JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu iletişim kuralı yüzey Mühendisliği pankreas adacıkları heparin dahil starPEG nanocoating nanocoating N- hydroxysuccinimide grupları ve adacık Amin grupları arasında pseudo-bioorthogonal Kimya yoluyla kullanarak elde amaçlamaktadır hücre zarı.

Özet

Hücre yüzey Mühendisliği implante hücreleri konak immün saldırılara karşı korumak. Ayrıca greft işlevini geliştirmek için hücresel manzara şekillendirebilirsiniz ve hayatta kalma sonrası nakli. Bu iletişim kuralı yüzey Mühendisliği pankreas adacıkları ultrathin heparin dahil starPEG (Hep-PEG) nanocoating kullanarak elde amaçlamaktadır. Pankreas adacık yüzey Mühendisliği için Hep PEG nanocoating üretmek için heparin succinimidyl süksinat (Heparin-NHS) ilk N-(3-dimethylamino propyl) - kullanarak onun karboksilat grupları değişikliğe göre sentezN'-etil carbodiimide hidroklorür (EDC) ve N- hydroxysuccinimide (NHS). Hep PEG karışımı sonra amino son functionalized sekiz kollu starPEG (starPEG-(NH2)8) ve Heparin-NHS polietilenin tarafından kuruldu. Adacık yüzey kaplama için fare adacıkları collagenase sindirim ve degrade arıtma Histopaque kullanarak yolu ile izole edildi. İzole adacıkları sonra buz soğuk Hep PEG çözüm NHS ve adacık hücre zarı Amin grupları arasında kovalent bağ izin vermek 10 dakika ile tedavi edildi. Nanocoating Hep PEG ile minimal değişiklik adacık boyuta çeker ve hacim ve heparinization adacıklar Hep PEG ile kan-aracılı anlık inflamatuar reaksiyon adacık nakli sırasında da azaltabilir. Bu "kolay-için-evlat edinin" hücre canlılığı ödün vermeden canlı hücreler yüzey Mühendisliği için yeterince hafif bir yaklaşımdır. Heparin bağlama benzeşimi için birden fazla sitokinler göstermiştir göz önüne alındığında, Hep PEG nanocoating de sınırsız fonksiyonel biyolojik arabulucu ve yaşam için çok katmanlı yüzeyler sağlar açık bir platform sağlar hücre yüzeyine Biyomühendislik.

Giriş

Hücre tabanlı terapiler tedavi edici etkinliği düşük hücre saklama ve zavallı hayatta kalma1,2sınırlıdır. Yüzey mühendisliği enzimatik manipülasyon yoluyla hücre, hücre tedaviler sonucu geliştirmek için peptid konjügasyon, bioorthogonal kimya, Biyomalzemeler ile fiziksel kapsülleme olmuştur istismar3,4, 5,6,7,8,9,10. Geçerli protokol yüzey Mühendisliği yaşayan hücrelerin hücre yüzeyine bir ultrathin heparin dahil starPEG (heparin-PEG) nanocoating uygulayarak bir "kolay-için-evlat edinin" yöntemi kullanarak elde amaçlamaktadır. Pankreas adacıkları yüzey Mühendisliği sunuldu burada of Langerhans adacıkları ve geçerli klinik adacık nakli aşağılayıcı sonuçlarının heterojen yapısı nedeniyle örnek olarak.

Nitekim, klinik adacık nakli Şu anda izole adacıkları karaciğer portal ven içine direkt enjeksiyon tarafından gerçekleştirilir ve bu yordamı yalnızca donör malzeme ve düşük terapötik etkinlik azlığı nedeniyle seçici hastalar için kullanılabilir 11. aljinat ve inflamatuvar ilgili fibrozis12, kimyasal dengesizlik nedeniyle ideal daha az olmasına rağmen geleneksel, aljinat adacık kapsülleme ve yüzey modifikasyonu için en sık kullanılan biomaterial oldu 13. Ayrıca, 100-200 µm arasında değişmektedir doğal adacıkları büyüklüğüne göre aljinat-adacık microcapsules hangi oksijen fizyolojik akışkanın mesafesini aşan daha büyük, 400 ve 800 µm arasında değişen vardır. Açıkorur adacık kapsülleme, i.e., adacıkları adacık hacminin önemli değişiklik olmadan Kapsüllenen, sonra geliştirilmiştir. Böylece, nanomembranes birikimi oluşur PEG, tetrafluoroethylene, silikon membran ya da çok katmanlı nanocoating ("katmanı tarafından katmanı" [LBL] tekniği olarak da bilinir) bildirdi, geliştirilmiş vitro adacık hayatta14 kaynaklanan ,15,16,17,18, LBL yaklaşım gerektirir olmasına rağmen genellikle geniş adacıkları dönem adacık canlılığı uzlaşma olabilir birden çok katman ifade için teslim . Ayrıca, biomembrane katmanlar veya nanomembranes ve adacık yüzey arasındaki hidrofobik etkileşimler elektrostatik veya kovalent Hofstede dayanan nanomembranes istikrarsızlık da endişeleri9,14 yol açmaktadır , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.

İntraportal adacık nakli, tedavi sonucunu encumbers başka bir sınırlayıcı faktör implante adacıkları ile kan trombosit toplamada kaynaklanan, doğrudan temas neden anlık kan-aracılı inflamatuar (IBMIR) reaksiyondur, Koagülasyon ve bağışıklık bir olumsuz etkisi veya istenmeyen hücresel etkinleştirme9. Bu sorunları gidermek için yıldız şeklinde Polietilen glikol (starPEG) oluşan bir ultra-ince nanocoating kurulan biyouyumluluk ve çok yönlülük adacık malzeme konut olarak hazırlanmıştır. Heparin, son derece sülfatlanmış glikozaminoglikan da starPEG nanocoating anti-inflamatuar, Anti-koagulant özelliklerini ve pro-anjiogenik büyüme faktörleri22işe alma tarafından vaskülarizasyon kolaylaştırmak yeteneği için kuruldu, 23.

Protokol

1. Starpeg Nanocoating Heparin dahil imalatı

  1. Heparin succinimidyl süksinat (Heparin-NHS) sentezi
    1. Heparin 0.69 g tartmak ve buz gibi soğuk deiyonize su 2.0 mL geçiyoruz.
    2. NHS 0,23 g tartmak ve bir yuvarlak alt şişe buz gibi soğuk deiyonize suyla 0.5 ml geçiyoruz.
    3. EDC 0,77 g ağırlığında ve bir yuvarlak alt şişe buz gibi soğuk deiyonize suyla 0.5 ml geçiyoruz.
    4. Bir yuvarlak alt şişesi NHS ve EDC çözümlerinde karıştırın. Oda sıcaklığında 30 dakika oda sıcaklığında bankta karışık çözüm bırakın.
    5. 5,031 x g aşırı EDC ve NHS kaldırmak 10 min için EDC NHS karisimin santrifüj kapasitesi.
    6. 30 mL soğuk etanol karışım çözüm ve 10 dk santrifüj 5,031 x g de ekleyin.
      1. İki kez tekrarlayın.
  2. StarPEG-heparin nanocoating hazırlanması
    1. 1.0 mL % 10 (w/v) starPEG-(NH2)8 yuvarlak alt şişe ekleyin.
    2. 0.67 mL % 10 (w/v) heparin-NHS aynı yuvarlak alt şişe ekleyin.
    3. StarPEG-(NH2)8 ve heparin-NHS karışık çözüm bir kuluçka viskozite ile net bir çözüm elde etmek 20 dk için 25 ° C'de yerleştirin.
      Not: yıldız - PEG-(NH2)8 deiyonize su 5(6) - ile desteklenmiş dağıldı dışında fluorescently etiketli heparin (FAM-heparin) gerekli deneyler için üretim yordamı aynıdır carboxyfluorescein N- succinimidyl ester %0,1 (molar oranı) starPEG-(NH2)8. )
  3. Heparin-PEG nanocoating Fourier Transform Infrared spektroskopisi (FT-IR) tarafından karakterizasyonu
    1. Başlamadan önce akik harç, havaneli ve peletleme aygıtı (13 mm çapı ile küçük diskleri) aseton ve deiyonize su ile durulayın. Cam ürünleri kullanmadan önce fırında kuru.
    2. Mix yaklaşık 0.1-%1 heparin-PEG örnek ile ince KBr toz 200 – 250 mg.
    3. Akik havanda heparin-PEG ve KBr karışımı yerleştirin ve ince 2 µm çapı küçük granül haline ezmek.
    4. Karışımı bir Pelet cihaza aktarın. Yüksek sıkıştırma Kuvvetleri (8 T/cm2) 1-2 saydam peletleri oluşturmak üzere min için bir vakum uygulanır.
    5. Örnek Pelet Pelet aygıt uzak yavaşça çekin. Çatlaklar uğramak değil o kadar da zor değil çekmek dikkat et.
    6. Örnek granül bir Fourier Transform Infrared örnek kimyasal yapısı belirlemek için spektroskop için çok dikkatli bir şekilde aktarın.
  4. Heparin-PEG nanocoating tarafından taranan elektron mikroskobu (SEM) gözenekli iç yapılarının incelenmesi
    1. Aşağıdaki yordamlar için standart 48-şey hücre kültür plaka ve pipetler hazırlayın.
    2. Heparin-PEG kopolimer çözüm 48-şey kültür plaka kuyu pipette.
    3. Plakayı 24 h için-80 ° C'de dondurmak.
    4. Lypophilize-50 ° c vakum ortamında örnekleri (0,1 Pa) 24 h için.
    5. Örnekleri bir alüminyum saplama yapışkan yüzeyi boyunca yayıldı.
    6. Altın örnekleriyle ceket ve iç gözenekli yapıları gözlemlemek için taranan elektron mikroskobunda gözlemlemek.
  5. Heparin-PEG nanocoating yüzey atomik kuvvet mikroskobu (AFM) tarafından incelenmesi
    1. Temiz silis cam slaytlar piranha çözüm ile (%70 H2SO4, %30 H2O2) 40 dk 80 ° C'de.
    2. Slaytlar metanol 10 dakika ve sonra Toluen 10 min için solüsyon içeren temizleyicide.
    3. Slayt Vakum kurutma tarafından kuru.
    4. 3-aminopropyl-triethoxysilane çözüm (%2 Toluen), yavaşça sallayın bol slaytlar yıkayın.
    5. Metanol Toluen 10 dk sonra 10 min için slaytları solüsyon içeren temizleyicide.
    6. Yer 100 µL % 3 heparin-PEG çözüm bir çift pipet kullanarak slaytları yüzey üzerinde.
    7. Heparin-PEG bir atomik kuvvet mikroskobu altında yüzey inceleyin (bir rezonans frekansı 50-80 kHz, kuvvet sabit 0,350 N m 21, ipucu RADIUS 600 nm).

2. fare adacık yüzey Mühendisliği Heparin-PEG Nanocoating ile

  1. Fare adacık yüzey kaplama heparin-PEG nanocoating ile
    1. Daha önce bildirilen Jüpiter19' collagenase sindirim ve histopaque degrade arıtma tarafından fare adacıkları ayıklayın.
    2. 1.5 mL tüp diseksiyon mikroskop altında 200 adacıkları futbolla.
    3. PBS 500 µL adacıkları ve 1 dk. için 503 x g , santrifüj ekleyin.
    4. Süpernatant alın ve heparin-PEG çözüm 250 µL ekleyin ve karışımı 10 dk. pipet yukarı ve aşağı adacıkları heparin-PEG çözüm ile karıştırmak izin vermek için buz üzerinde tutun.
    5. 1 dk. için 503 x g , santrifüj.
    6. Süpernatant kaldırın ve PBS 500 µL ekleyin. Yukarı ve aşağı karıştırın için pipet.
    7. Vasıl 503 x g 1 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın ve daha fazla kullanmak için adacıkları tutun. Heparin-PEG ile kaplı fare adacıkları sınavına FAM-heparin-PEG aşağıdaki adımları adacık kaplama için kullanıldı.
  2. FAM-heparin-PEG nanocoating ile kaplı fare adacıkları incelenmesi
    1. 1-2 mL RPMI boyalı adacıklar için % 10 fetal Sığır serum ile takıma 1640 ekleyin ve bu adacıkları bir ücret steril bakteri kültürü tabak içine aktarın.
    2. FAM-heparin-PEG nanocoating boyalı adacıklar bir ters floresan mikroskop altında Morfoloji ve floresan sinyallerini gözlemlemek.

3. işlevi Heparin-PEG, Sigara kaplı adacıkları göre fare adacıkları kaplı

  1. Heparin-PEG kaplı fare adacıkları canlılık
    1. 20 heparin-PEG kaplı fare adacıklar BitTorrents ve 96-şey hücre kültür plaka bir kuyunun içine koyun.
    2. Her şey için 20 heparin-PEG kaplı fare adacıkları ile toplam 10 Wells doldurun.
    3. 20 noncoated denetim adacıklar BitTorrents ve aynı 96-şey hücre kültür plaka bir kuyunun içine koyun.
    4. Her şey için 20 noncoated denetim adacıkları ile toplam 10 Wells doldurun.
    5. RPMI % 10 fetal Sığır serum ile adacıkları içerir 96-şey plaka her kuyuya takıma 1640 200 µL koymak ve kültürü korumak için 14 gün.
    6. 2 günde adacık kültür ortamı değiştirin.
    7. Adacıkları ile yaşamak/kültür 14 gün sonunda kiti boyama ve bir ters floresan mikroskop altında gözlenen ölü bir tedavi.
    8. PI+ (kırmızı) hücreleri her adacık bir ters floresan mikroskop altında içinde saymak.
  2. Heparin-PEG revaskülarizasyon fare adacıklar içinde vitro kaplı
    1. Kültür plaka dahil olmak üzere tüm deneysel plastik ön serin ve pipet kullanmadan önce en az 12 h ipuçları.
    2. Soğutma bir yastık üzerinde 24-iyi yer. Buz 250 µL eklemek soğuk büyüme faktörü indirgenmiş Matrigel 24-şey hücre kültür plaka her kuyuya. Yer için en az 30 dk 4 ° C'de kaplamalı 24-şey plaka.
    3. Matris çözüm buzdolabında ayarlama iken fare pankreas adacık endotel Mile Sven 1 (MS1) hücreleri trypsinize.
      1. Tüm kültür medya doku kültürü balonun kaldırın. Şişesi 5 mL de PBS ile yıkayın.
      2. PBS kaldırın ve tripsin-EDTA 3 mL ekleyin. Standart bir kuluçka 3 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
      3. Hücreleri ayırmak ve 5 mL serum desteklenen medya ekleyin şişeye dibine hafifçe dokunun.
    4. 15 mL santrifüj tüpü ve 5 min için 1000 x g , santrifüj hücreleri toplamak.
    5. Süpernatant almak ve 5 mL PBS de ekleyin. Yukarı ve aşağı karıştırın için pipet.
    6. 1000 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant alır.
    7. Serum takıma DMEM ortamı tüpün içine ekleyin ve 50.000 hücreleri matris çözüm kaplı 24-şey plaka her kuyuya temel olarak belirler.
    8. 5 heparin-PEG boyalı adacıklar veya noncoated denetim adacıkları her kuyunun içine ekleyin.
    9. DMEM medya serum takıma iyi başına 500 µL toplam her kuyunun içine ekleyin.
    10. Hafif bir mikroskop altında 4 h ve 24 h kuluçka sonra tüp oluşumu gözlemlemek.
  3. Heparin-PEG boyalı adacıklar glikoz uyarılmış insülin salgılanması
    Not: heparin-PEG kaplı ve noncoated adacıkları glikoz uyarılmış insülin salgılanmasını nanocoating fare adacıkları fonksiyonu etkileyeceğini değerlendirmek için değerlendirildi.
    1. 30 heparin-PEG boyalı adacıklar veya noncoated denetim adacıkları bir 1,5 mL tüp içine futbolla. Toplam 10 tüpler için boyalı adacıklar ve noncoated adacıkları hazırlamak.
    2. 1 mL 2 mmol/L glikoz20 ile desteklenmiş fizyolojik tuz çözeltisi ekleyin ve 2 h 37 ° C'de kuluçkaya.
      Not: fizyolojik tuz solüsyonu tarifi için lütfen Tablo 1' e bakın. Tüpler kap Kuluçka kuluçka sırasında serbest bırak.
    3. Mümkün olduğu kadar çözüm kaldırın.
    4. Adacıkları 600 µL fizyolojik tuzlu çözüm için 30 dk 37 ° C'de 20 mmol/L glikoz ile takıma ekleyerek teşvik.
    5. 200 µL süpernatant, her tüpün ticari insülin ELISA kullanarak ELISA miktar kit insülin için toplamak.

Sonuçlar

Heparin-PEG nanocoating starPEG-(NH2)8 ve EDC ve NHS ajanlar (Şekil 1) kaplin olarak kullanarak heparin konjugasyon tarafından sentezlenen. Heparin-PEG nanocoating kimyasal yapısı FT-IR tarafından incelenmiş ve Şekil 2' de gösterildiği gibi 3300-3600 cm-1heparin (Şekil 2 hidroksil grupları karşılık gelen, heparin karakteristik doruklarına gözlenen Kırmızı). 3300-3600 cm-1 (Şekil 2 mavi) zirve genliğini azalma starPEG (NH2)8 Amid grupları ve heparin karbonil grubu arasındaki konjügasyon temsil eder. Tepe 1.650 cm-1 genliği karşılık gelen Amid için titreşim germe karbonil da düşürüldü, heparin ile succinimidyl süksinat karboksilat grupları ve Amin, starPEG-(NH2) arasında yeterli tepki gösteren 8. heparin-PEG nanocoating yüzey yapısını atomik kuvvet mikroskobu tarafından muayene ve Lou ve ark.gösterilir, nanocoating yaklaşık 30 nm yüksekliği ve genişliği arasında değişen küçük gözenekli özellikleri (siyah noktaları) ile 2 µm 100 ile 200 arasında çapı10nm. Taranan elektronik mikroskobu elde edilen veri de içinde vivo teslimat sırasında hücre hayatta kalmak için uygun olabileceğini düşündüren çok birbirine bağlı gözenekli yapısı heparin-PEG (Şekil 3), onaylamak.

Yüzey kaplama izole fare adacıklar incelenmiş ve Şekil 4' de gibi yeşil floresans tarafından gösterilen nanocoating, ince tabaka eşit olarak boyalı adacıklar yüzeyi boyunca adacık birim/boyutu üzerinde belirgin değişiklikler neden olmadan yatırılır. Kaplama sırasında bu adacıkları canlılığı korumak için buz üzerinde tutmak için tavsiye edilir. Benzer şekilde, kaplama dönemi 10 dk bu durumda, aynı zamanda bakım adacıkları canlılık sağlamak için optimize edildi. Bu veriler oluşturulur, ancak nanocoating daha iyi gözlem için elektron mikroskopi kesit boyalı adacıklar daha önce raporlanmış9,16 olarak inceleyen daha uygun olacağını dikkati çekiyor kültürde yaşayan adacıkları yerine sabit ve katıştırılmış adacıkları.

İle ilgili olarak hayatta kalma ve boyalı adacıklar, adacık revaskülarizasyon ve fonksiyonları değerlendirildi içinde vitroolmuştur. Heparin yararlı özellikleri göz önüne alındığında, heparin functionalization adacık yüzeyine adacık revaskülarizasyon kültür ve sonuç olarak onun hayatta kalma kolaylaştırabilir. Heparin-PEG kaplı fare adacıkları sağlam adacık canlılığı Kültür (Şekil 5) sergilenen gözlemledim. Önemli ölçüde daha gelişmiş damar oluşumu da heparin-PEG ile birlikte kültürlü adacık endotel hücreleri (MS1) belirgin uzamış microvessel benzeri yapıları ve ağ benzeri vasküler yapılar (Şekil 6 tarafından belirtilen adacıkları, kaplanmış ).

Nanocoating işlemi sonucunda oluşan heparin-PEG boyalı adacıklar hiçbir etkisi glikoz uyarılmış insülin salgı yeteneği. Ne zaman adacıkları glikoz (2 mmol/L; sub-stimulatory düzeyiyle desteklenen fizyolojik tuz solüsyonu ile derin insülin salgılanması düşük düzeyde tüm tedavi gruplarında gözlenmiştir Şekil 7). Glikoz (20 mmol/L glikoz) supra fizyolojik bir düzeyiyle adacıkları uyardığında, insülin salgılanması artış tüm tedavi gruplarında gözlendi.

figure-results-3809
Şekil 1: Kimyasal yapısı pankreas adacık yüzey Mühendisliği için Hep PEG nanocoating. Adacık kaplama hücre zarı ve yıldız - PEG-(NH2)8içinde birincil aminler ve heparin-NHS arasında kovalent çapraz sağlanır. Her heparin molekül bir NHS her grubunuz için değiştirildi birden çok karboksil grubuna sahiptir. NHS aktif karboksil grupları formu Amid bağlantılar, hangi yolu ile nanocoating Hep PEG ve adacıkları stabil için protein Birincil aminler ile tepki olacaktır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-4666
Resim 2 : Yıldız - PEG-(NH2)8, heparin ve Hep PEG nanocoating Kızılötesi spektrum kurutulmuş devlet. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-5175
Şekil 3: Hep-PEG kurutulmuş durumda elektronik mikroskobu görüntülerini taranan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-5621
Şekil 4: Heparin-PEG temsilcisi görüntülerini boyalı adacıklar floresan mikroskop altında.
Heparin (yeşil renkle gösterilmiştir) FAM ile önceden etiketli. 100 adacıkları temsilcisi görüntülerdir. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-6208
Şekil 5: Heparin-PEG boyalı adacıklar sergilenen güçlü adacık canlılığı. (A) anlamına gelir, n mean± standart hata sunulan veri grubu başına 50 adacıkları =. (B) canlı hücreler kırmızı yeşil ve ölü hücreleri içinde gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 100 µm. temsilcisi 50 adacıklar görüntülerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-6909
Şekil 6: Heparin-PEG nanocoating kolaylaştırır Intra-adacık revascularisation. Matrigel tüp heparin-PEG kaplı adacıkları ve noncoated kontrol adacıkları ile birlikte kültürlü MS1 hücre oluşumu. Görüntüleri 4 ile 24 h. ölçek çubuğu alınmıştır 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-7526
Şekil 7: Heparin-PEG nanocoating maruz kalırsa herhangi bir değişiklik adacık insülin salgısı fonksiyonları üzerine. Heparin-boyalı adacıklar PEG ve noncoated kontrol adacıkları (her 30) 2 mmol/L (beyaz çubuğu) maruz ya da 30 dk yanıt olarak 20 mmol/L glikoz insülin salgılanması için 20 mmol/L (siyah bar) glikoz kaplı arasında karşılaştırılabilir ve kontrol adacıkları. Veri anlamına gelir, n ortalama ± standart hata gösterilir = 10. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Bu makalede, biz yaşamak için "kolay-için-evlat edinin" bir yaklaşım göstermek hücre yüzeyine heparin dahil starPEG nanocoating yolu ile pseudo-bioorthogonal Kimya nanocoating N- hydroxysuccinimide grupları arasında mühendislik ve pankreas adacık yüzey membran Amin grupları. Gerçekten de, hücre içindeki amino grupları büyük ölçüde reaktif ve sonuç olarak, daha önceki çalışmaları birincil amino grupları ile harekete geçirmek N- hydroxysuccinimidyl (NHS) ester fizyolojik koşullarda14 arasındaki etkileşimler bildirdin ,16,21. Ayrıca, kapsamlı bir araştırma heparin, son derece sülfatlanmış glikozaminoglikan ve hücre dışı matriks önemli bileşeni birleşme sırasında adacık kapsülleme, gelişmiş sonrası nakli için yol açabileceğini bildirdi revaskülarizasyon ve azaltılmış IBMIR22,23. PEG biyouyumluluk ve heparin multivalent özellikleri göz önüne alındığında, biz 8 kollu PEG maksimal heparin nanocoating imalat sırasında yükleme için kullanılır. Heparin -NHS, hangi daha sonra -NH2 gruplarıyla adacık hücre zarı üzerinde tepki vereceğini ile güncellenmiştir. -NH2 (Toplam hücre zarı) ve - Hep PEG NHS arasında adacıkları kolayca "kaplı olması" kovalent bağ oluşumu tarafından heparin dahil PEG etkinleştirerek, böylece dış yüzeyinde pankreas oluşturan bir nano-ince tabaka (nanocoating) adacıkları.

Mevcut yaklaşım da o pseudo-bioorthogonal Kimya -NHS (Toplam nanocoating) ve -NH2 adacık hücre arasında adacık microencapsulation için büyük polimer olarak PEG seçilmiş daha önce yayımlanmış yöntemleri farklıdır membran kullanılmıştır. Adacık/hücre bu kararlılığını göz önüne alındığında plazma gibi karmaşık ortamlarda özellikle kaplama sonrası nakli revaskülarizasyon için önemlidir ve hayatta kalma, oluşumu -NH2 arasındaki -NHS kıyasla daha istikrarlı olur hidrofobik etkileşim PEG ve hücre zarının24, elektrostatik etkileşimler9,15,24,25,26 veya biotin arasında biyolojik bağlantı arasında streptavidin14.

Buna ek olarak, adacık aksine aynı zamanda genişletilmiş adacık işleme süresi çok katmanlı ifade14,16,25, mevcut teknik LBL yaklaşımla dayanan kaplama yaklaşım en az gerektirir işleme ve çok kısa kaplama döneminde izole adacıkları. Adacıkları canlılığı kez zaten uzlaşma aşağıdaki adacık yalıtım nedeniyle zarar görmüş ECM enzimatik sindirim sırasında bu yana bu faktörlerin her ikisi de sonrası nakli adacık hayatta kalmak için gereklidir. Ancak, bir mevcut yaklaşım LBL, hangi yolu ile dış kaplama kalınlığı artan veya katman biriktirme, sayısını azaltarak denetlenebilecek aksine Hep PEG nanocoating kalınlığı şu an için uygun değil, kısıtlamasıdır.

Ayrıca, kimyasal reaksiyon -NHS ve -NH2 yer alır, mevcut yaklaşım arasında yaşayan hücre için uygun nerede hafif koşulu nedeniyle mühendislik değil yüzey pankreas adacıkları ama çoğu hücre tedavisi için sınırlı. Ayrıca, heparin dizi sitokinler ve biyolojik olarak aktif molekülleri ile etkileşim bilinmektedir göz önüne alındığında, Hep PEG nanocoating de sınırsız biyolojik arabulucu birleşme için potansiyele sahip açık bir platform sunar gibi daha karmaşık hücre yüzey Mühendisliği için arabirimler.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Ulusal Doğa Bilimleri fonları of China (31770968) ve Tianjin araştırma programı uygulama Vakfı ve ileri teknoloji (17JCZDJC33400) finansal destek için sana şükrediyoruz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
PBSHycloneAAJ207798
StreptozototinSigmaS0130
HistopaqueSigma10831
RPMI 1640GIBCO, by Life Technologies31800022
Fetal Bovine SerumGIBCO, by Life Technologies16000-044
Penicillin StreptomycinGIBCO, by Life Technologies15140
Cell Dissociation SolutionGIBCO, by Life Technologies13150-016
DMEMGIBCO, by Life Technologies12800017
D-(+)-Glucose solutionSigmaG8644
488 phalloidinSigmaA12379
CFSESigma21888-25mg-F
Annexin V/PI apoptosis kitDojindoAD10
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech0100-20
Collagenase from Clostridium, Type XISigmaC7657
HeparinSigma-AldrichH3149
NHSSigma-Aldrich56480
EDCSigma-Aldrich3449
8-armed PEGJ&K Scientific Ltd1685176
FAMSigma-AldrichM041100
5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl esterSigma-Aldrich21888
KBrJ&K Scientific Ltd32036
3-aminopropyl-triethoxysilane Sigma-AldrichA3648
tolueneJ&K Scientific LtdS-15497-20X
Live/dead staining kitBiovision, USK501
BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reducedBD Bioscience354230
Sodium chloride, 99.5%J&K Scientific Ltd105864
Potassium chloride, 99%, extra pureJ&K Scientific Ltd991468
Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagentJ&K Scientific Ltd988639
Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagentJ&K Scientific Ltd182158
Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pureJ&K Scientific Ltd128839
Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysisJ&K Scientific Ltd119370
Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2J&K Scientific Ltd21114
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichV900933
Rat/Mouse Insulin ELISA kitMillipore-lincoEZRMI-13K

Referanslar

  1. Ke, T., et al. Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice. Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).
  2. Ke, T., et al. Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration. Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).
  3. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287 (5460), 2007-2010 (2000).
  4. Sarkar, D., et al. Engineered cell homing. Blood. 118 (25), 184-191 (2011).
  5. Kato, M., Mrksich, M. Rewiring cell adhesion. J Am Chem Soc. 126 (21), 6504-6505 (2004).
  6. Cheng, H., et al. Stem cell membrane engineering for cell rolling using peptide conjugation and tuning of cell-selectin interaction kinetics. Biomaterials. 33 (20), 5004-5012 (2012).
  7. Merzaban, J. S., et al. Cell surface glycan engineering of neural stem cells augments neurotropism and improves recovery in a murine model of multiple sclerosis. Glycobiology. 25 (12), 1392-1409 (2015).
  8. Silvescu, C. I., Sackstein, R. G-CSF induces membrane expression of a myeloperoxidase glycvariant that operates as an E-selectin ligand on human myeloid cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10696-10701 (2014).
  9. Zhi, Z. L., et al. Assembly of bioactive multilayered nanocoatings on pancreatic islet cells: incorporation of alpha1-antitrypsin into the coatings. Chem Commun (Camb). 51 (53), 10652-10655 (2015).
  10. Lou, S., et al. Pancreatic islet surface bioengineering with a heparin-incorporated starPEG nanofilm. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 78, 24-31 (2017).
  11. Orlando, G., et al. Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes. Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).
  12. Kollmer, M., et al. Long-term function of alginate-encapsulated islets. Tissue Eng Part B Rev. 22 (1), 34-36 (2015).
  13. Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. J Diabetes Complications. 29 (5), 737-743 (2015).
  14. Kizilel, S., et al. Encapsulation of pancreatic islets with nano-thin functional polyethylene glycol coatings for enhanced insulin secretion. Tissue Eng. Part A. 16, 2217-2228 (2010).
  15. Zhi, Z. L., et al. Nano-scale encapsulation enhances allograft survival and function of islets transplanted in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 55, 1081-1090 (2012).
  16. Gattas-Asfura, K. M., Stabler, C. L. Layer-by-layer deposition of antifouling coatings on stainless steel via catechol-amine reaction. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5, 9964-9974 (2013).
  17. Kollmer, M., et al. Long-term function of alginate-encapsulated islets. Tissue Eng. Part B Rev. 22 (1), 34-46 (2015).
  18. Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. J. Diabetes Complicat. 29, 737-747 (2015).
  19. Zmuda, E. J., et al. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
  20. Gey, G. O., Gey, M. K. The maintenance of human normal cells and tumor cells in continuous culture. I. Preliminary report: Cultivation of mesoblastic tumors and normal tissue and notes on methods of cultivation. Am. J. Cancer. 27, 45-76 (1936).
  21. Chen, X., et al. Site-selective azide incorporation into endogenous RNase A via a "chemistry" approach. Org. Biomol. Chem. 11, 353-361 (2013).
  22. Cabric, S., et al. Anchoring of vascular endothelial growth factor to surface-immobilized heparin on pancreatic islets: implications for stimulating islet angiogenesis. Tissue Eng. Part A. 16, 961-970 (2010).
  23. Cabric, S., et al. Islet surface heparinization prevents the instant blood-mediated inflammatory reaction in islet transplantation. Diabetes. 56, 2008-2015 (2007).
  24. Asif, S., et al. Heparinization of cell surfaces with short peptide-conjugated PEG-lipid regulates thromboinflammation in transplantation of human MSCs and hepatocytes. Acta Biomater. 35, 194-205 (2016).
  25. Teramura, Y., et al. Microencapsulation of cells, including islets, within stable ultra-thin membrane of maleimide-conjugated PEG-lipid with multifunctional crosslinkers. Biomaterials. 34 (11), 2683-2893 (2013).
  26. Zhi, Z., et al. Multilayer nanoencapsulation: A nanomedicine technology for diabetes research and management. Diabetes Res. Clin. Pract. 100, 162-169 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendisliksay 136of Langerhans adac klarNanocoatingy zey M hendisli iBioorthogonal Kimya

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır