Değerlendirme endokrin omurgalı Neural ağ işlevi çoklu elektrot dizileri kullanarak geliştirme bileşikler engellemeden etkilerinden

Özet

Çevresel toksinlere maruz akut gelişmekte olan embriyo etkileyebilir. Bisphenols sinir sistemi üzerinde olumsuz bir etkisi olduğu bilinmektedir gibi kimyasallar engellemeden endokrin. Burada bir vitro Omurgalılar (civciv embriyo) nöronal ağ modeli toksin pozlama erken embriyo üzerinde fonksiyonel etkisini incelemek için bir iletişim kuralı'nı açıklar.

Özet

BIS-fenoller, bis-fenol A (BPA) ve BIS-fenol-S (bit/sn) gibi yaygın olarak kullanılan plastik ve çok sayıda günlük ürünleri üretiminde aracılar polymerizing. Endokrin dağıtmak bileşikler (EDC) estradiol benzeri özelliklere sahip olarak sınıflandırılır. EDCs, uzun süreli maruz kalma düşük dozlarda bile, erken gelişim dönemleri sırasında büyük güvenlik açığı ile kanser, davranış bozuklukları ve kısırlık, dahil olmak üzere çeşitli sağlık kusurları ile bağlantılı olmuştur. BPA nöronal fonksiyon gelişimi üzerine etkisi, biz erken piliç embriyonik beyin bir model olarak türetilen bir vitro nöron ağı çalışırdım. Bu maruz kalma bulduk BPA etkilenen ağ etkinliğini, gelişimi özellikle etkinlik ve eşitleme yükseliyor. Bir ilacın veya bileşik moleküler hedef ve davranış sonucu üzerindeki etkisi arasında çok önemli bağlantı ağ etkinliğini bir değişimdir. Çoklu elektrot dizilerin giderek ağ aktivite içinde in vitroilaç etkilerini incelemek için yararlı araçlar hale gelmektedir. Var birkaç sistemleri elde edilebilir içinde belgili tanımlık çarşı ve rağmen elektrotlar, türü ve elektrot dizi ve analiz yazılımı, temel temel ilkeleri, kalite farklılığı ve elde edilen veriler arasında aynıdır farklı sistemleri. Şu anda iki boyutlu vitro kültür analizi için sınırlı olmasına rağmen in vivo ağ etkinliğini beyin dilimleri içinde etkinleştirmek için bu MEA sistemleri geliştirilmektedir. Burada, embriyonik pozlama ve nöronal ağ etkinliğini ve senkronizasyonu, temsilcisi sonuçları ile birlikte kaydetmek için detaylı bir protokol sağlar.

Giriş

4, 4 '-Isopropylidenediphenol, yaygın olarak Bisfenol-A atıfta veya BPA, bir anti-oksidan katkı polikarbonat zengin çeşitte bulundu ve epoksi reçine bazlı ürünler, termal kağıt arasında değişen CD ve paramparça geçirmez Cam, iç kaplanması İçecek kutular. BPA östrojen¹taklit eden dağıtmak menajer endokrin anılmasına karşın, hasta etkileri BPA her gün rahat maruz üzerinde çalışmalar çoğunlukla son 10-15 yıl içinde dışarı geldi. BPA maruz kalma bile düşük düzeylerinin en derin embriyogenez aracılığıyla pozlama anneler^2,3sırasında da dahil olmak üzere erken gelişimsel dönemlerde sonuçlarıdır. Kadın embriyolar rahim içinde maruz kimyasallar engellemeden endokrin da artan hastalığı duyarlılık vajinal meme kanseri^4,5üzerinden bağlanmıştır. Hayvan çalışmaları atipik beyin yapısı ve fonksiyonel anormallikler davranış⁶' tecelli BPA maruz yol gösterdi. Sonuç olarak, bebek besleme şişe BPA kullanımında Avrupa ve Kuzey Amerika, FDA da dahil olmak üzere en düzenleyici kurumlar tarafından yasaklandı. Düzenlemeleriyle uyum sağlamak için birçok üretici 4, 4'-sulfonyldiphenol ya da Bisfenol-S (BPS) geçiş yaptınız. BPA ve BPS yapısal analogları ve son raporlar östrojenik transkripsiyon⁷' BPS karşılaştırılabilir potens gösterdi vardır dayanarak gerçeğine, bileşik bu göreceli olarak BPA toksisite eğitim önemlidir.

Burada nöronların omurgalı manken civciv embriyo kullanarak ağlar üzerinde BPA (ve diğer EDCs) etkilerini sınamak için bir protokol açıklayın. Vitro kültür nöronların sinaptik kişiler oluşturmak ve aksiyon potansiyelleri (ani olarak da bilinir) oluşturur. Bu kültürlerin spiking etkinlik çoklu elektrot dizi (MEA) sistemleri kullanılarak kaydedilir. Sivri 5 ms içinde oluştuğunda senkronizasyonu kabul edilir. Sonunda eşitler ilk rastgele spiking faaliyet nöronal ağları^8,9geliştirme önemli bir özelliktir. Senkronizasyonu çeşitli yöntemlerle ölçülebilir ve çeşitli algoritmalar edebiyat^9,10,11' açıklanmıştır. Bizim analizleri, MEA koordinat belirleme sistemi sürücüler kayıt yazılımı entegre Paiva ve iş¹² tarafından geliştirilen bir algoritma kullanıyoruz. Sağlam spiking faaliyeti embriyonik piliç nöronların BPA etkisi neural ağ etkinlik¹³eğitim için bir prototip sağlar. Kayıt spiking etkinlik için çoklu elektrot dizileri kullanarak, BPA maruz kalma nöronal spiking senkronizasyonu^9,14gelişimi inhibe görülmektedir. Burada, BPA maruz civciv embriyo nöronlar piliç embriyonik kültürlerde nöronal spiking senkronizasyonu geliştirme temsilcisi sonuçları ile birlikte kültür üzerinde çalışmak için detaylı bir metodoloji sağlamak.

Protokol

Aşağıda belirtilen iletişim kuralı etkileri BPA maruz kalma sırasında (erken) embriyo test etmek için standart ve bit/sn, BPF veya diğer EDC piliç embriyonik nöronlar içinde kullanılmak üzere değiştirilebilir.

Bu iletişim kuralı Delaware Eyalet Üniversitesi Kurumsal ilkeleri ve kuş embriyo NIH poliçesinin izler. Protokol Ayrıca onay DSU'ın malzeme ve kimyasal güvenlik yönergeleri ile mevcuttur.

1. malzeme Kur

1. BPA (m.w. 228.29) % 10 etanol (v/v) yapmak a 1 mM hisse senedi eriyik (mL % 10 etanol 0,23 mg) suda çözülür. Sonraki dilutions (0,1 µM, 0.5 µM, 1 µM, 5 mikron ve 10 µM) neurobasal ortamda yapmak.
   Dikkat: BPA çevresel bir toksindir ve bakım tozu ele alırken edilmelidir.
2. Piyasada bulunan bir masa üstü kuluçka 37 ° C'de piliç yumurta kuluçkaya Yumurta E7 embriyo 7 gün kuluçkaya.
3. 3-4 h için % 70 etanol ıslatarak bana gerekli sayıda ölçü birimi Sterilize hazırlamak ve sonra üç kez içinde yaklaşık 10 mL steril distile su BSLII Hood durulayın.
   Not: Bana bir 8 x 8 kılavuz düzenlenmiş 64 nanoporous Platin elektrotlar içerir. Elektrot çapı 30 µm ve elektrotlar arasındaki aralığı 200 µm. Denatüre etanol gibi bu MEA korozyona yol açacaktır Guinan sterilizasyon için kullanmayın.
4. (Steril koşullar korumak için) bana kapak ile steril bir kap içine yerleştirin ve bir masa üstü kuluçka için hareket. En az 6 saat 55 ° C'de pişirin Bu uygun sterilizasyon için kritik bir adımdır ve sıcaklık 60 ° C. geçmemelidir Kısırlık Bakımı, bana BSLII hood için depolama için daha fazla kullanımı kadar içeren yemek taşımak.
   Not: Biz plastik kapak ile bir fırın güvenli cam pişirme çanağı kullanın ve yüzey sterilize % 70 etanol ve kurutma için BSLII hood yerde.
5. Aliquot ekstra hücresel matris ECM çözümü. Şişeyi 4 ° C'de gecede çözülme ve 100 µL aliquots-20 ° C'de dondurmak
   Not: ECM donmuş sevk edilir. ECM oda sıcaklığına kadar hazır oda sıcaklığında polymerizes ve sonra polimerli, bu ceket için imkansız gibi kat için getirilmelidir değil. ECM büyüme faktörleri olmadan Bilinmeyen faktörler nedeniyle ek etkileri önlemek için tercih edilir.
6. Tüm diseksiyon aletleri (Dumont #5 forseps, kıvrımlı pensler, küçük makas ve bahar makas) sterilize ve kendinden contalı malzeme diseksiyon yemekleri % 70 etanol ile kaplı ve koyup diseksiyon mahallede kuruyuncaya kadar bırakın.

2. piliç embriyonik nöron kültürü ve ağ etkinliğini

1. Kaplama günü, bir şişe kaldırmak % 70 etanol ile-20 ° C-dondurucu dan ECM sprey ve Buza koyun. % 25'e 300 µL soğuk neurobasal orta BSLII hood içine ekleyerek sulandırmak.
2. Bir P200 pipetteman eklemek 100 µL % 25 ECM elektrotlar dokunmaya değil ve yüzeyde ince bir film ayrılmadan hemen kaldırmak için dikkat çekici MEA ortasına. MEA kapak ve nöronlar plaka için hazır kadar CO₂ kuluçka (37 ° C ve % 5 CO₂) yerleştirin.
3. E7 yumurta (embriyonik gün 7, 7 gün süreyle 37 ° C'de inkübe) dış kabuğunun % 70 etanol ile sterilize. Embriyo soğuk steril Hank'in dengeli tuzlar çözüm (HBSS) kalsiyum olmadan içeren bir Sylgard alt diseksiyon çanak içine başını kesmek. Göz çevresi kesmek ve gözbebekleri kaldırın. DuMont #5 kullanarak ince forseps ve bahar makas ventral tarafta bir kesi yapın ve dış katmanlarını deri ön ve optik tectum ortaya çıkarmak için kaldırın. Soyma ve pial membran dikkatli bir şekilde çıkarın. Ön başka bir petri kabına aktarın ve bahar makasla yaklaşık 2 mm küçük parçalar halinde kes.
   Not: Değil herhangi bir kan damarları için ön pial membran çıkarıldıktan sonra bağlı olmalıdır. Aletleri ve diseksiyon alanı iyice % 70 etanol ile sterilize sürece bir başlık dışında diseksiyon gerçekleştirildiğinde oldukça iyi sonuçlar elde varsa, diseksiyon bir steril diseksiyon başlık, gerçekleştirmek için tercih olsa da .
4. Steril transfer pipet kullanarak, bir 15 mL santrifüj tüpüne ön parçaları toplamak ve HBSS mümkün olduğunca daha fazla ön lavabo santrifüj tüpü dibine parçalarını icar sonra kaldırın.
5. 1 mL % 0.05 ekleyin tripsin/EDTA (37 ° C için önceden ısındı) ve 37 ° C'de 15 dakika boyunca kuluçkaya.
6. Pasteur pipet kullanarak, dikkatle doku parçaları bozmadan tripsin kaldırın ve 1 mL neurobasal orta ekleyin. Doku Lavabonun altına parçaları izin ve orta kaldırın. Bu yıkama bir kez daha yineleyin. Bu adım tripsin/EDTA yıkayın etmektir.
7. Neurobasal orta 2 mL ekleyin ve triturating başlar. Toz steril bir yangın cilalı Pasteur pipet alarak ve doku yok daha fazla parçalar görülür kadar doku o ile birkaç kez hafifçe geçen içerir. Herhangi bir adet sonra tekrarlanan geçer kalırsa, sadece altına yerleşmek bırakın.
   Not: köpük oluşturmak, durup, aspirasyon tarafından kaldırmak - triturating süre renginde solma kaçının.
8. Yeniden askıya alınan hücreler 1:10 neurobasal orta ile sulandırmak ve hücrelerin Trypan mavi boya ve bir hemasitometre kullanarak say. Mix 50 µL 0.5 mL santrifüj tüpü Trypan mavi çözümün 50 µL ile seyreltilmiş hücre. Coverslip koyduktan sonra hemacytometer için 10 µL ekleyin ve parlak açık hücreleri (mavi hücreler öldü ve yok sayılması) saymak.
   Not: Tipik cep numaraları 1 ile 5 x 10⁷ hücre/mL arasında tek E7 optik tectum aralığından.
9. Disosiye plaka ECM hücrelerdeyse 2200 hücreler/kare mm bir yoğunluk Guinan kaplı. MEA sistemimiz için bu MEA başına yaklaşık 130.000 hücre çevirir. Birim içinde MEA için 1 mL getirmek ve CO₂ kuluçka hücre eki ve neurite (şekil 1) uzantısı için bir gecede bana yer neurobasal orta ekleyin.
   Not: Farklı alanlarda ve elektrot numaraları Guinan farklı hücre yoğunluğu çalıştı - genel olarak, daha yüksek hücre yoğunluğu büyük ağ faaliyet sonuçları, ama aynı zamanda daha kısa ömürlü kültürler için yol açar.
10. Ertesi gün, adım 1.1 için tedavi MEA yapılan 1 mM stoktan neurobasal ortamda 10 µM son bir konsantrasyon için BPA ekleyin. Denetime MEA, % 10 etanol aynı birim su (v/v) çözüm ekleyin.
11. Harcanan orta neurobasal orta içeren 10 µM ile BPA her geçen gün 7 gün vitro (7DIV) ve bundan sonra her gün kadar ağ aktivite arttıkça değiştirin.
    Not: ağ aktivite arttıkça, metabolik aktiviteyi artırır ve medya değişikliklerini daha sık olması gerekir. Turuncu açmak orta izin vermeyin.

3. kayıt nöronal ağ etkinliğini

1. Satın alma günü, taze neurobasal orta ile Kültür ortam değişimi ve ölçü CO₂ kuluçka en az 2 h kayıt önce geri dönün. Kayıt yazılımı çalıştırın ve MEA sıcaklığı 37 ° C sıcaklık ikonuna tıklayarak ayarlayın (tamamlayıcı şekil 3.1a-b).
   Not: Kayıt günü 3 kaplama olarak erken başlayabilir ve kültürler hayatta olduğu sürece devam edebilirsiniz.
2. (Altında akarsu sol pencerede Masası'nda) "Muse" ikonuna tıklayarak satın alma parametrelerini ayarlamak ve "işleme Ekle" ve "Spike dedektörü" seçin ve pencere açılır içinde Tamam'ı tıklatın. "Spike dedektörü (6 x STD)" dosya adının altında görünür (tamamlayıcı şekil 3.2a-b).
3. Sonraki Spike Dedektör üzerinde sağ tıklayın, "İşleme Ekle" ve "Patlama dedektörü" seçin ve pencere açılır içinde Tamam'ı tıklatın. "Dedektör patlama" (ısı) Muse simgenin altında görünecektir (tamamlayıcı şekil 3.3a-b).
4. Sonraki patlama Dedektör üzerinde doğru tıkırtı, seçme "Eklemek işleme" ve "Sinir istatistikleri derleyici." Pencere açılır, dosya üstbilgisi, de toplanan istatistikleri ve senkronizasyonu seçili olduğuna emin olun. Tamam'ı tıklatın. "İstatistikler derleyici"-ecek gözükmek altında (tamamlayıcı şekil 3.4a-b).
   Not: Bu adaptif eşik geçiş (6 x STD filtre), 100 ms arası spike aralıklarla sivri 5, 10 oranı algılama ateş demek en az sayıda ile ayarlar 20 ms bir senkronizasyonu parametrelerinin ve 0.083333 sivri min başına en az spike oranda s.
5. Zamanlanmış kayıt kayıt süresini 5 dakika (300.000 ms) için alt saat simgesine tıklayarak ayarlayın. Bu 5.1 dakikada kaydetmek ve 5 dakika boyunca kaydetmek için ayar bölümünde yer alan bilgileri değiştirerek elde edilir. Bu hemen başlatılır ve bir kez yürütülür (tamamlayıcı şekil 3.5).
6. MEA sıcaklığı 37 ° C MEA taşımadan önce ulaştığını emin olun. MEA kuluçka makinesi kaldırmak, kayıt biriminde yer ve MEA kilitleyin. Ağ etkinlik başlangıç kayıt zamanlanmış kayıt bölümünde ya da "Dosyayı yürütmek" penceresinde kayıt simgesini tıklayarak kayıt işlemini başlatmak. 10 dakika daha uzun kayıtları elde edilebilir, ancak genellikle, bir kayıt süresini 5 dakika (300.000 ms), yeterlidir.
7. Kaydettikten sonra bana da kuluçka için dönmek.
   Not: MEA İnkübatör dışında zaman en aza indirmek için ve kısırlık korumak için özen göstermelidir.

4. veri analizi

1. Çevrimdışı kayıt yazılımı kullanarak ham veri analizi yapılabilir. Dosya açılır menüsü tıklayın ve kayıt açık. Çözümlenmesi için ham veri dosyası seçin. Gerekli spiking parametreleri yakalamak için ham kayıtlar tekrarlanır.
2. Sivri ortalama sayı elde etmek için Spike dedektörü modülü kullanmak ve senkronizasyonu dizini elde etmek için sinirsel istatistikleri derleyici modülü kullanmak.
3. Spike dedektörü, patlama dedektörü ve istatistik derleyici modül olarak daha önce (Bölüm 3) yükleyin.
4. Spike bulmak, patladı dedektörü ve istatistik derleyici modülü windows içinde aşağı açılır menülerden Spike listesi, ağ veri bloğu liste ve ölçümleri, Gelişmiş seçmenizi sağlar.
5. Bir .csv dosyası yönettiği klasöründe oluşturur veri dosyası kaydetmeye başlamak için kayıt düğmesini tıklatın. Spike parametreleri - toplam sayısı sivri ve senkronizasyonu dizin - .csv dosyasında kaydedilir.
   Not: Bu işlemci zamanını ve hesaplama kaynaklarını tüketmek gibi gerçek zamanlı analiz ham veri kaydederken tavsiye edilmez.

Sonuçlar

Senkronizasyonu geliştirme civciv embriyo nöronal kültürlerde BPA etkisi incelenmiştir. Etkinlik spiking eşitleme nöronal ağları içinde vitronormal gelişimi bir göstergesidir. İki sivri 5 ms içinde oluştuğunda, onlar zaman uyumlu olarak kabul edilir. Vitro nöron kültürler başlangıçta rasgele spiking etkinliği görüntülemek — sivri ortaya rastgele ve arası spike aralıkları bir normal dağılım gösterir. Kültürler olgun, spiking etkinlik daha senkronize olur ve arası spike aralıkları sabittir. Zaman uyumlu spiking etkinliği bir kültürün çapraz korelasyon analizi spike senkronizasyonu dizin (SI) türetmek için yazılım¹² kayıt kullanarak kez quantitated. BPA maruz kalma olumsuz azaltarak spiking etkinlik ve senkronizasyonu dizin (Şekil 2bir ve 2b) ağ etkinliğini geliştirme etkiler bulduk. Özet olarak, biz bir embriyo zararlı etkileri BPA maruz kalma kültür nöronlarda piliç senkronizasyonu geliştirilmesi yoluyla tespit edilebilir nöronal işlevi de dahil olmak üzere onun gelişme etkileri göstermiştir.

Şekil 1: Şematik diseksiyon piliç ön adımları ayrılma, kaplama ve ağdaki etkinliğini kaydetmek için tasvir Protokolü'nün. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: (A) sivri ortalama sayısı önemli ölçüde daha düşük BPA tedavi kontrol kültürler için karşılaştırıldığında E7 piliç ön kültürler. Sivri ortalama sayısı kayıt yazılımı kullanarak ayıklandı. Anlamına gelir (kontrolü, 14,890 ± 949.0, N = 15 ve BPA, 5,624 ± 465.9, N = 22) önemli ölçüde farklı olduğunu (unpaired t-Testi, p < 0.0001). (B) ortalama senkronizasyonu (SI) önemli ölçüde daha düşük dizinidir BPA tedavi kontrol kültürler için karşılaştırıldığında E7 piliç ön kültürler. SI sinirsel istatistikleri derleyici modülü içinde kayıt yazılımı kullanarak ayıklandı. SI anlamına gelir (kontrolü, 0.5159 ± 0.06547 N = 15 ve BPA, 0.1140 ± 0.01840 N = 22) önemli ölçüde farklı olduğunu (unpaired t-Testi, p < 0.0001). Hata çubukları standart sapma tasvir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Hızlı büyüme ve embriyogenez gibi geliştirme aşamalarını BPA de dahil olmak üzere çeşitli endokrin engellemeden bileşikler zararlı etkilerini özellikle güvenlik açığından etkilenir. Detaylı iletişim kuralları etkileri BPA maruz kalma bir vitro omurgalı nöronal ağ modeli eğitim için sağlar. Bu iletişim kuralını kullanan, BPA spike oranı yanı sıra gelişmekte olan nöron ağları (Şekil 2a-b) senkronizasyonu dizinde düşürür kurdu.

Metodolojimiz BPA maruz kalma sırasında erken embriyogenez çalışmak için tasarlanmış ve kolayca diğer EDCs etkileri çalışmaya adapte edilebilir. Civciv embriyonik nöronal kültürler fare veya fareyi de dahil olmak üzere diğer omurgalı modellerle karşılaştırıldığında kurmak nispeten kolaydır. Ayrıca, ayrı bir hayvan odası için bir gereksinim olduğunu — bir laboratuvar tezgah üzerinde basit bir kuluçka bu deneyleri taşımak için yeterli. Biz EDC, BPA, etkisi ağ etkinliğini değerlendirmek için bir çoklu elektrot sistemi (MEA) nasıl kullanılacağını açıklar. Burada açıklanan protokoller diğer sistemlere uygulanabilir. Önemli bir özelliği bu iletişim kuralı, kısırlık korumaktır. Bu embriyo steril koşullar altında diseksiyon içerir — % 70 etanol ve steril Hank'in dengeli çözüm tuzlar kullanımı ile aletleri sterilize yeterli. Bir hafta boyunca toplanan verileri gibi bana steril işleme korumak için önemlidir. Kez kurulan nöronal kültürler uzun vadeli - en fazla üç ay için kültürlü — ve böylece uzun vadeli maruz EDCs ve diğer bileşikler nöronal ağ üzerinde çalışmak için yararlıdır. Bu iletişim kuralı bir başka önemli yönü kaplama diseksiyon üzerinden vakti geldi. 30 dk kuluçka dokusunun tripsin ile de dahil olmak üzere, en iyi zamanı. Uzun geçen, hücrelerin yoksul hayatta kalma süre.

Biz burada, herhangi bir kimyasal veya davranış ve sinir işlevi etkiler uyuşturucu değerlendirilmesi için uygulanacak temel protokol tanımlamak. Burada, mm²başına 2.200 hücre hücre yoğunluğu kullandık; Ancak, bu değiştirilebilir ve diğer hücre yoğunluğu kullanılabilir. Genel olarak, hücre yoğunluğu artan ağ aktivite - daha kısa sürede daha fazla sivri artar bulduk. Yöntem tarif, ağ etkinliğinin değerlendirilmesi etkileri kimyasalların çok yararlı olsa da kısıtlamalar bulunmaktadır. Bir yöntemin en büyük sınırlamalar bu tüp bebek kültürleri iki boyutlu omurgalı beyin üç boyutlu mimari yansıtmıyor olabilir olmasıdır. Bu dilim kayıtları kullanarak üstesinden gelebilir. Başka bir alternatif tedaviler gelişmekte olan civciv embriyo tarafından uygulamak için yumurta¹⁵geniş sonuna kesip küçük bir pencere tedavi rejimi sonunda beynini incelememize, kalın bir vibratome bölümlerde yapmak ve MEA için üzerine yerleştirin. ağ etkinliğini kaydetme.

Bizim iletişim kuralı ağ etkinliğini geliştirme EDCs etkisi incelenmesi sağlar ve bir mekanik olarak bu kimyasalların etkileri için keşif sunmaktadır önemlidir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 foreceps	Fine Science Tools	11251-10
Axion Muse MEA	Axion Biosystems	M64-GL1-30Pt200	Will be called MEA system in manuscript
Axis Software	Axion Biosystems		Will be called recording software in the manuscript
BPA	Sigma-Aldrich	239658-250g
curved forceps	Fine Science Tools	11272-50
EtOH	Sigma-Aldrich	64-17-5
Fertilized chicken eggs	from any local farm or Spafas
HBSS	Fisher	14170112
Hemacytometer	Fisher	02-671-6
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free	BD Biosciences	356231	Will be called Extra Cellular Matrix (ECM) in the manuscript
Neurobasal medium	BrainBits	Nb4-500
Neuroexplorer statistical software	Nex Technologies	Neuroexplorer version 5
Pasteur pipettes	Fisher	13-678-20A
spring scissors	Fine Science Tools	15514-12
Sylgard bottom dissection dishes	Living Systems Instrumentaion	DD-90-S-BLK-3PK
Trypan Blue dye	Fisher	15-250-061
Trypsin-EDTA	Fisher	15400054