Gerçek Zamanlı Hemodinamik İzlemli Farelerde Karaciğer Yırtıklaması İle Kontrol Edilen Kontrolsüz Hemorajik Şok

Özet

Travma hastalarında önemli bir mortalite nedeni olan kontrolsüz kanama, bir fare modelinde standart bir karaciğer laserasyonu kullanılarak modellenebilir. Bu model tutarlı kan kaybı, sağkalım ile sonuçlanır ve hemostatik ajanların test edilmesine izin verir. Bu makale, bu değerli modeli gerçekleştirmek için adım adım süreç sağlar.

Özet

Kontrol edilemeyen kanamalar travma hastalarında önlenebilir ölümlerin önemli bir nedenidir. Sürekli kan kaybı, hemodinamik değişiklikler ve hayatta kalma ile sonuçlanan bir karaciğer laserasyonuyla kontrolsüz kanamaya ait fare modelini geliştirdik.

Fareler, karaciğerin sol orta lobunun standartlaştırılmış rezeksiyonuna girerler. Mekanik müdahale olmaksızın kanamalarına izin verilir. Hemostatik ajanlar, araştırmacının ilgisine bağlı olarak tedavi öncesi veya kurtarma tedavisi olarak uygulanabilir. Hemoraji sırasında sol femoral arteriyel hat üzerinden gerçek zamanlı hemodinamik takip yapılır. Fareler daha sonra kurban edilir, kan kaybı nicelleştirilir, kan daha ileri analiz için toplanır ve yaralanmaların analizi için organlar hasat edilir. Deneysel tasarım, birden fazla hayvanın eşzamanlı test edilmesini sağlamak için açıklanmıştır.

Kontrolsüz kanama modelinde karaciğer kanaması var iLiteratürde, başta sıçan ve domuz modellerinde. Bu modellerden bazıları hemodinamik izleme kullanır ya da kan kaybını nicelleştirir ancak tutarlılık yoktur. Mevcut model, kontrolsüz kanamada patofizyolojik mekanizmaları daha ileri araştırmak için transgenik hatların kullanılması ve yüksek verimli bir mekanizma avantajı sunan bir fare modelinde, gerçek zamanlı hemodinamik izlemenin kan kaybının miktarının belirlenmesini içermektedir.

Giriş

Travma, dünya genelindeki gençler arasında önde gelen ölüm ve sakatlık nedenidir. ¹ Kontrolsüz kanama ağır yaralı travma hastalarında önde gelen mortalite nedenidir. Hemorajing travmalı hastanın yönetimi iki aşamalıdır: cerrahi kanamanın kontrolü, ve resüsitasyon ve kayıp kanın değiştirilmesi.

Hemorajik şokun hayvan modelleri, travma araştırmalarında temel taşlardır ve travmatik / hemorajik şokun patofizyolojisinin ve tedavisinin değerlendirilmesinde kullanılabilir. ^{3 , 4} Hayvan modellerinde Şok, kontrollü hemoraji ve kontrolsüz kanama olmak üzere iki yöntemle geniş ölçüde başarılabilir. ^{5 , 6} Kontrollü kanama, belli bir kan basıncını (sabit basınç) elde etmek için sabit bir kan hacminin çıkarılması veya kan alınması ile gerçekleştirilir. SüreSe modelleri, hemorajik şokun mekanizmalarında ve immün değişikliklerde değerlendirilmesinde yararlıdır, hemostatik ajanların test edilmesine uygun değildir ve travmayı takiben kanama senaryosunu taklit etmemektedir. Bu dereceye kadar kontrolsüz bir kanama modeli geliştirdik ve böylelikle bir fare modelinde hemostatik değişiklikler ve koagülan önleyici ajanlar test ettik. Karaciğer, kısmen kontrolsüz kanama için cazip bir seçenektir çünkü kısmen kan çift karbondan sağlanmaktadır ve hem künt hem de penetran travmada en sık yaralanan karın içi organlardan biridir. Yüksek klinik önemi göz önüne alındığinde, karaciğer, çoğunlukla sıçan ve domuz modellerinde, ancak son zamanlarda primatlarda kontrolsüz kanama modeli olarak kullanılmıştır. ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} Murin modelleri, ezilme modeli veya künt travma gibi karaciğer hasarını da içermektedir; Bununla birlikte, bu modeller karaciğer hasarına bağlı olarak hemorajik şoka neden olmaz. ^{13 , 14}

Kontrolsüz karaciğer kanamasının sıçan ve domuz modelleri, resüsitasyon uygulamalarına ve hemodinamik izlemeye değer olsa da, maliyet, kullanılan hayvanlar sayısı ve analiz için mevcut olan transjenik hatları gibi çeşitli nedenlerle fare modeline göre daha avantajlıdır Belirli hücresel ve moleküler sinyalizasyon. Mevcut fare modeli, standart karaciğer laserasyonu, kan kaybı kantifikasyonu, hemodinamik izleme ve sağkalım analizini yapma kabiliyeti gibi mevcut karaciğer kanamaları modellerine önemli benzerlikler paylaır. Mevcut birçok model yalnızca bu yönlerden bazılarını içerirken, modelimiz fizyolojik varia'nın çoğunu ölçmek için geliştirilmiştirAynı anda ve birden fazla farede bulaşır. Ayrıca, bir fare modelinin geliştirilmesi, resüsitasyonun ötesinde araştırmalara ve ileri moleküler teknikler kullanarak yüksek verimli bir maliyet modeli potansiyeli olan kontrolsüz kanamada daha büyük patofizyoloji mekanizmalarına kapı açmaktadır.

Protokol

Fareler, Pittsburgh Üniversitesi'nden (Pittsburgh, PA, ABD) ve Ulusal Sağlık Enstitülerinden (NIH; Bethesda, MD, USA) belirli patojen içermeyen koşullarda, 12 saat açık-karanlık döngülerle ve serbest erişim olanağına sahip hayvan bakım kılavuzlarına uygun olarak barındırıldı. Standart yem ve su. Tüm hayvan deneyleri, Pittsburgh Üniversitesi'ndeki Hayvan Araştırma ve Bakım Komitesi tarafından belirlenen kurallara uygun olarak onaylandı ve yürütüldü.

1. Cerrahi Alan ve Enstrüman Kurulumu

1. Prosedürden önce tüm cerrahi aletleri, sütürü, gazlı bezleri, pamuklu uç aplikatörlerini, boruları ve boru bağlantılarını sterilize edin.
   1. Bir otoklavda cerrahi aletleri, sütürü, gazlı bezleri ve pamuk ucu aplikatörlerini sterilize edin. Boru ve tüp konektörlerini etilen oksitle sterilize edin.
2. Cerrahi alanı
   1. Su ile dolaşan bir ısıtma yastığı açın ve 37 ° C'ye ayarlayın. Surgi koyÜzerine mavi ped koyun ve daha sonra cerrahi mavi pedin üzerine steril bir örtme örtüsü yerleştirin.
   2. Tüm sterilize edilmiş aletleri steril örtüye açın. Bu adım esnasında sterilliği kesmekten kaçınmak için steril eldiven kullanın.
   3. % 70 etanol içeren paslanmaz çelik bir kaba doldurun ve kenara koyun. Bu, hayvanlar arasındaki araçları temizlemek için kullanılacaktır.
   4. Microbead sterilizatörünü açın ve 150 ° C'ye kadar ısınmasına izin verin. Bu aynı zamanda hayvanlar arasındaki araçları temizlemek için de kullanılacaktır. 5ten fazla farede ameliyat yapıyorsanız, aletleri yeni bir steril sete değiştirdiğinizden emin olun.
3. Dönüştürücü Kurulumu
   1. Steril bir dönüştürücü, PE-50 tüp, iki adet 23G iğne ve erkek erkek luer ve üç yönlü bir tıkaç bağlayın. ⁶
   2. Üreticinin talimatlarına göre çeviriciyi kalibre edin ve sıfırlayın.

2. Karaciğer laserasyonu cerrahi prosedürü

1. Anestezi İndüksiyonu ve Konumlandırılması
   1. Sodyum pentobarbital intraperitoneal olarak 70 mg / kg dozunda enjekte edilir. Anestezi 5-10 dakika arasında sürmelidir; Anestezi derinliğini ayak parmakları ile tespit edin. Fare ayak parmağına tepki gösteriyorsa ek zaman veya anestezi gereklidir. Prosedür sırasında ilave anestezi gerekiyorsa, sodyum pentobarbital ekleyin. Doz aşımını önlemek için 0.05 mL'den daha büyük miktarlarda takviyeler vermeyin.
   2. Farenin tamamen anestezi altında kaldıktan sonra, fareyi bir cerrahi tahtaya yatırın. Farenin dört ucunu bantla tahtaya sabitleyin.
   3. Karın ve bilateral kasıklarını ustura ile tıraş edin.
   4. Steril gazlı bezleri betadin ile ıslatın ve karın ve bilateral kasık ameliyatı için uygulayın. Hayatta kalma deneyleri için karın ve kasıkları betadinle, ardından etanol ile toplam üç hazırlık döngüsü için hazırlayın.
   5. İşlem boyunca çekirdek sıcaklığını izlemek için bir rektal sıcaklık probu takın. C tutunCevher sıcaklığı 35-37 ° C arasındadır.
2. Femoral arter ve venöz kanülasyon
   1. Venöz kateterin kurulumu için: PE-10 tüpünü, 30 G'lik bir iğneyi ve IV torbadan Laktated Ringer solüsyonu ile üç yönlü bir tıkaç doldurun.
   2. Arteryel kateterin kurulumu için: PE-10 hortum ve 30G iğneyi heparinize salin (1: 10 seyreltik 1,000 U heparin) ile doldurun. Pıhtılaşmayı önlemek için heparin salin gerekir.
   3. Fareyi bir mikroskop altında bırakın.
   4. Cerrahi İris makas kullanarak kas iskeletine 4-5 mm uzunlamasına bir kesi yapın. Dumont forseps kullanarak adduktor kasına bağlı yağ dokusunu kapar ve femur demetinin temiz bir şekilde maruz kalması için yanal olarak çekilir. Yağ dokusuyla parçalanmayın; bu vasküler yaralanmaya neden olacaktır.
   5. Dumont forsepsiyle damarı ve damarı dikkatle ayırın. Sinire bitişik bir yağ yastığı var. Bunu bir Dumont forcep ile tutunYanal olarak çekin; Bu sinir diseksiyon için bir düzlem oluşturan arterden uzaklaşır. Diğer Dumont forcep ile sinir ve arter arasındaki bağ dokusunu keskin bir şekilde inceleyin.
      1. Diseksiyonun bu kısmı sırasında sinir tutmayın.
   6. Profunda femorise yakın arter ve damardaki üç adet 6-0 ipek dikiş yerinden çıkın.
      1. En yakın proksimalde sütür 1 yerleştirin ve gevşek bırakın.
      2. Dikiş 2'yi en uzaktan yerleştirin ve hemen bağlayın.
      3. Sütür 1 ve 2 arasına sütür 3 yerleştirin ve gevşek bırakın.
   7. Geminin ventral yüzeyi üzerinde bir arteriotomi yapın. Damarın kesilmesini önlemek için arteriotomi yapmak için mikrovasküler makas kullanılması önerilir.
   8. Üç yollu kateter artere yerleştirilir. Kateteri yerine sabitlemek için Sütür 1 ve 2'yi derhal sıkın.
   9. Üç yollu kateteri dönüştürücüye bağlayın ve temel kan basıncı verilerini toplayın.
   10. Karşıt kasık üzerinde 2.2.4 - 2.2.6 adımlarını tekrarlayın. Femoral veni atardamere benzer şekilde kanüle edin. Geminin ventral yüzeyinde venotomi yapın ve bunu takiben kateter yerleştirin. Bu kateter sıvı veya ilaç uygulaması için kullanılabilir.
3. Karaciğer laserasyonu
   1. 0.5 mL PBS, üç emilim üçgeni ve bir fare ağırlığı tekerleği içeren bir tüpü önceden tartın.
   2. Karafiodan başlayıp karaciğerin tamamen maruz kalmasına izin vermek için kaudal uzanan bir ventral orta hat laparotomi insizyonu yapın.
   3. Karında sağ karın duvarına karşı bir emilim üçgenini yerleştirin. Sol tarafta tekrarlayın.
      1. Karaciğer lekelenmesinden sonra bir paketleme hemostatik etkiden kaçınmak için emilim üçgeninin karaciğerden uzakta olmasına dikkat edin.
   4. Karaciğerin sol orta lobunu dikkatli bir şekilde kapınız ve lob makul sterilizatör ile% 75 oranında loblastınız. Kesikliğin yeriniD segmentini PBS içeren bir tüpte yıkayın.
   5. Bir zımba aplikatörü vasıtasıyla karın duvarını zımba ile kapatın. Cildi ve kasları birlikte tutun ve elyaf ateşleyin. Karın dışındaki kan kaybını önlemek için bunu karaciğer laserasyonundan sonra mümkün olduğunca çabuk yapın. Hayatta kalma deneylerinde, karın iki kat kapalıdır. Kas için çalışan bir absorbe edilebilir dikiş, ardından cilt için emilebilir olmayan sütürden oluşan bir tabaka yeterli kapatmayı sağlar.
   6. Hayatta kalma süreleri 30 dakikadan fazla olan fareler için, femur kateteri çıkarılmalı, arter ve ven adım 2.2.6'dan dikiş 3 ile bağlanmalıdır. Bilateral kasıklar daha sonra önceki aşamada anlatıldığı gibi iki kat halinde kapatılır.
   7. Kanama için belirli bir zaman süresinin ardından (30 dakika ila 72 saat arası), zımbaları çıkarın. Emilim üçgenlerini çıkartın ve önceden tartılmış olan tartım teknelerine koyun. Emilmemiş kan emmek için ilave absorpsiyon üçgenleri kullanın.
   8. Toplam kan kaybını hesaplamak için emilim filtrelerini tartın.
4. Ameliyat sonrası bakım
   1. Kurban edilmek istenen fareleri 30 dakika içinde cerrahi kurul üzerinde bırakın ve sürekli gözlem altında ve tam anestezi altında kurban etme zamanı olun. Fareler, kardiyak ponksiyon ve inhale izofluran doz aşımı kombinasyonu ile ötenazi yapılır.
   2. Daha uzun sağkalım süresi noktaları olan fareleri su ile dolaşan bir ısıtma masasının üstündeki bir kurtarma kafesine yerleştirin. İyileşme sırasında fareyi sürekli olarak izleyin ve sternal uyumayı sağlamak için bilinç kazanana kadar gözetimsiz bırakmayın. Anesteziden kurtulduktan sonra fareyi kafes boşluğuna diğer farelerle geri getirin.
   3. Post-operatif analjeziyi 0.1 mg / kg bupreneks ile, anesteziden bir kez alındıktan sonra ve fedakarlık zamanı 12 saat sonra, subkutan enjeksiyon yoluyla uygulayın.
   4. Fareler, kendilerine geri gönderildikten sonra farelerden yiyeceklere ve suya serbestçe erişmelerine izin verin.Ameliyat sonrası normal kafesler.
   5. Sağkalım fareleri için feda edildiğinde anestezi, inhale izofluran ile başarılır. Bir kez anestezi altında kan sağ kalp kardiyak ponksiyonu yoluyla toplanır, kan kaybı yukarıda tarif edildiği gibi kaydedilir ve nihayetinde aşırı doz izofluran ile ötanazi sigortalanır.

Sonuçlar

Karaciğer laserasyon modeli farelerde tekrarlanabilir ve tutarlı kan kaybına neden olur. Şekil 1A , sadece 0.02 g'lık bir standart sapma ile elde edilebilen, yırtılmış karaciğere ait tutarlı ağırlığı göstermektedir. Lacerated karaciğer ağırlığı bu tutarlılık, modeller fareler arasında çoğaltmak için yeteneği sağlar ve farklı resüsitatif protokolleri gibi farklı deneysel kurulumlar. Yırtıklanmış karaciğerin tekrarlanabilir ağır...

Tartışmalar

Burada açıklanan fare karaciğer laserasyon modeli, kontrolsüz kanamaya karşı güvenilir, tutarlı bir model sağlar. Bu model gerçekleştirmek kolaydır, ancak titiz bir değerlendirme gerektiren önemli adımlar vardır. Modelin en teknik açıdan zor kısmı, femoral damarların hemodinamik izleme ve sıvı / ilaç uygulaması için kanülasyonudır. Sinirin diseksiyonu ve arteriotomi / venotomi sırasında dikkatli olunmalıdır. Özellikle hayatta kalma modelleri için sinir hasarından ve muhtemel paralizide...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
SS/45 dumonts	Fine Science Tools	11203-25
surgical scissors	Fine Science Tools	14068-12
hemostats	Fine Science Tools	13009-12
microscissors	Fine Science Tools	15000-08
0.8 mm curved forceps	Fine Science Tools	11009-13
suture reel 6-0	Fine Science Tools	18020-60
suture 4-0 silk w/ needle	Owens Minor	K188H
gauze 4 x 4	can be purchased through any global vendor
cotton-tip applicator	can be purchased through any global vendor
30 G needle	can be purchased through any global vendor
23 G needle	can be purchased through any global vendor
10 cc syringe	can be purchased through any global vendor
50 cc conical tube	can be purchased through any global vendor
1 cc syringe w/ 25G needle	Fisher Scientific	14-826-88
Polyethylene 10 tubing 100`(PE-10)	Fisher Scientific	14-170-12P
Polyethylene 50 tubing 100`(PE-50)	Fisher Scientific	14-170-12B
3-way stopcock	Fisher Scientific	NC9779127
surgical blue pad	Fisher Scientific	50-7105
Sterile Field dressings	Fisher Scientific	NC9517505
tape rolls 1"	Corporate Express	MMM26001
straight side wide mouth jars	VWR	159000-058
stainless steel tray 8" x 11"	VWR	62687-049
male-male leur lock 3-way	VWR	20068-909
sterilization pouch 3" x 8"	VWR	24008
sterilization pouch 5" x 10"	VWR	24010
absorption triangles	Fine Science Tools	18105-03
7 mm wound clip applier	Fisher Scientific	E0522687
1,000 7 mm wound clips	Fisher Scientific	E0522687
betadine (4 oz)	can be purchased through any global vendor
sterile gloves	can be purchased through any global vendor
eppendorfs	can be purchased through any global vendor
1/2 cc Lo-Dose insulin syringe	Fisher Scientific	12-826-79
small weigh boat	can be purchased through any global vendor
lactated ringers	can be purchased through any global vendor
hepranized saline solution (.1 µL; hep + 9.9 µL; NaCl)	can be purchased through any global vendor
phosphate buffered saline	can be purchased through any global vendor
pentobarbital	can be purchased through any global vendor
Wild M650 microscope w/ boom stand	Leica
Digi-Med BPA-400 analyzer & systems integrator	Micro-Med	SYS-400
TXD-310 (Digi-Med Transducer)	Micro-Med	TXD-300
Computer	Dell
microbead instrument sterilizer	VWR	11156-002
Oster A5 clippers w. size 40 blade	VWR	10749-020
circulating heating pad 18 x 26	Harvard	py872-5272
rectal thermometer	Kent Scientific	RET-3