu ayrılabilir doğrusal olmayan çok çekirdekli işlemciler ve FLIMfit kod bellek kullanımını en aza indirmek için optimize edilmiştir etkili ölçeklendirme sağlamak için okuyuculu paralel algoritmalar kullanılarak uygulanan en küçük kareler uydurma algoritması kullanılarak elde edilmiştir. Şekil 5 FLIMfit grafik kullanıcı arayüzü anlık gösterirve daha fazla ayrıntı referans global uydurma ve küresel binning 36. Ek bilgi verilen web sayfasında bulunabilir referans 31 bulunabilir.

Bizim openFLIM-HCA aletleri ve yazılım kullanılarak FLIM HCA Aşağıdaki protokol FLIM okumalarla hücre görüntüleme deneyleri geniş bir aralığı için uyarlanabilir. Genel olarak, çok oyuklu bir plaka deneyleri çalışılan koşullarına ek olarak, pozitif ve negatif bir biyolojik kontrol tekrarlanan kuyu içerecek şekilde dizayn edilmelidir FRET. Burada, optik kesit flim gerçekleştirmek için belirli bir uygulama tarif FRET kısa bir peptid bağlayıcı ile birleştirildiği mTurquoise floresan protein ve Venüs floresan protein oluşan yapıları ifade COS hücrelerinin (bakınız Şekil 3). İşte mTq32V, mTq17V ve mTq5V birlikte olmayan FRETing mTq5A inşa düşük, orta ve yüksek FRET verimliliği sağlamak (Temsilcisi Sonuçlar bölümünde ele alınmıştır) yapıları FRET.Bu yapılar ve bu protokolü takip için gerekli diğer malzemeler Malzeme Listesi'nde yer almaktadır.

Protokol

Oyuklu bir plaka dizi hazırlanması 1.

1. Referans ölçümleri t ₀ tespitine imkan vermek için etanol içinde 75 uM Kumarin 6 (τ ~ 2.43 ns) çözeltisi hazırlayın.
2. Tohum 150,000 Cos 6 gözenekli bir plakada dört kuyu içine hücre ve kültür ortamında gece boyunca birleşmeye izin (Malzeme listesine bakınız).
3. mTq5A, mTq5V, mTq17V ve mTq32V 24 st için, üreticinin talimatlarına ve kültüre göre ticari bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak iyi her biri transfekte.
4. imalatçının protokolüne göre, ticari bir tripsin / EDTA çözeltisi kullanılarak hücreleri ayırmak.
5. Daha önce, poli-L-lizin ile muamele edilmiş bir # 1.5 kalınlığında cam tabanlı 96 çukurlu bir levhanın her bir çukuruna A1-G3 içine mTq5A ifade Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde süspansiyon haline Pipet 5000 COS hücreleri. mTq5V kuyular A4 G6 içine hücreleri ifade için tekrarlayın, kuyular A10-G12 içine kuyu A5-G9 ve mTq32V içine mTq17V.
6. Boş H1 (multiwell plaka herhangi statik bir arka plan ölçümü sağlamak için) iyi bırakın.
7. HBSS Pipet 200 uL sadece iyi H2 içine (hücre kültür ortamından herhangi bir arka plan sinyali ölçümleri yapmak için).
8. Pipet HBSS 5000 transfekte hücreler, H3 içerisine (hücresel otofloresansı gelen herhangi bir arka plan sinyali ölçümleri yapmak için).
9. Iyi H4 içine 75 uM Kumarin boya çözüm Pipet 200 uL (çevre sıcaklığındaki değişiklikler veya lazer veya zamanlama devresi dalgalanmalar, örneğin multiwell plaka alımı sırasında t ₀ herhangi bir değişiklik bir kontrol sağlamak.

2. openFLIM-HCA Veri Toplama

NOT: Ayrıntılı bilgi openFLIM-HCA wiki ³³ bulunabileceği.

1. Başlangıç μManager ve OpenFLIM-HCA Eklentisi
2. gecikme jeneratör ünitesi özel kombinasyonu için kalibrasyon dosyasını seçin ve": Gecikme kutu kalibrasyon dosyası: Kalibrasyon Dosyalar Flim kontrolü" altında lazer tekrarlama oranı.
3. ": Set Temel Klasör Dosyası" veri altında kaydedileceği klasörü ayarlayın.
4. Teslimat fiber optik içine bağlantıyı sağlamak için uyarma ışın yolunu kontrol edin kararlı ve bağlanma verimliliği güç ölçer kullanılarak teslim fiberden geçirilen gücü ölçerek maksimize olduğunu. % 5 daha düşük dalgalanmalar kabul edilebilir.
5. tetikleme GOI GOI giriş tetikleme sinyali tarafından tetiklenen bir osiloskop Goa monitör çıkış sinyalini görüntüleyerek stabil olup olmadığını kontrol edin.
6. 750 V olan kazancını ayarlamak ve röle lensler birini odaklanarak, öyle ki GOI photocathode kaplayarak CCD sensör üzerine GOI fosfor görüntüleme kontrol GOI kapak olsa sızıntı nedeniyle arka plan ışığı seyrek tek foton olayların görüntüleri ( ) CCD üzerine kaydedilmiş mümkün olduğunca keskindir.
7. numune kontrol edinGörüş alanı eşit, bir lamel referans boya eriyiğinin bir damla olarak, düzgün bir floresan örnek görüntüleme GOI doymamış emin olmak için yeterince düşük bir uyarım gücü (<1 uW) kullanılarak aydınlatılır.
8. Uygun plaka tanımlama dosyasını seçin, yani 96-kuyucuğu için seçme seçeneği ( "Dosya: Yük Plakalı özellikleri").
9. ΜManager GUI kullanarak, boş bir pozisyon seçerek mikroskop çerçeve içinde hiçbir dikroik ışın ayırıcı küp olduğundan emin olun.
10. El ile tüm deney için Goa 4 ns kapı genişliğini seçin.
11. IRF görüntü verilerini elde:
    1. ΜManager GUI kullanarak, boş bir pozisyon seçerek ışın yolunda hiçbir mikroskop objektif olduğundan emin olun. El ile geri mikroskop çerçevesinin içine herhangi bir yansıma en aza indirmek için herhangi bir lazer ışığı önceleniminin ve açı önlemek için objektif taret üzerinde siyah bir anodize ışın blok yerleştirin.
    2. μManager GUI kullanarak, eğirme Nipkow diskten dağınık uyarma ışık fraksiyon görüntülü fakat yoğunluğu, 200 sistem doyurmak için yeterli olmadığından emin olabilir, öyle ki CSUX (eksitasyon, Dichroic, Emisyon) filtreler ayarlamak ms CCD entegrasyon süresi. Bu photocathode zarar verebilecek çok fazla ışık, için GOI photocathode maruz kalmasını önlemek için olduğunu.
    3. Programlanabilir hızlı gecikme kutusunun kapsadığı gecikmeler tam aralığında Bul MaxPoint işlevini kullanın. Görüntülenen çıkış şemasını kontrol edin ve daha sonra tam IRF profilini hızlı gecikme kutusunun tarama aralığında olacak şekilde ileri tuşuna basarak manuel ders gecikme kutusunu ayarlayın.
    4. Satın alma parametrelerini (Nötr yoğunluk, Pozlama süresi, Çerçeve birikmesi) bu yüzden CCD parlak zaman kapısı doymuş değildir ve etkili entegrasyon süresi> 200 ms ayarlayın.
    5. Tam gecikme yüzünden 25 ps Set gecikme adımları çaldıe ( "Flim kontrolü: Hızlı gecikme kutusu: gecikmeleri doldurmak").
    6. "Yakala Flim görüntü" tuşuna basarak IRF görüntü kazanır.
    7. Lazer bloke ederek bir arka plan görüntüsü Edinme ( "Işıklı kontrolü: Nötr yoğunluk: bloke"), gecikmeler numarası ( "Flim kontrolü: Hızlı gecikme kutusu: Cari gecikme ayarı (ps)") azaltarak, değişmeden tüm diğer özelliklerini bırakın ve basın "Yakala Flim görüntü".
12. referans boya veri elde:
    1. Iyi μManager GUI kullanarak H4 seçin ( "XYZ kontrolü: iyi git: H4").
    2. MTqFP görüntüleme için μManager GUI seçin filtreler (Uyarım 434/17 nm, dichroic, Emisyon 482/25 nm) kullanılarak.
    3. Hızlı gecikme kutusunun tam aralığında Bul MaxPoint işlevini kullanın ve tam çürüme profili hızlı gecikme kutusunun gecikme aralığında böylece daha sonra kaba gecikme kutusunu ayarlayın.
    4. gecikmesini ayarlayın": Hızlı gecikme kutusu: Cari gecikme ayarı (ps) Flim kontrolü" değiştirerek maksimum yoğunluk noktasına. CCD doymuş olmayacak şekilde satın alma parametrelerini (Nötr yoğunluk, Pozlama süresi) ayarlayın.
    5. Tam gecikme aralığında 25 ps ayarlanan gecikme aşamaları ( "Flim kontrolü: Hızlı gecikme kutusu: gecikmeleri doldurmak).
    6. "Yakala Flim görüntü" tuşuna basarak referans boya veri elde.
    7. uyarma lazer bloke ederek ikinci bir arka plan CCD kamera görüntü elde (2.11.7 bakınız)
13. ΜManager tedarik yazılımı kullanılarak multiwell plaka örnek Flim veri elde:
    1. Kuyular görüntülü olmalıdır set ve FOV sayısı kuyunun ( ": XYZ pozisyonları Kur HCA sıralı edinme") başına elde edilecek.
    2. El ile numuneyi içeren bir örnek FOV görüntülenmiş seçin. Goa optimal nötral yoğunluk filtresi, kapı genişliğini belirlemek için bu FOV kullanın veKameranın entegrasyon süresi CCD kamera dinamik aralığının% 75 ulaşacak şekilde.
    3. Set otomatik odaklama ( "XYZ kontrolü: Otomatik odak"): Basın "Return odak kontrolü sadece" ve daha sonra elle hücrelerin veya ilgi yapısına odaklanmak. 2000 mikron ve "Enter" ile "Otomatik odaklama arama aralığı" olarak ayarlayın. Basın "AF şimdi" bir otofokus prosedürünü başlatmak için. Bir ofset değeri alanına "FocusOffset (Otomatik odak)" görünecektir.
    4. Otofokus sisteminin doğru çalışmasını gösteren "AF offset" içine 2.13.3 elde edilen ofset değeri girin ve ofset değeri şimdi sıfır olduğunu kontrol etmek için ( "AF artık") iki kez otofokus işlemi tekrarlayın.
    5. Gecikme noktaları logaritmik örnekleme seçmek için OpenFLIM-HCA edinme yazılımında "autogate" işlevini kullanın. Alternatif olarak, bu elle seçilebilir, bkz bkzDaha fazla bilgi için 36 rüler.
    6. Verimleri toplam veri toplama süresini arzu bir değere "Accum Çerçeveler" olarak ayarlayın. biriken kare sayısını arttırmak da artmaktadır toplam FLIM veri toplama zamanı pahasına FLIM veri sinyal gürültü oranını arttırır.
    7. "HCA dizisi başlat" düğmesine basarak multiwell plaka Flim edinimini çalıştırın.
14. Flim veri toplama için kullanıldığı gibi aynı alım ayarları ile uyarma lazer (2.11.7 bakınız) bloke ederek başka bir arka plan CCD kamera görüntü kazanır.

3. openFLIM-HCA Veri Analizi FLIMfit kullanılması

1. Flim veri analizi için gerekli yardımcı dosyalar mevcut olup olmadığını kontrol edin (yani, IRF ve referans boya ölçümü).
2. Boş oyuk (H1) veri yüklemek iyi ihtiva eden kültür ortamı (H2) ve kültür ortamı içinde de ihtiva etiketlenmemiş hücreleri (H3) FLIMfit halinde( "Dosya: Yük Flim verileri") kuyu A1-G3, yani "donör sadece" ifade eden hücrelerden daha büyük% 1 sinyalinin arka plan katkıları olup olmadığını kontrol etmek için.
3. ( ": Yük Flim verileri Dosya") FLIMfit içine iyice kültürü ile orta yükleyerek bir zaman içinde değişen arka plan (TVB) dosyası hazırlayın. Bölüm 2.14 edinilen kamera arka plan verileri yüklemek ( "Arka Plan: Yük Arka Plan") ve FLIMfit seçeneği "Araçlar: TVB Şiddeti Harita oluştur" kullanımı TVB oluşturmak için. TVB ilgili daha fazla ayrıntı için 31 başvuru bakın.
4. bölüm 2.11 edinilen IRF verilerini yükleyerek mekansal değişen IRF Shift Harita hazırlayın ve bölüm 2.11.7 edinilen CCD kamera arka plan çıkarın. FLIMfit seçeneği "Araçlar: IRF oluştur Harita Shift" kullanın mekansal IRF Harita Shift değişen hesaplamak için. IRF Shift Haritada daha fazla detay için referans [31] Bkz.
5. Bir monoexponen Fitbölüm 2.12 elde edilen referans boya verilerine tial çürüme. Yük referans boya ve bölüm 3.4 hesaplanan mekansal değişen IRF Haritası, set uygun parametreler ( "Ömrü: Hayır Uzm: 1") ile donatılmış bir parametre olarak t ₀ set ( "Ömrü: FIT IRF Shift: Gömme"). T elde ₀ değeri daha sonra "Parametreler" sekmesinde gösterilen tabloda belirtilmiştir.
6. Bölüm 2.13 edinilen deneysel Flim verileri yükleyerek Flim verileri analiz, mekansal değişen IRF Harita bölüm 3.4 hesaplanan, bölüm 2.14 edinilen kamera arka plan, TVB dosyası elde t ₀ negatif değer bölüm 3.3 ve tip olarak hazırlanan bölüm 3.5 ( "IRF: IRF kayması: t _0"). Daha sonra deney şartlarına göre FLIMfit ³⁶ kullanarak istenen bozunma modeli deneysel verileri uygun.

Sonuçlar

openFLIM-HCA enstrümantasyon yeteneklerini göstermek için, biz üç örnek FRET uygulamaları sunuyoruz. İlki Stephen Vogel laboratuvarında ³⁸ tarafından geliştirilen FRET modeli yapılarından uyarlanmıştır yapıları FRET. Bir donör floresan proteini (mTurquoise) 5, 17 ve 32 amino asitlik (mTq5V, mTq17V, mTq32V) kısa kontrol uzunlukları ile bir akseptör-floroforu (Venüs) ile bağlantılı olan genetik olarak eksprese flüoresan yapılarının bir dizi ihtiva eder. verici ve alıcı fluorophores arasında farklı bağlayıcı uzunlukları farklı FRET verimlilikleri ve bu nedenle farklı donör ömürleri neden olur. Bir negatif kontrol sağlamak için, kısa bir 5 L-amino asit bağlayıcı yapısına Venüs Amber ile değiştirilir - FRET alıcısı ^38, hareket edemez YFP bir floresan olmayan bir mutasyon (mTq5A). Bu vect sindirilmesi sınırlama orjinal pCXV ve pC5A vektörlerinde Cerulean ikameNhel ve Bglll enzimleri ve bağlanması mTurquoise fragmanları ile ORS pmTurquoise-N1 vektörü aynı enzimler kullanılarak sindirilmiş. bağlayıcı bölge Bu ikame ile modifiye edilmemiş olan.

Şekil 6, bir örnek FLIM çok oyuklu bir plaka 3 sütunlu dizilmiş olduğu COS hücrelerinde ifade edilen, bu model sistemi kullanarak tahlil FRET sunulur negatif kontrol ile transfekte edilmiş hücrelerin her biri (sütunlar 1-3), 5-amino asit bağlayıcı yapısına FRET (sütun 4-6), 17-amino asit bağlayıcı (sütun 7-9) ve 32 amino asit bağlayıcı yapısına (sütun 10-12) oluşturmak Dekupaj. Ham H TVS tahmini için kuyu içerir. Şekil 6 (a) her bakış tipik alanların otomatik olarak elde edilen floresans ömrü görüntüleri örneklerini göstermektedir. Negatif kontrol (kolonlar 1-3) uzun ömürleri mevcut olduğu açıktır ve donör ömrü olduğu FRET için en düşük kısa bağlayıcı len ile inşagth (sütunlar 4-6). Şekil 6 (b) 'de, çok oyuklu plaka üzerinde değişen ortalama süresi, her tüm FOVs üzerinden ortalaması gösterilmiştir. 6 (c) ve (d) sırası mTq5A ve mTq17V bir FOV için örnek verici floresan yoğunluğu birleştirilmiş süresi haritaları gösterir Şekil. Şekil 6 (e) donör floresan yoğunluğu çürüme profili birlikte monoexponential çürüme modeli ve (GOI kapı genişliği hakimdir) IRF için uyum ile A1 iyi imaged tüm hücrelere üzerinde ortalama gösterir. Şekil 6, (f), bir piksel-bazlı monoexponential uyum elde çukurlu plakanın her sütun için ortalama floresans kullanım sunulur. Ortalama ömrü ve standart sapma (STD) bir tablo aşağıda Tablo 1'de bulunabilir. Şekil 6'da gösterilen görüntü elde etmek için veri elde etme elde etmek için, yaklaşık 160 dakika sürdü. analizi 10 çekirdek ve 64 G ile 2.6 GHz bilgisayarda 92 saniye süredeRAM B.

İkinci örnek deney bu işlem ^25,42 inhibitörlerini test etmek için bir araç olarak, HİV-1 virionlar montajı sırasında, HIV-1 Gag oligomerizasyonuna okumak için FLIM FRET uygulanmasını göstermektedir. HIV-1 virionlar olgunlaşmamış benzer virüs benzeri partiküller (VLP'ler) oluşumuna yol açtığından, uygun konakçı hücrelerde ifade HIV-1 Gag, HIV-1 yaşam çevriminin bu aşamasında için bir model sistemi sağlar. Bu tahlil için, HIV-1 Gag proteini HeLa hücrelerinde CFP ile birleştirilir ve gag oligomerizasyon sonucu FRET sinyali üzerindeki etkileri ile, farklı inhibitörlerinin etki göre ifade edilmiştir. kullanılan inhibitörlerinin ayrıntıları referans 42'de sağlanmaktadır.

numune hazırlama ve deneysel ölçümlerin ayrıntılarını biz bo okumak için flim kullanabilirsiniz gösterdi referans 25, kapsamlı olarak tarif edilmiştirOBP ve YFP ile stokastik olarak etiketlenmiş ve ayrıca CFP ile etiketlenmiş tek Gag ifade eden hücrelerde homoFRET Gag proteinleri bir araya arasında inci heteroFRET. HomoFRET genellikle donör ömür boyu bir değişiklik sunmaz rağmen, florofor farklı ortalama floresan ömürleri ^40,41 ile iki izomer var OBP özel durum için yapar. CFP homo-FRET okuma OBP / YFP hetero-FRET karşılaştırıldığında basitleştirilmiş numune hazırlama avantajları vardır ve çoğullamalı FRET okumalarla için önemli olabilir, hangi verimli daha spektral olduğunu.

Daha önceki çalışma FLIM bir N-miristoil transferaza (NMT) ⁴² inhibitörün mevcudiyetinde Gag oligomerizasyon tahlil FRET uygulanır. Bu inhibitör plazma zarına bağlanma Gag proteinleri sağlar ve HIV viryonlarının ya oluşumunda bir ön ^43, gag miristik asit, ilave sorumlu endojen enzimleri bozanVLP'ler. İkimiz de heteroFRET ve homoFRET readouts bir NMT inhibitörü ile doz yanıt çalışmalarında> 0.6 Z 'elde edebiliriz gösterdi. > 0.5 - Z ', Z bir deneyin kalitesini belirtmesi için, farmasötik endüstrisinde kullanılan bir parametredir ve analiz kalitesinde bir tek değer ölçüm oluşturmak için pozitif ve negatif kontroller ortalama değerleri ve nispi mamullerinde farklılıklar gösteren " bir ilaç tahlil ⁴⁴ için "mükemmel" olarak kabul ediliyor. Biz bu mükemmel performans ortalama donör ömür boyu değişim 300 ps düzenin olduğu için numuneler ile elde edildi unutmayın - kullanışlı readouts sağlayan hücrelerin çok sayıda için Flim verileri analiz istatistiksel gücünü gösteren gerçekleşmesi çok daha küçük kullanarak kılavuzu mikroskopi deneylerinde görüntülü hücreler tipik numaraları ile mümkün olandan floresans boyunca değişir.

Burada, çok oyuklu bir plaka FLIM HIV gag oligomerizasyonu mümkün 4 inhibitörü bileşikleri (tayin ICL13, ICL14, ICL15 ve ICL16) karşılaştırma veri seti FRET sunuyoruz. Bu deney için, biz geçici gag-CFP plazmid ile transfekte edilmiş HeLa hücreleri ile homoFRET okuma kullanılır. Her inhibitörü dokuz farklı dozlarda toplam koşulu başına iki tekrar kuyu izin referans 32 özetlenen standart protokol takip uygulanmıştır. Bir pozitif kontrol olarak, kolon 1 MYR-gag, VLP'lerini oluşturmaktadır ve bu nedenle, toplam inhibisyonunu taklit edilemez miristik asit yanmından yoksun mutasyona uğramış bir Gag proteini eksprese eden hücreler sunulur. Bir negatif kontrol sadece diğer sütunlar (sütun 11) önleyicileri teslim etmek için kullanılan, sadece araç ile gag-CFP eksprese dozaj hücreler tarafından sağlandı. Sekiz FOV toplam oyuk başına elde edildi.

Veriler piksel-piksel bazında tek bir üstel çürüme modeli ve floresan ömrü plat takıldı(görünüm sekiz alanlar arasında yoğunluğu eşiğin üzerinde tüm pikseller üzerinde) oyuk başına ortalama ömrünü gösteren e haritası Şekil 7'de aşağıda gösterilmiştir: (a). Şekil 7 (b) inhibitör konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak floresans ömrü mukabil grafiğini göstermektedir. Gag-CFP ifade eden hücreler ile inkübe önleyicileri üç önleyici bir etkiye sahiptir (ICL13, ICL15 ve ICL16) göstermektedir. Bir inhibitörü (ICL14) test Herhangi bir dozda etkisini göstermektedir. Bu plaka için hesaplanan Z ', 0.51 idi. Pozitif ve negatif kontroller için elde edilen değerler, Şekil 7 gösterilmiştir, (b), 100 uM siyah ve 0.1 nM noktalar olarak.

Şekilde gösterildiği ICL13, ICL15 ve ICL16 için doz tepki eğrileri, 7 (b) daha sonra, sabit maksimum ve minimum yaşam süreleri ile 1: ⁴⁵ sabitlenmiş Hill katsayısı 4 parametreli lojistik doğrusal olmayan regresyon modeline oturtuldupozitif (sütun 1) ve negatif (kolon 11) elde edilen değerler, sırasıyla kontrol eder. Üç eğriler için döndü _IC50 değerleri daha sonra vardı: 38 nM, 24 nM ve 116 nM ICL13, ICL15 ve ICL16 sırasıyla. Hücre içi Flim elde edilen _IC50 değerleri ile karşılaştırma için ölçümler FRET, bizim daha önce rapor biyokimyasal enzim deneyinde ⁴² rekombinant insan NMT1 enzimatik etkinliğinin engellenmesi için _IC50 belirlenmiştir. FLIM FRET aktif olduğu bulunan üç bileşikler, bu deneyde en aktif olan (IC 17 nM, 51 nM, sırasıyla ICL13, ICL15 ve ICL16, 39 _{nM, 50} değerleri) ICL14 ile, belirgin bir tepki gösterdi FLIM FRET deneyinde, olan yaklaşık NMT1 (1700 nM _IC50) karşısında daha az aktif, 100 kat. Aktif bileşikler için, bu bağımsız tahlil yöntemlerinin yoluyla elde _IC50 değerleri d olasılıkla atfedilebilecek küçük değişikliklerle, oldukça benzer olanalımı veya hücrelerde bileşiğin metabolizmasında ifferences.

Bu küçük çalışma ilgi aynı hedefe hareket farklı bileşiklerin gücünü ayırımcılık Flim HCA yeteneğini vurgulamaktadır. Bu çoklu doz tepki eğrilerini oluşturmak için yüksek içerik bağlamda otomatik flim kullanarak bir ekranın ilk gösteri ve ekranda uygulanabilir ve / veya yararlı terapötik bileşiklerin karakterize edilmesi Flim potansiyelini göstermektedir inanıyoruz.

Üçüncü örnek FLIM FRET deneyi cAMP spesifik olarak bağlanan bir Rep-1 guanin değişim faktörü olan siklik adenozin monofosfat (cAMP (EPAC)), aktive Değişim protein için bir genetik olarak ifade FRET biyosensör ile ilgilidir. Bu EPAC FRET biyosensör (EPAC-S ^H188) donör flüorofor olarak mTurquoise2 floresan proteini (mTq2FP) kullanan ve bir co uygulamak için iki Venüs-FP birleştiriralıcısını ⁴⁶ mposite. Oluşturulan CAMP, bir yerde, ikinci haberci ve bir çok farklı organizma içinde hücre içi işlemlerin bir bolluk yer almaktadır. Bu hücre membranında ATP dönüşüm adenilat siklaz sentezlenir. Burada okunur ve forskolin, cAMP nin intraselüler üretimini yukarı doğru düzenleyen ve dolayısıyla, sitoplazmik konsantrasyonunu arttıran bir adenilat siklaz aktivatörü ilave edildikten sonra canlı HEK293T hücrelerde etkinliği ölçmek için yeteneğini göstermektedir. cAMP biyosensör açıklığına götüren bu EPAC sensör onun inaktive (bağlanmamış) devlet FRET ve cAMP konsantrasyonu ile donör ömrü artar uğrar. MTq2FP mono-üstel bozunma profili CFP tabanlı biyosensörler ⁴⁵ daha kantitatif ömür boyu analizi için bu biyosensör daha uygun hale getirir. Biz değişim çizilen nerede Şekil 8 otomatik multiwell plaka Flim mikroskop kullanılarak kaydedilen bir zaman elbette bir örneğini göstermektedirortalama ömrü ve 100 uM forskolin ilave edildikten sonra zaman içinde FRETing donör popülasyon fraksiyonu değişim. Kolaylık sağlamak için, toplam sinyal zaman serisi boyunca çift üstel bozunma profil eğriye yerleştirilmesiyle elde edilmiştir monoexponential FRETing olmayan FRETing donör ve aktive EPAC FRET biyosensör popülasyon fraksiyonu içeren bir karışım ile tarif edilebilir olduğu varsayılmaktadır.

4.000 ps bir kapı genişliği ile cAMP (EPAC) beş kapı gecikmeler veri toplama, için, 1.300 ps, ​​4,300 PS (tepe yoğunluğu), 4919 ps, 6656 ps, 8035 ps, 1 ayarlanmış gecikme süresi ile seçildi, 0391 ps ve 16.000 ps. Her gecikme için kamera entegrasyonu süresi 250 ms idi. birinde de, biz 10 dakika boyunca her 10 sn edinilen görüntüleri ile bir Flim zaman kurs aldı. forskolin eklenmesi bunun örnek odak konumunda küçük bir kaymaya neden çünkü bazen 120 s ve 130 s edindiği veri noktaları kaldırıldıBu zaman noktalarında, FLIM satın alma sırasında kaydedilen floresan yoğunluğunun örn.

Veri analizi için resim FLIMfit yüklendi ve tekrar hücre başına bölümlere. Floresans ömrü verileri IRF kullanılarak çift üstel bozunma modeli ve bir referans boya (75 uM Kumarin 6) elde edilen sabit bir t, ₀ değerine takıldı. Donör floresans Şekil 8'de gösterilmiştir süresi tüm hücreleri üzerinde ortalaması anlamına: (a). Şekil 8 (b) Aynı çift üstel bozunma modeli aynı FLIM uyarlanması suretiyle hesaplanmıştır zaman FRETing popülasyon fraksiyonu değişikliği göstermektedir

nerede β FRETing donör bölümüdür. Biz FRETing olmayan FRETing Eleme bir karışımını kabulforskolin ilave edilmeden önce zaman noktaları için NTS. Bu ömürleri elde etmek için, bir çift üstel uyum FRETing donör olmayan FRETing donör için ₁ = 3964 ± 21 ps τ ve ömürleri veren ilk üç kez noktalarına uygulanan ve τ ₂ = 3022 ± 27 ps oldu. Bunlar, her bir zaman noktasında β değerlerini elde etmek için ayarlanmış tüm verilerin daha sonra bir uyum için sabitlendi.

Özetle, biz üç deney numuneleri için örnek Flim HCA sonuçlarını sundu. İlk FRET Venus AP alıcı Amber peptit bağlayıcı uzunlukları değiştirilerek yapı olmayan bir floresan ya da işlevsel şekilde bağlanmış bir mTqFP verici içeren yapılar ifade eden COS hücrelerinin birlikte dizilmiş 96 oyuklu bir plaka oldu. Bağlayıcı uzunluğu ile FRET nedenle verimlilik ve donör ömür boyu değişim açıkça görülmektedir ve her yapı için ortalama ömrü standart sapması az 36 ps oldu. İkinci örnek assay% inhibisyon OBP ile etiketlenmiş Gag proteini ifade Hela hücrelerinde ölçülen inhibitör konsantrasyonu ile ortalama donör floresan ömrü değişimi hesaplandı olan HIV Gag proteininin miristoillenmesi için dört potansiyel inhibitörleri "ekran" oldu. Bu okuma genellikle donör ömür boyu bir değişiklik mevcut ama bu farklı floresan yaşamlarda ile birden izomerler varolduğundan CFP için yaptığı olmaz homoFRET dayanmaktadır. Bu birkaç katlı farklı FRET okumalar ²⁵ için spektral verimliliği, ör açısından yararlı olabilir. Üçüncü örnek tahlil cAMP FRET biyosensör, EPAC ifade canlı HEK293T hücreleri izleme bir zaman ders oldu. Daha önce LIBRA FRET Biosen ile gösterdiği gibi - Bu forskolin ile tedavi ve canlı hücre görüntüleme ile orantılı olarak tespit edilen fotonların sayısı ile bir çift üstel bozunma modelini kullanarak FLIMfit sürüldükten sonra beklenen tepki gösterdiIP3 ⁴⁷ için Sor.

Bir kapı optik görüntü yoğunlaştırıcı (GOI) kullanılarak geniş alan zaman kapılı Flim Şekil 1. şematik. Sol taraftaki deney sisteminin şemasını göstermektedir. Üst sağ uyarma darbe şematik, zaman kapılı görüntüleri ve verilere monoexponential uyum konumu. deneysel sistem gösterilen iki nesnelerden floresan çürümesine gösteren alt sağ, karikatür. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bir kapı optik görüntü yoğunlaştırıcı (GOI) kullanılarak geniş alan openFLIM-HCA Şekil 2. şematik. daha ayrıntılı bilgi için ana metne bakınızsistem bileşenleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3. şematik optik bir Nipkow disk tarayıcı ünitesi ile bir kapı optik görüntü yoğunlaştırıcı (GOI) kullanarak openFLIM-HCA kesitli. sistem bileşenlerinin daha ayrıntılı bilgi için ana metne bakınız. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yönetici edinme programından görüntü veri akışı Şekil 4. şematik analizi için sunucu ya da bilgisayar diski ve FLIMfit içine omero için. Veri akışı üst l başlar ham görüntü verisi μ-Yönetici alım yazılımında elde edilir eft köşe. dışındakilere veri toplama ve depolama karşılık ise kesik kutu içinde öğeleri, Flim veri analizi aşamalarını temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

FLIMfit kullanıcı arayüzü Şekil 5. ekran görüntüsü. Üst sol görüş alanlarının listesi şu anda yüklenmiş ve bakış Seçili alanın floresan yoğunluğu görüntüsü. Sol alt, uydurma model ve uydurma koşulların seçimi. verilere uygun Üst sağ, faiz (mavi daireler) mevcut bölge için floresan çürüme, (kırmızı çizgi), IRF aşağıda fit artıklar (mavi çizgi) ile (kırmızı kesikli çizgi).g5large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

FRET modeli Şekil 6 çukurlu bir levha FLIM mTq5V, mTq17V, mTq32V COS hücrelerinde ifade oluşturur. (A) her biri FOV örnek floresans ömrü ve görüntüler de için metinde anlatıldığı gibi COS hücrelerinde ifade edilen farklı bir FRET yapıları. (B) ortalama Venüs floresan yaşamların ısı haritası her bir tüm hücreleri üzerinde ortalama. MTurquoise Amber (c) yoğunluk görüntü ömür boyu harita (ölçek çubuğu 20 mikron) ile kaplanmış. MTurquoise Venüs (17 amino asit) (d) yoğunluk görüntü ömür boyu harita (ölçek çubuğu 20 mikron) ile kaplanmış. (E) mTq5A ölçülen yoğunluğu bozunma profil (mavi daireler) (negatif kontrol) oluşturmak floresan Aynı görüntülenmiştir tüm hücrelere üzerinden ortalaması1, birlikte monoexponential çürümeye verilerin uyum (mavi düz çizgi) ve IRF (kesikli turuncu çizgi) ile. (F) ortalama ömrü grafiği bakış alanları arasındaki floresan ömür boyu standart sapmayı gösteren hata barları ile, multiwell plaka üzerinde her sütunun üzerinde ortalaması. (Reklam) ömür boyu değerleri piko belirtilen limitler ile sahte renk skalası kullanılarak temsil edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Gag-CFP ifade HeLa hücrelerini kullanarak Gag inhibitörlerinin Şekil 7. Exemplar multiwell plaka Flim ekranı. Çukurlu levha oyuk başına ortalama donör floresans ömrü (a) Isı haritası Ready olarak MYR-gag-CFP ile transfekte Sütun 1 hücreler ile dizilmiş inhibisyonu e kontrolü, gag-CFP transfekte sunan hücreler Sütun 11, sadece aracın maruz bırakıldı ve düşük doz sütun 10, yüksek doz sütun 2 arasında değişen konsantrasyonları ile, dört farklı inhibitörlerinin biri ile dozlanmıştır kuyu belirten kesikli renkli kareler . yanlış renk skalası 2200 ps den 3.100 ps kadar ortalama floresan ömrünü temsil eder. Her hata çubukları tekrar kuyuları arasındaki standart sapmayı gösteren inhibitörü (b) floresan ömrünü çizer. Yatay eksende 2 ve -4 siyah noktalar, sırasıyla kolon 1 ve 11 ile elde edilen pozitif ve negatif kontrol noktalarıdır. düz çizgiler, farklı inhibitörleri için doz-yanıt eğrisi verileri bir uyum göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 8 "src =" / files / ftp_upload / 55119 / 55119fig8.jpg "/>
HEK293T hücrelerini kullanarak bir time-lapse ölçümünde EPAC FRET biyosensör okumak için Flim 8. Exemplar kullanımını rakam. (A) floresans kullanım ömrü ve yeşil bir çubuk ile gösterilen forskolin ilave edilmesinden sonra, zamanın bir fonksiyonu olarak FRETing verici, (b) oranı anlamına değişim. Hata çubukları hücre başına standart hata gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

	oyuk başına	STD	ERR			oyuk başına	STD	ERR
mT5A	4008	32	12		MT17V	3004	26	10
mT5V	2717	35	13		mT32V	3133	30	11

FRET yapıları Tablo 1. Ortalama ömrü ve standart sapma (STD).

Tartışmalar

Biz zaman kapılı flim kullanarak HCA için tasarlanmış bir otomatik multiwell plaka mikroskobu tarif var. Bu alet FLIMfit ^36, açık kaynak kodlu bir programı, bir omero istemcisi ³² μManager enstrüman olarak MatLab yazılmıştır ve mevcut kullanarak üstlenilen bir omero sunucusu ve Flim veri analizi için veri kaydetme seçeneği ile μManager yazılmış açık kaynak yazılımı kullanılarak kontrol edilir kontrol yazılımı, openFLIM-HCA, kendi Flim HCA aletleri oluşturmak için akademik araştırmacılar etkinleştirmek için sistem bileşenlerinin ⁴⁸ bir liste ile ³³ online olarak kullanılabilir.

Sağlam Flim verileri elde etmek amacıyla, GOI ve CCD edinme ayarlarını optimize etmek için ve t ₀ oluşabilecek değişiklikleri dikkate almak gerekmektedir. 3.8.2 açıklandığı gibi, GOI kazanç ayarı ve CCD kamera entegrasyon süresi ~ CCD dinamik aralık% 75 ulaşmak için ayarlanmalıdır. UHer zaman kapısı gecikme daha yüksek GOI gerilim ve çoklu CCD çerçeve birikimleri şarkı gürültü oranı ⁴⁹ sinyal artırır ancak bu daha az floresan fotonlar CCD kamera Doymuş ve çerçeve birikimleri bu yüzden numarasından önce kare başına elde edilen bu yana toplam Flim toplama süresini (artar yükseltilmelidir) ve böylece bu değiş tokuş her bir deney için belirlenmelidir. Gecikme jeneratör kalibrasyon lazer tekrarlama oranı bağlıdır ve kullanılan tekrarlanma oranının doğru kalibrasyon dosyası elde etme yazılımı yüklenir sağlamak için gereklidir. Gecikme kutusu kalibre edilmesi için prosedür openFLIM-HCA wiki ³³ bulunabilir.

Hücresel otofloresan floresan sinyali ile karşılaştırıldığında düşük durumunda, zamana göre değişen bir arka plan (TVS) temin etmek üzere iyi olarak ihtiva eden, sadece kültür ortamından sinyali kullanılır. Hücre kültür ortamından arka floresan en aza indirmek için, bilmekfenol kırmızısı içeren medya. Hücresel otofloresansı önemli ise, TVS etiketlenmemiş hücrelerden ölçümlerinden elde edilebilir. Bu otofloresans arka plan görüntüdeki her piksel için aynı olduğunu varsayar Ancak, bu durumda bakım, alınmalıdır. otofloresans bir hücrenin üzerinde veya uyarma kiriş veya algılama hassasiyeti görüş alanı üzerinde üniforma değilse önemli ölçüde değişir, bu varsayım geçerli olmayacaktır.

dağınık uyarma ışık darbeleri kullanarak bir IRF görüntüsünün elde edilmesi uydurma sürecinde veri modeli ile convolved olan zamansal IRF profili sağlar ve aynı zamanda görüş alanının karşısında IRF mekansal değişimi bir harita sağlar. IRF Nipkow diski IRF temiz bir ölçüm sağlar saçılan uyarma ışık kullanılarak, bizim enstrüman, bir koloidal süspansiyon, ancak bir saçılma örnek görüntüleme ile ölçülebilir. Zamanlama o doğru belirlenmesiuyarma ve zaman yolluk arasındaki zaman gecikmesi hataları önemli ölçüde uydurma sürecini etkileyebilir çünkü f IRF, önemli olan özellikle karmaşık üstel bozunma modelleri uydurma. IRF IRF uzaysal değişimini aynı olmalıdır, ancak zamanlaması etkileyebilir Bu uyarma dalga boyunda yerine floresans emisyon dalga boyunda kaydedildi için uygun işlem için gerekli olan tam olarak hangi dağınık uyarma ışık kullanılarak elde edilen Her iki dalga boyu. optik kesitli Flim içinde Nipkow diskten edilen IRF olduğu gibi ek olarak, dağınık IRF küresel nedeniyle saçılma nesneden farklılaşan optik yol uzunluğu gerçek IRF zaman göreceli olarak kaydırılmış olabilir. Protoc belirtildiği şekilde elde edilen dağılmış uyarım ışık IRF uygulanmalıdır gerekli genel zamansal kayması Bu düzeltme, t = _0,, monoexponential referans boya verilerinden hesaplanmaktadırol adımı 4.4. Aşağıdaki boya farklı uyarma dalga boyları için kullanılabilir: metanol içinde 75 uM Kumarin 153 çözeltisi (τ ~ 4.3 NS ⁵⁰⁾ aralığı 295-442 nm uyarım için kullanılabilir; etanol içinde 75 uM Kumarin 6 solüsyonu (τ ~ 2.43 ns ³⁷⁾ aralığı 430-500 nm uyarım için kullanılabilir; ve su içinde 75 uM Rodamin B çözeltisi (T ~ 1.7 NS ³⁷⁾ aralığı 488-575 nm eksitasyon için kullanılabilir. Sistemin her bir piksel için farklı bir IRF kullanmak FLIMfit mümkün olmasına rağmen biz, unutmayın, genellikle mekansal değişen IRF görüntüdeki her piksel için aynı zamansal profile sahip olduğu varsayımı yapmak makul ama bir dizi sunuyor uzamsal olarak küresel t ₀ göreli zamansal uzaklıklar değişen. Biz dağınık ışık IRF belirlenir IRF vardiya haritası olarak bu tarif. Birlikte, IRF profili, t ₀ ve IRF vardiya haritası tr için kullanılırFOV her piksel, uygun bir IRF ile donatılmış olduğundan emin olun. Herhangi bir Flim veri toplama öncesi ölçülmelidir yüzden önemlisi, t ₀ zaman içinde yavaş yavaş değişebilir.

Kullanıcı floresan çürüme profillerini örnek ve zaman kapıları ve uyarım sonrasında göreli gecikmeler genişliğini ayarlamak için gerekli nasıl karar vermelidir. Genel olarak, saptanan sinyali artırmak için geniş bir kapı genişliği kullanırlar ve tipik olarak biz floresan proteinleri ile etiketlenmiş hücrelerin Flim 4 ns ayarlı kapak genişliği kullanmak arzu edilir. Zaman kapısı gecikmeler sayısı analizinde kullanılacak montaj modelin karmaşıklığı verilen (sadece uyarma darbe öncesi sinyalini ölçmek için ayarlanmış bir kapısı dahil) floresan çürüme profilini örneklemek için yeterli olmalıdır. Optimum değer yaşam süreleri ve çürüme bileşenlerin bağıl genlikleri bağlı olabilir. Genel olarak, 4 kapıları bağlantı monoexponential için yeterli iken, 7 ya da daha fazla giriş kapıları olabilir bozunurDaha karmaşık çürüme modelleri için kullanılabilir.

Biz Flim FRET ⁵¹ frekans ömrü okumalarını kullanarak geniş alan mikroskobu zaman domeni veya frekans alanı teknikleri bir dizi kullanarak uygulanabilir ve multiwell plaka dizileri otomatik Flim HCA ilk (non-kesit) uygulanmıştır unutmayın. Geniş alan zaman kapılı görüntüleme ²⁸ kullanan HCA için ilk otomatik optik kesit Flim multiwell plaka okuyucu sonra bildirilmiştir. Daha sonra, geniş alan (non-kesit) frekans Flim HCA FRET ⁵² kullanılarak gen kütüphanesi ve zaman-kapılı Flim HCA karşısında post-translasyonel modifikasyonlar (tirozin fosforilasyonu) taramak için uygulanmıştır HIV-1 Gag ve deneyleri FRET uygulanmıştır oligomerizasyon ⁵³ ve FOXM1 ⁵⁴ ve Raichu RhoA ve Rac1 biyosensörler ³³ SUMOylation arasında. Çukurlu levha Flim ²⁶ için değil, bugüne kadar, T eşleştirmek için zor olduğu kanıtlanmıştır TCSPC kullanmak da mümkündüro geniş alan algılama istismar teknikleri throughput. Bu sorunu gidermek olabilir biri gelişmekte olan yaklaşım, SPAD diziler ⁵⁵ olarak tek foton sayma dedektörleri dizilerin kullanımıdır.

Biz floresan proteinleri kullanarak FRET herhangi readouts uydurma modeli ile ilişkili varsayımlar bağlıdır FLIMfit veya başka herhangi bir Flim analiz yazılımı elde edilen parametrelerin mutlak değerler dikkatle ve tedavi edilmelidir olduğunu unutmayın. FRET donör önemli ikinci çürüme bileşeni vardır, örneğin, FRET Flim veri sığdırmak için bir bieksponensiyel modelinin kullanımı genellikle olması gerekenden daha FRETing nüfusu yüksek görünen ilişkili hızlı çürüme bileşenin katkısı, neden olabilir. Böyle mTq2FP bir mono- üstel ömrü olan vericilere kullanımı arzu edilmektedir. Hatta daha sonra, son çalışmalar FRET analizi hala alıcı floresan protein veya karanlık devletler tarafından etkilenmiş olabilir göstermiştirnedeniyle kromofor açılardan çeşitli florofor yapılardan bir dağıtım ve ² κ oryantasyon faktörü heterojenite ⁵⁶ mesafeler. Yine de, biz ve diğerleri FRET floresan ömrü readouts biyokimyasal ölçümleri ile korelasyon ve protein etkileşimleri için ekran veya biyosensörler dinamiklerini takip etmek için kullanılabilecek faydalı sonuçlar üretmek yapmak olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, bu openFLIM HCA platformu FRET veya hücresel otoflüoresanı ⁸ kullanılarak, hem de boya bazlı prob ²⁵ kantitatif readouts sağlayan flüoresan süresi tabanlı tahlillerde geniş uygulanabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
microscope frame	Olympus	IX81	http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
optical autofocus	Olympus	ZDC	http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
motorized (x-y-z) microscope stage	Marzhauser	00-24-565-0000	Stage with Corvus controlle
excitation laser source	Fianium	SC400-4	Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/
gated optical intensifier	Kentech	High Rate Imager (HRI)
delay generators	Kentech	---	See agile delay generator and precision delay generator
camera	Hamamatsu	ORCA-ER-II
Nipkow disc scanner unit	Yokogawa	CSU-X1	http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/
Top hat diffuser	Thorlabs	ED1-S20-MD	Engineered diffusers
mTq5V	Oxford Genetics	P3850	mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker
mTq17V	Oxford Genetics	P3847	mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker
mTq32V	Oxford Genetics	P3848	mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker
mTq5A	Oxford Genetics	P3849	mTurquoise Amber construct
HEK293T	---	---	cell type used
phenol red-free HBSS	Sigma Aldrich	55021C-1000ML	imaging media
culture media			DMEM + 10% FBS + 0.5% Antibiotics
DMEM	Sigma Aldrich	D6046-500ML	for culture media
FBS	Sigma Aldrich	12003C-500ML	for culture media
xTremeGene9	Sigma Aldrich	6.37E+09	for transfection, follow online protocol from La Roche
trypsin/EDTA Solution	Thermo Fischer	R001100	for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer