Kurbağa Sinir Uçlarına Sinir Kütüğü Vasıtasıyla Kalsiyum Boyası Yükleme: Kurbağa Nöromüsküler Kavşağında Kalsiyum Geçici Kayıt

Özet

Burada, sinir uçlarına kurbağa sinir kütüğünden kalsiyuma duyarlı bir boya yüklemek için bir yöntem açıklıyoruz. Ayrıca, periferik sinir uçlarında hızlı kalsiyum geçişlerinin kaydedilmesi ve analizi için bir protokol de sunuyoruz.

Özet

Presinaptik sinir terminallerinde presinaptik kalsiyum düzeylerini ölçmenin en uygun yöntemlerinden biri optik kayıttır. Hücredeki serbest kalsiyum konsantrasyonuna bağlı olarak emisyon yoğunluğunu veya dalga boyunu değiştiren kalsiyuma duyarlı floresan boyaları kullanmaya dayanır. Kalsiyum boyaları ile hücreleri lekelemek için kullanılan çeşitli yöntemler vardır. En yaygın olanları, boyaların bir mikropipet ile yüklenmesi veya boyaların asetoksimetil ester formları ile ön-kuluçka işlemidir. Bununla birlikte, bu yöntemler ortaya çıkan metodolojik sorunlardan dolayı nöromüsküler kavşaklara (NMJ'ler) pek uygulanmaz. Bu yazıda kurbağa sinirinin kurbağa sinir kütüğü boyunca sinir uçlarına kalsiyuma duyarlı bir boya yüklemek için bir yöntem sunuyoruz. Harici kalsiyumun sinir terminallerine girişi ve bundan sonra kalsiyum boya bağlanması milisaniyedeki zaman ölçeğinde gerçekleştiğinden, bu etkileşimi kaydetmek için hızlı görüntüleme sistemi kullanmak gereklidirns. Burada, hızlı bir CCD kamerayla kalsiyum geçişini kaydetmek için bir protokolü açıklıyoruz.

Giriş

Kalsiyum iyonları (Ca ²⁺ ), mediatör salınımı ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5'in} başlatılması, bakımı ve plastisitesi dahil birçok sinirsel sinyalleme sürecine katılır. Aksiyon potansiyelinin gelmesinden sonra, hücre dışı Ca ²⁺ sinir terminaline girer ve nörotransmiter salınımı başlatır. Bazı sinapslarda, kalsiyum akımı doğrudan elektrofizyolojik yöntemlerle ^{6 , 7 , 8} ölçülebilir. Nöromüsküler kavşak (NMJ) durumunda, sinir uçlarının minik boyutundan dolayı direkt yama kelepçesi ve iki elektrotlu gerilim kelepçesi teknikleri kullanılamaz.

NMJ'deki sinir uçlarından içe Ca ²⁺ akımlarının kayıtları dolaylı elektrofizler ile yapılabilirİyonik yöntemler ^{9 , 10} . Bununla birlikte, bu yöntemler, sodyum ve potasyum iyon kanalı bloke edicileri tarafından sinapsın ön işleme tabi tutulmasını gerektirir. Optik yöntemler, iyonik akımların sinir terminalinde farmakolojik olarak ayrılmasını gerektirmez ve aksiyon potansiyelleri tarafından tetiklenen Ca ^{2 +} akışı ve ardından axoplasm ¹¹ Ca ²⁺ iyonlarının elevasyonu ^{, 12 , 13 , 14'e izin verir} . Bu yöntemler serbest Ca ²⁺ iyonlarının ^{15 , 16 , 17 , 18 , 19'unun} bağlanması üzerine spesifik Ca ²⁺ -duyarlı boyaların flüoresanındaki değişikliklerin kayıtlarına dayanmaktadır.

Ca ²⁺ göstergeleri c içine yüklenebilirDeneyin amacına bağlı olarak çeşitli yöntemler vasıtasıyla basılmaktadır. Araştırmacılar yama pipeti ²² veya mikroenjeksiyon ^{23 , 24 , 25 ile} yüklemeye devam eden membran geçirgen boya formları ^{20 , 21'in} banyo uygulamasını kullanıyorlar. Bununla birlikte, tüm bu yöntemlerin sinaptik mimarlık özelliklerine bağlı olarak NMJ durumunda bazı sınırlamaları vardır. NMJ için en uygun ve başarılı yöntem, ^{26 , 27 , 28 , 29} ileri dolum yöntemi ile boyayı sinir güdüğü üzerinden yüklemektir. Bu teknik, periferik sinir uçlarına çeşitli fluoresan boyaları yüklemek için kullanılabilir. Bu yöntem Drosophila sinir terminalleri ²⁸ , kertenkele motor siniri için başarıyla kullanılmıştır²⁸ ve kurbağa motor sinir terminalleri ^{17 , 26 , 27 , 30} . Çalışma esnasındaki nesnelere bağlı olarak metodik ayrıntılar değişebilir. Larvaların küçük sinirleri için cam mikro-pipet kullanılabilir ²⁸ . Birkaç araştırmacı, kasları sinirlendiren sinirin yeni kesilen ucunun bir boya ile önceden doldurulmuş bir kuyuya daldırıldığı bir yöntem ^{27 , 28'i} tarif etmiştir. Bundan sonra, preparat boya ıslatmak için birkaç saat bırakılır. Boya aksonlar tarafından emilir ve sinir terminallerine taşınır. Bu yazıda, sinir kütüğü aracılığıyla kurbağa motoru sinir uçlarına bir floresan göstergesi yüklemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Protokolümüz, bir boya ile dokunun kuluçka için plastik bir pipet kullanır. Ayrıca, Ca ²⁺ fluorescence tra'ı nasıl edinip analiz edeceğimizi de tarif ediyoruznsients.

Protokol

Deneyler Rana ridibunda kurbağasından muskulus kutanöz pektorisin izole edilmiş sinir-kas preparatları üzerinde gerçekleştirildi. Her iki cinsiyetteki hayvanların büyüklüğü yaklaşık 5-9 cm'dir. Deneysel prosedürler, NIH Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak, Kazan Federal Üniversitesi ve Kazan Tıp Üniversitesi'ndeki laboratuar hayvanlarının kullanımına ilişkin esaslara uygun olarak gerçekleştirildi. Deneysel protokol Avrupa Toplulukları Konseyi 86/609 / EEC sayılı Direktifin gerekliliklerini karşıladı ve Kazan Tıp Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylandı.

1. Çözümlerin Hazırlanması

1. Ringer solüsyonunun hazırlanması.
   1. Ringer solüsyonunu hazırlayın: 113.0 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 3.0 mM NaHC03 ve 1.8 mM CaCl2. PH'ı 7.2-7.4'e ayarlayın.
   2. Ringer solüsyonunu düşük bir Ca ²⁺ ile hazırlayın + içeriği: 113.0 mM NaCl, 2.5 mM KCI, 3.0 mM NaHC03, 6.0 mM MgCl2, 0.9 mM CaCl2. PH'ı 7.2-7.4'e ayarlayın.
2. Boya yükleme çözeltisinin hazırlanması.
   1. HEPES-Na içeren su bazlı çözeltiyi 10 mM'de hazırlayın (pH 7.2-7.4).
   2. Boya ³⁰ ile bir şişeye 14 uL HEPES çözeltisi ekleyin.
      NOT: Ca ²⁺ gösterge boyası, 500 μL toz ile 500 μL'lik bir şişeye gelir.
   3. Harca karıştırın ve karıştırarak iyice karıştırın.
   4. Ca ²⁺ göstergesinin nihai konsantrasyonunu 30 mM'ye düşürmek için çözeltiyi seyreltin. Işıktan kaçının ve -20 ° C'de saklayın.

2. Boya yükleme prosedürü

1. Kutanöz pectoris kasını pektoralis proprius sinir parçasıyla ayırın .
   NOT: Diseksiyon prosedürü mevcutturBlioch ve ark. Tarafından ücretsiz olarak indirilen bir makalede . , 1968 ³¹ .
   1. Diseksiyon prosedürü için iki ince forseps ve kornea makası kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın). Diseksiyonlanmış dokuyu silikon elastomer kaplı bir Petri kabına, Ringer çözeltisi ile önceden doldurulmuş halde aktarın ve dokuyu hafifçe paslanmaz çelik iğnelerle, çanakta biraz gergin olacak şekilde düzeltin.
   2. Petrol kabını Ringer solüsyonunun taze bir miktarı ile tekrar doldurun. Bağ dokularını çıkarın. Sinire zarar vermeyin.
2. Dolum pipetini hazırlayın: Tıraş bıçağı kullanarak, standart plastik 10 μL pipet ucunun konik kısmının ~ 2 mm uzunluğundaki parçasını kesin.
3. Petri kabındaki dolum pipetini takmak için bir parça modelleme kili hazırlayın.
4. Doldurma pipetinin arkasını bir plastik şırıngaya silikon boru ve plastik bağlantı adaptörleri aracılığıyla pipet uçlarından bağlayın.
5. D önceY yükleme prosedürü, plastik bir pipet kullanarak Petrol kabından Ringer solüsyonunu çıkarın. Kas-sinir preparatını ince bir şırınga kullanarak kurutun; Bu dolum pipetinin daha sonra yüklenmesi üzerine Ca ²⁺ boyasının seyrelmesini önleyecektir.
6. Ca ²⁺ gösterge şişesini dondurucudan çıkarın ve karanlık bir yerde oda sıcaklığında çözülmesine izin verin.
7. Düşük büyütme (10 ×) ile stereomikroskop kontrolü altında, kas ve sinir arasındaki bağlantıyı tespit edin. İnce cımbız ve makasla, kas yüzeyinin yakınında pektoralis proprius siniri kesin (bkz. Adım 2.1). Yaklaşık 2 mm uzunluğunda bir sinir kütüğü bırakın.
8. Modelleme kili kullanarak Petri kabındaki boruya ve şırıngaya tutturulmuş dolum pipetini düzeltin.
9. Pipetin ucunu sinir kütüğü yakınına getirin.
10. Çimdiklemeden, sinir kütüğünü dolum pipetinin ucu içine yavaşça aspire edin.
11. Emme borusunu körelmeden çıkarınT Dolum pipetinin sonu.
12. Uzun bir iğneli bir şırınga kullanarak aşırı miktardaki çözeltiyi dolum pipetinden dikkatlice çıkarın (Malzeme Tablosuna bakın). Sinir güdüklerini sıkmayın.
13. Sinir kütüğü ucunda emilmiş tutarak, dolum pipetinin ucunu dikey olarak biraz yukarı kaldırın.
14. Petrol jöle kullanarak dolum pipet ucunun dışından sinir kütüğünün aspire edilmiş bölümünü izole edin.
15. Gerekirse dolum pipetinde yalıtılmış sinir güdükünü kurutun: uzun bir iğneli bir şırınga kullanarak dolum pipetinden aşırı miktarda solüsyonu aspire edin.
16. Uzun pipet ucuyla bir pipet kullanarak boya yükleme çözeltisinin 0.5 μL'sini çizin (adım 1'e bakın).
17. Dolum pipetine yükleme çözeltisiyle birlikte pipet ucu nazikçe yerleştirin. Karışımı doğrudan sinir güdüğü üzerine çıkarın.
18. Dolum pipetinin açık ucunu petrol jeli ile kapatın.
19. Ringer'in küçük bir parçasını ekleyin.Hazırlanışı ıslak tutmak için Petri kabında olution.
20. Preparatı karanlık ve ıslak koşullar altında oda sıcaklığında 5 saat inkübe edin.
21. Dolum pipetini yükleme çözeltisiyle çıkartın, hazırlığı Ringer solüsyonuyla durulayın ve gece boyunca 8 ° C'de buzdolabında saklayın.

3. Mikroskopi için Doku Hazırlama

1. Preparatı silikon elastomer kaplı bölmeye monte edin ve biraz gerginleşecek şekilde çelik mikro iğnelerle sabitleyin.
2. Dokuyu bir miktar taze Ringer solüsyonuyla durulayın.
3. Siniri uyarmak için bir emme elektrodu kullanın; Elektrodun yapımı, Kazakov ve diğerleri tarafından kağıdın ücretsiz indirilmesiyle mümkündür . , 2015 ³² . Elektrot ucunu sinirin kesik ucuna yakın konuma getirin ve sinir güdüğü elektrot deliğine aspire edin.
4. Hazırlama bölmesini mikroskop sahnesine monte edin. PlacSıcaklık probu ve haznedeki giriş ve çıkış ateşleri.
5. Güç kablosunu Peltier elemanına bağlayın.
6. Hazırlığı süper kaynaştırmak için basit bir yerçekimi tahrikli sistem kullanın. Fazla çözeltiyi çıkarmak için perfüzyon emme pompasını açın.
7. Termo kontrol ünitesini açın.
8. Sıcaklık kontrolünü 20 ° C'ye ayarlayın.
9. Ultraviyole koruma koruyucusunu takın.
10. Uyarıcı tel elektrotunu elektrik stimülatörüne bağlayın ve 4x objektif lens ile mikroskop altında kas kasılmalarını izleyin.
11. Perfüzyon sistemini düşük Ca ²⁺ ve yüksek Mg ²⁺ içerikli Ringer çözeltisi ile doldurun.
    NOT: Bu çözüm, kas kasılmalarını önlemek için kullanılır. Dış kalsiyum konsantrasyonundaki azalma ve dış magnezyumun yükselmesi, Ca2 ⁺ geçişlerinin amplitüdünde azalmaya neden olur. Bununla birlikte, önceki tecrübelere dayanarak, 0.9 mM CaCI _{2 ve 6 mM MgCl 2 , Ca ²⁺ geçici değerlerinin amplitüdünü güvenilir şekilde çözmek için hala yeterlidir. Örneğin Ca ²⁺ konsantrasyonunu azaltmadan kas kasılmalarını azaltmanın başka yollarının var olduğunu belirtmek gerekir. Örneğin, d-tubokurarin veya alfa-bungarotoksin, nikotinik asetilkolin reseptörlerinin spesifik bloke edicileri, kas kasılmalarını tamamen veya kısmen bloke eder ^{17 , 27 , 28 , 30.} Bununla birlikte, bu toksinlerin ilavesi presinaptik kalsiyum girişini de etkileyebilir ³³ . Bunu önlemek için, μ-konotoksin GIIIA kullanılabilir ²⁷ .}
12. Pompayı açın ve düşük Ca ²⁺ ve yüksek Mg ²⁺ ile Ringer solüsyonuyla preparat süperfüzyonuna başlayın.
13. Mikroskopta 40 × objektif merceğine geçin.
14. Açma t O monokromatör ( Malzeme Tablosuna bakınız).
15. Monokromatör kontrol yazılımında 488 nm'lik bir emisyon dalga boyu ve sürekli aydınlatma modu seçin.
16. Floresan modunda yüksek büyütme altında, sinir terminallerine boya yüklendiğinden emin olun.

Şekil 1 : Ca ²⁺ göstergesi yüklü sinir ve terminaller. ( A ) Yükleme prosedüründen sonra Ca ²⁺ göstergesi ile dolu sinir. Ölçek çubuğu = 200 μm. ( B ) Ca ²⁺ göstergesi ile dolu sinir uçları. Ölçek çubuğu = 20 μm. ( C ) Ca ²⁺ -indikatör floresan, sinir bitiminde açıkça görülür. Ölçek çubuğu = 20 μm._blank "> Bu figürde daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

17. Preparatın düşük Ca ²⁺ ve yüksek Mg ²⁺ solüsyonunda en az 30 dakika dengelenecek şekilde bırakın.

4. Dijital CCD Kamera ile Video Çekimi

Not: Flüoresan sinyallerini yakalama ayrıntıları her mikroskop ve kamera türü için özeldir, ancak en önemli husus görüntü yakalama hızıdır.

1. NMJ'deki tek Ca ²⁺ geçici kayıtları için minimum yakalama frekansı olarak 1 kHz kullanın.
   NOT: Hızlı dijital CCD kameralar floresan görüntüleme için gereklidir (Malzeme Tablosuna bakınız). Burada veri toplama sistemi ve yazılımı ( Malzeme Tablosuna bakınız) kamera, monokromatör ve uyarıcının senkronizasyonu için kullanıldı. Kısacası, bu protokol, verilerin dijital çıkışlarında senkronizasyon darbelerinin üretilmesine izin verirDeklanşörü açmak, video sinyalini yakalamak ve uyarımı başlatmak için görüntü toplama sistemi. Tüm geçici parametreler, protokollerde ve / veya cihazlarda ayarlanabilir. Tipik bir protokol, 1 kHz'de (80 x 80 piksel) elde edilen 500 çerçeve serisidir. Uyarma ışığı ile aydınlatma, Ca ²⁺ göstergesini beyazlatabilir ve hücre dokusunu fotodasajlayabilir. Bu nedenle, uyarma ışığına uzun süre maruz kalmaktan kaçının. Bu protokolde, deklanşör yalnızca videoyu çekmek için gereken süre boyunca açıktır. Belirli sinir terminali başına yirmi dizi elde edin. Buradaki amaç aynı bölgeleri kontrol grubunda ve ilaç dağıtımından sonra izlemektir.
2. Mikroskopun 4X nesnel objektifi altında kas ve sinir dallarını görselleştirmek için parlak alan rejimini kullanın.
3. 40X nesnel objektife geçin ve epifloresan rejimi ve 488 nm'lik bir uyarılma dalga boyu kullanarak boya yüklü sinir uçları arayın. İlgi çeken bir sinir uçlu bölgeyi tanımlayın.
4. Trinoküler tüp üzerindeF mikroskop, ışık yolu değişim seviyeleri seçin:% 100 kamera ışık.
5. CCD kamera için satın alma yazılımını başlatın.
6. "Canlı" modda ROI'yi bulun ve odağı ayarlayın.
7. "Değiştir" menüsünü seçin.
8. Saniyede 1.000 kare (fps), 80 x 80 çözünürlükte "Temel Yapılandırma" kullanın.
9. Giriş karelerinin sayısını 500 olarak ayarlayın.
10. Denemenin adını girin.
11. "Harici Tetikleyici" yi seçin.
12. Ön tetikleme süresini 10 ms olarak ayarlayın.
13. Yineleme sayısını 20 olarak ayarlayın.
14. Monokromatör kontrol yazılımında 488 nm'lik bir emisyon dalga boyu ve "harici tetik aydınlatma" modunu seçin.
15. Veri toplama yazılımını çalıştırın.
16. Uyarım protokolünü yükleyin.
17. Videoyu kaydetmeden önce, video edinme yazılımını kullanarak karanlık çerçeveyi yakalayın.
18. Uyarım protokolünü çalıştır.
19. ROI ve chec'i seçinK kaydedilen sinyali.

5. Veri Analizi

NoOTE: Veri analizi için CCD kamera yazılımını ve ImageJ'yi kullanın; Veriler bir elektronik tablo programında eğri olarak gösterilir. CCD kamera yazılımında, ortalama 20 tekrarlar ve sonuçları bir ImageJ destek dosyasına aktarır. ImageJ'de ROI ve arka planı seçin. Arka planı YG'den çıkartın. Veriyi bir oran olarak gösterin: (ΔF / F ₀ -1) x% 100, burada ΔF uyarılma esnasında flüoresansın yoğunluğudur ve F ₀ istirahatte flüoresan yoğunluğudur.

1. CCD kamera edinme yazılımında Dosya> Ortalama Dosyalar'ı tıklayın. Dosyaları seçin ve ortalamaları alın.
2. "Fit dosyası olarak kaydet" i tıklayarak ortalama dosyayı bir .fit dosyası olarak kaydedin.
3. ImageJ yazılımını çalıştırın. Aşağıdaki adımları uygulayın:
4. Görüntü> ayarla> parlaklık / kontrast'ı tıklayın.
5. Resim> yığınlar> araçlar>; Yığın sıralayıcı.
6. Analiz> araçlar> ROI yöneticisi'ni tıklayın.
7. Sürüklenen ve ortalama .fit dosyasını ImageJ penceresine bırakın.
8. Daha iyi bir görüntü elde etmek için pencereyi yakınlaştırın.
9. İmleci hareket ettirerek, son kareyi seçin ve silin (karanlık çerçeve budur)
10. Arka plan olduğuna inanılan alan üzerinde dikdörtgen bir ROI seçin. ROI yöneticisine ekleyin
11. Daha> Çok Ölçü'yi tıklayarak arka planı ölçün. MEAN'i not edin. Veriyi kopyalayın, bir elektronik tablo programına dışa aktarın ve bir oran için eşiğin ortalama değerini hesaplayın.
12. İşlemi> Ana> Çıkar'ı tıklayarak eşiği yığınlardan çıkartın. Eşiğin ortalama değerini girin.
13. Bir sinir terminalinin etrafında dikdörtgen bir ROI seçin. ROI yöneticisine ekleyin.
14. Daha> Çok Ölçüm'ü tıklayarak ölçün. MEAN'i not edin. Kopyalayıp bir elektronik tablo programına dışa aktarın.
15. Sinyallerin ofset ortalamasını.
    NOT:Uyarılmadan baz renklendirme floresanını gösteren ilk birkaç düzine nokta; Dinlenme sırasındaki floresan budur.
16. Sinyalleri, dinlenme sırasındaki flüorüre göre bölün.
17. "1" çıkarın ve% 100 çarpın.
18. Sinyali çizin ve Ca ²⁺ geçici genlik hesaplayın.

Sonuçlar

Boya yükledikten ve motor sinir uyarımı üzerine, sinir terminallerinde floresan sinyalinin (Ca ²⁺ geçici) amplitüdünde bir artış tespit edilebilir (bkz. Şekil 2 ). Ca ²⁺ geçici parametreleri Tablo 1'de sunulmuştur. Nicel olarak, çalışmamızda ölçülen Ca ²⁺ geçici parametreleri, soğukkanlı hayvanların sinapslarındaki diğer bilim adamlarının elde ettiği verilere ^{15 , 34} yakındır. Ca ²⁺ geçici maddelerinin parametreleri, Ca ^{2+ '} nın boya ile bağlanma hızına ve ardından çözünme oranına bağlıdır. Sinir sonlanmasına, renkle etkileşime ve sitoplazmdaki difüzyona Ca ²⁺ girme oranı Ca ²⁺ geçiciinin yükselme zamanını etkiler. Floresan sinyalin bozulma süresi boya afınitesine,Hücre içi tamponlar ile Ca ²⁺ etkileşimi hızı ve iyon pompaları ile uzaklaştırılması ³⁵ . Ca ²⁺ geçici maddelerin genlik analizi, çeşitli maddelerin nörotransmitter salınımına katılan kalsiyum girişi üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilir ³³ .

Şekil 2 : Ortalama Ca ²⁺ Geçici NMJ kurbağasında ölçülür. Ca ²⁺ geçici, 13 kurbağa NMJ'sinin sinyal ortalamasına dayanarak hesaplandı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

ZirveΔF / F (%)	Yükseliş süresi% 20 -% 80 (ms)	Τ (ms)
12,6 ± 1,1 (n = 13)	4.6 ± 0.5 (n = 13)	115.3 ± 8.3 (n = 13)

Tablo 1: Ca ²⁺ geçici maddesinin ortalama parametreleri . Veriler ortalama ± SE olarak sunulmuştur; N farklı NMJ'lerdeki ölçümlerin sayısıdır. Zirve ΔF / F, ΔF / F'nin ortalama amplitüdidir.

Tartışmalar

Bu yazıda, sinir kütüğü aracılığıyla kurbağa sinir uçlarına Ca ²⁺ -duyarlı boya yükleme yöntemi uyguladık. Yükleme prosedürünün sonuna gelindiğinde, sinirin proksimal kısmındaki tüm terminallerin flüoresans düzeyleri belirgindir. Probun terminal içi konsantrasyonunun 40 ila 150 μM arasında değiştiği tahmin edilmektedir17.

Kuluçka prosedürü iki aşamada gerçekleştirilir: Oda sıcaklığında ve daha sonra bir buzdolabında daha düşük bir sıcaklıkta. Oda sıcaklığında boya ile doku inkübasyon süresini kontrol etmek önemlidir. Sinir güdükünün gerçek uzunluğuna, spesifik boyaya ve sıcaklığa bağlı olarak kuluçka süresi değişebilir. Aşırı maruz kaldıysa, proksimal kısımların sinir kütüğüne yakın terminalleri aşırı yüklenebilir. Bununla birlikte, sinirin orta kısmında tatmin edici yüklü terminaller bulmak hala mümkündür. Inci sırasındaBuzdolabında uzun süre inkübasyon yapılırsa, boya sinir uçlarına eşit olarak dağıtılır.

Kendi gözlemlerimiz ^{33 , 35} ve diğer araştırmacıların verileri ³⁰ , yükleme prosedürünün postsinaptik yanıtın amplitüdünde veya minyatür son plak potansiyellerinin frekansı üzerinde kayda değer bir etkisinin bulunmadığını ispatlıyor. Yüklü müstahzarlarda iyi bir ömrü belgelenmiştir. Dikkat çekmek istediğimiz bazı önemli noktalar var. Boyanın kesik sinir aksonlarına girmesini sağlamak için eksizyon sonrası sinir kütüğünü boya yükleme çözeltisine yerleştirmek çok önemlidir; Gecikmeler muhtemelen sinir aksonlarının ^{27 , 36} nın tekrar kapanmasına bağlı olarak etkisiz yüklemeye neden olabilir. Bazı araştırmacılar, sinir güdükünü 100 mM EDTA (bir Ca ²⁺ - ve Mg ²⁺ -çelatör) Kesilen aksonların tekrar kapanmasını önlemek için sinirin çıkarılmasından hemen sonra. Tampon, 1-2 dakika sonra çıkarıldı ve bir boya yükleme çözeltisi ^{37 ile değiştirildi} . Yükleme prosedürü için plastik hortum yerine bir petrol jeli kuyusu kullanılması daha kısa bir sinir kütüğü kullanımına izin verir. Bu yaklaşımı kullanırken sinir, boya ile HEPES çözeltisine daldırıldıktan sonra kesilir ve aksonlar boyar madde çözeltisinde iki değerlikli iyonların olmaması nedeniyle yeniden mühürlemezler 27,28.

Çalışmamızda, dekstran yerine Ca ²⁺ göstergesinin suda çözünen tuz formunu kullandık. Dekstran konjugatları aksonda tuz formlarından daha yavaş yayılır. Bununla birlikte, dekstran konjugatının kullanımı, boya bölümlendirmesini ve sinir ve NMJler tarafından taşınmasını azaltır. Kalsiyum yeşil 1-3.000 MW dekstran konjügatının iyi bir difüzyon hızı vardır ve azaltılmış bölümlendirmeyi gösterir Up class = "xref"> 38.

Dokunun uzun süre flüoresanla aydınlatılmasını önlemek çok önemlidir; çünkü bu durum, sağlığını ve sağkalımını etkiler. Sinir terminalleri aramak için görünür ışık kanalında Nomarski optik kullanıyoruz. Kayıt esnasında aydınlatılmış alanı bir diyafram ile sınırlıyoruz.

Dikkat çeken nokta, bu yükleme yönteminin yalnızca uzun inkübasyonlara dayanabilen preparatlara uygun olmasıdır. Daha kırılgan dokular üzerinde çalışmalar yapıldığında boya yükleme süresini azaltmak için ( örneğin, sıcakkanlı hayvanların sinapsları), sinir kütüğü uzunluğunu küçültmek ve ^{29 , 39} yüklemek için mikropipet kullanmak gereklidir.

Bu yükleme tekniği, hem tek sinir uyarımı hem de ritmik sinaptik aktivite altında flüoresan göstergeler ile sitosolik Ca ²⁺ görüntüleme değişiklikleri için çok uygundurEf "> 17 ^{, 27 , 35} Ca ²⁺ -transient genlik analizi, nörotransmitter salınımına katılan kalsiyum girişi üzerindeki farklı maddelerin etkisini incelemek için kullanılabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ca2+ indicator	Molecular Probes, USA	Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806	500 μg
Silicone Elastomer	Dow Corning, USA	Sylgard 184 elastomer
Pipette	Biohit, Russia	720210	0.5-10µL
Pipette tip	Fisher Scientific, USA	02-707-175	10µL
Pipette tip	Biohit, Russia	781349	10µL
Razor Blade	Fisher Scientific, USA	12-640
Minutien Pins	Fine scince tools, Canada	26002-20
Corneal Mini-Scissors	MT MEDI CORP, Canada	S-1111
Jeweler Forceps	MT MEDI CORP, Canada	F-9610
Jeweler Forceps	MT MEDI CORP, Canada	F-9611
Modelling clay	local producer		can be replaced by any local producer
Petroleum jelly	local producer		can be replaced by any local producer
Microspin FV 2400	Biosan, Latva	BS-010201-AAA
Multi-spin MSC 3000	Biosan, Latva	BS-010205-AAN
Single-use hypodermic needles	Bbraun	100 Sterican	0.4×40mm
Syrynge	local producer		0.5 ml
HEPES	Sigma-Aldrich, USA	H0887	100ml
Microscope, BX51	Olympus, Japan
Data acquisition system	Molecular Devices, USA	Digitdata 1550
software	Molecular Devices, USA	pClamp software, Version 10	protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro
Bath and bath temperature controler	Experimental Builder		can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/
Monochromator	Till Photonics, Germany	Polychrome V	no longer available, can be replaced by other   sutable stable light source 488 nm
monochromator control software	Till Photonics, Germany	Polycon
Digital CCD camera	Redshirt imaging, USA	Neuro CCD SMQ
Model 2100 Isolated Pulse Stimulator	A-M Systems, USA
Acquisition software for CCD camera	Redshirt imaging, USA	Turbo SM software
ImageJ	National Institutes of Health, USA		http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Spreadsheet program	Microsoft, USA	Microsoft Office Excel