Bir Ismarlama HPLC Arıtma Protokolü That Oligomer Formasyonu Yetenekli Verim Yüksek saflıkta Amiloid Beta 42 ve Amiloid Beta 40 peptidler,

Özet

Bu yazıda oligomer oluşturabilen yüksek saflıkta amiloid beta 42 (Aβ42) ve amiloid beta 40 (Aβ40) peptidler, veren bir özel HPLC arıtma protokolü sunduk. Amiloid P Alzheimer hastalığında rol yüksek çekiş eğilimli hidrofobik peptittir. peptid amiloidojenik doğası onun saflaştırma bir meydan okuma yapar.

Özet

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (Aβ), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (Aβ42) and amyloid beta 40 (Aβ40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase - styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (>95%) Aβ42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the Aβ40 peptide with identical success and without the need to alter the method.

Giriş

Alzheimer hastalığı bir nörodejeneratif bir hastalıktır etkileri 35 milyondan fazla kişi dünya çapında. Hastalığın başlangıcı ve gelişiminde güçlü Belirtilmiş ^1, yüksek toplama eğilimli, hidrofobik peptid Amiloid beta (Aβ) 'dir. ² Aβ Ancak, beta amiloid 42 (Aβ42), proteinin en toksik bir şekilde 42-amino asit türevi olduğu düşünülmektedir, uzunluğu 36 ila 43 amino asit arasında değişir. ³ Bu hali hazırda, özellikle nörotoksik maddeler olduğu düşünülmektedir yayılabilir oligomerik türler oluşturma Aβ42 yeteneğini büyük bir kısmında kaynaklanmaktadır. ⁴ Aβ peptid anlayışımızı ilerletmek için, rutin yüksek saflıkta malzeme elde etmek esastır. saf olmayan artıklarının varlığı büyük ölçüde peptidin birikme eğilimi özelliklerini değiştirmek için gösterilmiştir. ⁵

Traditionally, örneğin Aβ hidrofobik peptitler, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ayırma C ₄ ya da Cı ₈ silis bazlı sabit fazlarda ve bir asidik mobil faz bir kombinasyonunun kullanımı ile yapılmıştır. ⁶ Ancak, bu tür koşullar peptid saflaştırılması için bir meydan okuma sunabilir. Aβ peptidi düşük izoelektrik noktası (pl yaklaşık 5.5) ^7, asidik koşullar altında, peptid agregasyon artar ve bunun bir sonucu olarak genellikle izole etmek zordur, geniş olmayan çözüldü HPLC tepe (Şekil 2A) üretilmeleri anlamına gelir. Ayrıca, bu tür geniş zirveler genellikle peptid toplama profilini etkileyebilecek ve yaygın dramatik üretilen peptid miktarını etkileyebilir arınma sonraki mermi gerektirebilir safsızlıklar içermezler.

poli (stiren / divinilbenzen) durağan faz, PLRP-S, saflaştırmadan bir alternatif araçları temsil ederYing hidrofobik peptitler. hareketsiz faz farklı protein ve haberci ribonükleik asitlerin (mRNA) 'in bir dizi saflaştırılmasında kullanılmıştır. ^{8, 9} PLRP-S sabit faz ters faz ayrılması için ek bir alkil ligandı gerektirir ve daha da önemlisi, peptidin agregadan arındırma çaresinin yol açan yüksek pH değerinde kimyasal olarak kararlıdır. ⁷ Burada, yüksek saflıkta amiloid beta 42 (Aβ42) ve amiloid beta 40 (Aβ40) peptidleri veren bir özel HPLC arıtma protokolü sunduk.

Protokol

Aβ40 ya Aβ42 Peptid 1. Hazırlayıcı HPLC saflaştırma

1. HPLC saflaştırması için, aşağıdaki tamponlar hazırlamak.
   1. Ultra saf su 1000 ml _NH4OH (% 28 çözelti) 1.3 mL ilave edilerek tampon A (20 mM _NH4OH) hazırlayın.
   2. HPLC-grade asetonitril 800 mL ve ultra saf su 200 mL çözeltisine _NH4OH (% 28 çözelti) 1.3 mL ilave edilerek tampon B (20 mM _NH4 OH ile% 80 asetonitril) hazırlayın.
   3. Ultra saf su ve 100 mL _NH4OH (% 28 çözelti), 100 uL eklenmesiyle Örnek erime tamponu (% 0.1 _NH4OH) hazırlayın.
2. Kurulum, Şekil 1 'de gösterildiği gibi, HPLC aleti.
   1. A tampon ve polimer tüp kullanarak HPLC pompası girişlerine B tampon içeren çözücü şişe yerleştirin. tek parça uydurma HPLC pompası polimer boru takın. polimer boru emin olunher bir tampon aygıtının doğru giriş valfı takılmıştır. Bir degazör ile HPLC pompası takın.
   2. Çift 300 Å 8 mikron 25 mm х 300 mm hazırlayıcı sütun girişi ile HPLC pompası polimer boru kullanılarak (Şekil 1B, aşırı sol sütun, Malzeme Listesi bakınız).
      1. tek parça parmak sıkı geçme ile hazırlayıcı sütun polimer boru takın. Polimer sütunu doğru bir şekilde yönlendirilmesini sağlamak.
         Not: Hazırlama sütunun durağan faz poli (stiren-divinilbenzen) parçacıklar oluşur. Polimer kolonun doğru yönelim tek yönlü ok ile dış gövde üzerinde işaretlenir.
   3. Polimer boru kullanarak ikili dalga boyu dedektörü sütunun çıkışını bağlayın ve 214 nm ve 280 nm dalga boyu dedektörü ayarlayın.
      1. kurulum enstrüman yöntemi seçeneği belirleme dalgaboyu parametrelerini değiştirerek dalga boyu AlterDahili HPLC yazılımı.
   4. tek parçalı bir parmak sıkı geçme ile bir dalga boyu detektörü girişine polimer boru takın. dalga boyu dedektörü çıkış vanasına polimer boru takın. tek parça parmak sıkı geçme ile HPLC dedektörü çıkış vanasına polimer boru takın. Bu örnek toplama tüp olacaktır.
      Not: Aβ peptidi üzerinde güçlü bir kromofor eksikliği 214 nm pik toplama primer ultraviyole (UV) bir dalga boyu olarak kullanılması zorunlu kılar.

Şekil 1: beta amiloid peptidlerin saflaştırılması için kullanılan HPLC aygıtının deney düzeneği. (A) bir gaz giderici ve 214 nm ve 280 nm ayarlı değişken dalga uzunluğu detektörü ile donatılmış kuaterner HPLC pompası; (B) olarak hazırlanmıştır HPLC sütunları arasında, beta amiloid peptidlerin saflaştırılması için kullanılansoldan sağa, 25 x 300 mm, ^2, hazırlayıcı kolon, 7.5 x 300 mm, ^2, yarı preparatif kolonu ve 4.6 x 250 mm ² Analitik kolon; (C) analitik HPLC için kullanılan 20 uL paslanmaz çelik enjeksiyon döngü ile Manuel enjektör; (D) hazırlayıcı ve yarı hazırlayıcı saflaştırma için kullanılan 10 ml paslanmaz çelik enjeksiyon döngü ile manuel enjektör. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

3. (HPLC yazılımı yerleşik kurulum enstrüman yöntemi seçeneği) çözücü tarife parametresini değiştirerek arıtma yöntemi giriniz Tablo 1'de görüldüğü gibi arıtma yöntemini çalıştırmak için HPLC yazılım programı. HPLC yazılım üzerinde "açık" butonuna tıklayarak HPLC pompası açın.
   NOT: Pompa tampon A başlangıç ​​oranını temin başlar ve hazırlık yoluyla B tampon olacakarative kolon ve HPLC aleti.
   1. 30 dakika tamamen dengelenmesi için sistem bırakın.

Saat / dakika	Tampon A% 'si	Tampon B b%	Akış Hızı d / ml dak -1
0	80	20	6
45	75.5	24.5	6
45.01	80	20	6
52.01	80	20	6
52.02	73	27	6
85	73	27	6
92	5	95 ° C	6

Tablo 1: 25 × 300 mm polimer kolon kullanılarak Aβ42 ve Aβ40 peptidler saflaştırılması için zaman çizelgesi. ^Bir Tampon A - 20 mM _NH4 OH ile _H2O; 20 mM _NH4 OH ile ^B% 80 MeCN /% 20 _H2O; örnek aşağıdaki enjeksiyondan önce sütun yıkama 15 dakika ^Cı Ran; ^D HPLC enstrümantasyon 6 mL / dakika bir akış hızı çalıştırmak için, basınç sınırı 200 bar azaltılması gerekir.

4. Aβ peptidi numunenin saflaştırılması
   Not: Ham peptid bir otomasyonlu katı faz peptid sentezi ile elde edildi. ¹⁰
   1. Örnek erime 4 ml tampon ham Aβ peptidi 3 mg eritin. Oda sıcaklığında 30-60 sn ve çözünmeye yardımcı olması için 40 kHz frekansta örnek sonikasyon.
   2. 16-gauge ile donatılmış 5 mL'lik bir plastik bir şırınga kullanılarak HPLC kolonuna Numunenin tamamı enjektepaslanmaz çelik iğne. alt aşama 1.3 belirtildiği gibi arıtma yöntemi çalıştırın.
      NOT: Sistem numune enjeksiyon 10 ml paslanmaz çelik enjeksiyon döngüsü (Şekil 1D) ile donatılmış bir el enjektörün kullanımı ile yapılabilir sağlar. İstenen Aβ peptid keskin çözülmesi tepe (Şekil 2C) olarak 72 ila 74 dakika Zehir.
   3. 50 ml konik santrifüj tüpüne örnek toplamak. Toplanan eluent doğrudan enjeksiyon kütle spektrometresi ile Aβ zirve kimliğini onaylamak. ¹¹ -20 ° C'de en fazla 12 saat boyunca yıkama sıvısı.
      NOT: daha uzun 12 saat peptid oksidasyonu için potansiyeli nedeniyle tavsiye edilmez dönemler için çözümün depolama.
   4. Toplanan kısım dondurma flaş saflaştırılmış peptid Yalıtmak / sıvı azot ve Lyophilize içinde Aβ peptid alikotları. -60 ° C ve bir pres içinde bir sıcaklıkta dondurularak kurutulması örnek tarafından liyofilizasyon gerçekleştirmek24 saatlik bir süre için 20 mTor olun.
   5. Aβ peptidi saflığını belirlemek için aşağıda verilen analitik HPLC protokolü çalıştırın. 6 aya kadar bir süre için -20 ° C 'de bunların liyofilize formda saklayın peptidler.

Saflaştırılmış Aβ Proteininin 2. Analitik HPLC Analizi

1. alt bölümde 1.1 belirtildiği gibi HPLC tamponlar hazırlayın. Yukarıdaki protokol.
2. Kurulum aşama 1.2.1 uyarınca ve 4.6 x 250 mm analitik sütun (Şekil 1B, en sağ sütun) ve 20 uL, paslanmaz çelik enjeksiyon döngüsü ile el enjektör ile, Şekil 1 'de gösterildiği gibi (Şekil 1C) monte analitik HPLC Enstrüman.
3. Adım 1.3 ile benzer talimatları izleyerek Tablo 2'de görüldüğü gibi analitik yöntemini çalıştırmak için HPLC yazılım programı.

Zaman /dk	Tampon A% 'si	Tampon B b%	Hızı / ml dak akış -1
0	95	5	1
30	50	50	1

Tablo 2: Aβ peptidi HPLC saflığı analizi için takvim. ^Bir Tampon A - 20 mM _NH4 OH ile _H2O; 20 mM NH ₄ OH ^b% 80 MeCN /% 20 H ₂ O.

4. Aβ peptidi saflığı analizi
   1. Örnek tampon çözeltisi içinde peptidin çözülmesi yoluyla saflaştırılmış peptidin 1 mg / ml çözelti hazırlayın.
      NOT: Tampon tarifi alt bölümde 1.1 bulunabilir. Protein konsantrasyonu, 280 nm'de (A _280nm) protein emiliminin ölçülmesi ile belirlenir. ¹² m konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır olar yok olma katsayısı (ε) ε = 1.490 ^{dm3 mol-1 cm-1} olan. ¹³
   2. HPLC kolonuna 1 mg / ml (222 uM) çözeltisinin 20 ul enjekte edilir ve adım 2.3 kurulum oldu analitik yöntem çalıştırın.
      Not: analiz için kullanılmaz kalan çözelti, sıvı nitrojen içinde dondurulur ve Aβ peptidi kurtarmak için liyofilize edilebilir. Liyofilizasyon ayrıntıları alt bölümde 1.4.4 bulunabilir. Aβ peptidi 16 ve 18 dakika boyunca (Şekil 2B) arasındaki analitik sütundan elute olur. Aβ peptidi saflığını belirlemek için HPLC aleti birlikte yerleşik entegre analiz yazılımı kullanarak. Saflık spektrumunun bireysel zirveleri her entegre ve peptit tepe yüzdesi alanını hesaplanarak belirlenir. Tipik olarak,>% 95 bir saflaştırma saptanmalıdır.

"Şekil 2" src = "/ files / ftp_upload / 55482 / 55482fig2.jpg" />
Şekil 2: Aβ42 Temsilcisi HPLC izleri. (A) Geleneksel _C4 silika saflaştırma koşulları: Tampon A: _H2O,% 0.1 trifluoroasetik asit (TFA), B tampon maddesi ile:% 0.1 TFA, gradyan ile MeCN (asetonitril): 20 tampon B 40 dakika boyunca,% 27 ve ardından izokratik% 27 B tamponu ile; (B) 25 x 300 mm, ² Polimer kolonu, koşullar kullanılarak hazırlayıcı saflaştırma: 20 mM _NH4OH, tampon B ile _H2O: Tampon A% 80 MeCN /% 20, H, 20 mM _NH4 OH ile _2, O, gradyan : izokratik% 27 tampon B, ardından 70 dakika boyunca% 20 ila 27 tampon B; 25 x 300 mm, ² Polimer kolonu kullanılarak hazırlayıcı saflaştırmaya Optimize (C) koşulları alt bölüm protokolü açıklama metni 1.3 bulunan Tablo 1 'de tarif edilir; (D) Analitik HPLC 4.6 x 250 mm ² Polimer kolonu, kon kullanılarakitions: Tampon A: _H2O, 20 mM _NH4OH, tampon B ile: 30 dakika boyunca 20 mM _NH4OH, gradyan% 5 ila 50 tampon B% 80 MeCN /% 20 _H2O. Bölüm A, B ve C Aβ42 tekabül zirve bir yıldızla işaretlenir. Bölüm D. Kütle spektrometrisi gösterildiği gibi C>% 95 bir saflığa ortaya kısmen işaretlenmiş Aβ42 tepe toplama Aβ42 zirvesinin ne olduğu belirlemek için kullanılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Sonuçlar

PLRP-S durağan faz bir kombinasyonunu 72 ve 74 dakika boyunca (Şekil 2C) arasında bir alıkonma zamanında Aβ peptidi için keskin çözüldü tepe oluşumunda yüksek bir pH mobil faz sonuçları kullanılarak Aβ42 peptidinin arıtılması. tepe kimliğinin teyidi toplanan elüsyon direkt enjeksiyonu kütle spektrometrisi yoluyla yapılır. yıkama sıvısı kadar 12 saat boyunca çözelti içinde -20 ° C'de muhafaza edilebilir. depolamanın daha uzun süreli ...

Tartışmalar

Aβ peptidi HPLC saflaştırma arıtılmadan kullanılan durağan faz peptid elüt edilmesi için seçilen mobil faz iki seçimi oldukça bağlıdır. toplama peptidin yüksek eğilimi düşük izoelektrik noktası Aβ peptidi uzun bir geniş olmayan çözüldü olarak elüsyon ile hidrofobik proteinlerin ayrılması (C4 veya asidik bir mobil elüsyon ile birleştirilmiş C8 faz) zor geleneksel kromatografik koşullan sağlamaya pik (Şekil 2A).

Yüksek pH değerinde kimyasa...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 1260 Infinity II quarternary pump	Agilent	G7111B	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector	Agilent	G7114A	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop	Agilent	0101-1232	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop	Agilent	G1328C	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Ring Stand Mounting Bracket	Agilent	1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical)	Agilent	PL1512-5501	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ42 or Aβ40 peptide			Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer.
Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution)	Fisher Scientific	A669-500
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4
HPLC grade water	Fisher Scientific	W5-4
Falcon 50 mL conical centrifuge tube	Fisher Scientific	14-954-49A
Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea	Sigma-Aldrich	Z227250
Normject 5 cc sterile syringe	Fisher Scientific	1481729
16 Gauge SS Needle	Rheodyne	3725-086