Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

Özet

Mikroenjeksiyon Nasonia vitripennis embriyo kalıtsal genom değişiklikler oluşturmak için temel bir yöntemdir. Burada açıklanan mikroenjeksiyon ve büyük ölçüde bu organizma gelecekteki genom manipülasyon kolaylaştıracaktır Nasonia vitripennis embriyo nakli için detaylı bir işlemdir.

Özet

Mücevher wasp Nasonia vitripennis seks belirlenmesi, haplo-diploid seks belirlenmesi, zehir sentezi ve ana bilgisayar-konukçunun etkileşimleri, diğerleri arasında gibi işlemlerin incelenmesi için bir etkili model sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Bu organizma ile çalışmanın önemli bir sınırlama yönlendirilmiş genom değişiklikler gerçekleştirmek için etkili iletişim kurallarının olmaması. Reaktifler, CRISPR/Cas9 molekülleri, embriyo mikroenjeksiyon aracılığıyla da dahil düzenleme teslimat genom değişiklik önemli bir parçası olur. Mikroenjeksiyon birçok canlılar arasında iyi kurulmuş olsa da, bu teknik i. vitripennis içinde öncelikle küçük embriyo boyutuna ve embriyonik gelişme tamamen içinde oluşur gerçeği nedeniyle gerçekleştirmek için özellikle zor bir parasitized sineği pupa. Aşağıdaki yordamı bu önemli sorunlar süre etkili wasp embriyo kaldırmak için akıcı, görsel bir yordam gösteren parasitized ana bilgisayar pupa, onları, microinjecting ve dikkatle onları Dikim geri ev sahibi üstesinden gelir Devamı ve geliştirme tamamlanması için. Bu iletişim kuralı güçlü gelişmiş genom değişiklikler bu organizma olarak gerçekleştirmek için araştırma grupları yeteneğini artıracaktır.

Giriş

Mücevher eşek arısı, N. vitripennis, cins Nasonia içinde ectoparasitoids Sarcophaga bullata¹gibi sinekler yeme et olan dört türlerinden biridir. Hızlı kuşak dönemleri, laboratuvar ve biyolojik özellikleri, benzersiz ve önemli bir dizi yetiştirme kolaylığı nedeniyle i. vitripennis geleneksel canlılar arasında bulunan birden çok deneysel araçları geliştirilmesi için bir odak noktası olmuştur . Örneğin, bazı benzersiz biyolojik öznitelikler haplo-diploid üreme sistemi², mikrobiyal ve genetik parazitler^3,4ile bir ilişki ve bir supernumary (B) kromozom^{5,6 içerir ,7}. Birlikte ele alındığında, bu zehir üretim^8, dahil olmak üzere ek olarak bu işlemlerin moleküler ve hücresel yönlerini elucidating amaçlayan deneyler için önemli bir deneysel sistem i. vitripennis olun ⁹, cinsiyet belirlenmesi^10,11ve evrim ve gelişme ekseni Desen oluşumu^12,13,14. Ayrıca, NBiyoloji çalışmaya genetik araç seti. vitripennis son on yıl içinde önemli ölçüde artmıştır ya da çok, bir yüksek çözünürlüklü genom¹⁵sıralama ile çeşitli gen ekspresyonu^16,17,18, çalışmalar ve yetenek işlevsel RNA müdahale (RNAi)^19,20, hangi birlikte tractability ve ters genetik bu organizmada performans yetenekleri gelişmiş güvenerek gen ekspresyonu bozmaya.

Birçok önemli bilimsel gelişmeler ve bu canlı genişletilmiş araci rağmen mevcut bilgi aynı derecede-in tek bir grup başarıyla embriyonik microinjections kalıtsal genom değişiklikler²¹oluşturmak için sahne aldı. Onlar oldukça kırılgan ve küçük, Drosophila melanogaster embriyolar, onları işlemek genellikle zor hale boyutunu ~2/3 varlık olarak i. vitripennis embriyo ile çalışmanın zorlukları nedeniyle öncelikle bu. Ayrıca, i. vitripennis dişiler yumurtalarını embriyogenez, larva, Pupa geliştirme tamamı içinde oluştuğu önceden stung sineği pupa Kasası. Bu nedenle, başarılı microinjections, ön blastoderm sahne, embriyo ana bilgisayar pupa, hızlı bir şekilde microinjected ve hemen geri onların ana bilgisayarlar için geliştirme içine nakledilen üzerinden verimli bir şekilde toplanması gerekir. Aşağıdaki adımları hassas ve microinjected embriyo veya son derece zorlu tekniği yapım pupa ana zarar görmesini önlemek için el becerisi gerektirir. Rağmen i. vitripennis embriyo mikroenjeksiyon²²açıklayan bir on yıl kadar önce yayınlanan bir kısa protokol vardır. Ancak, bu yordam için taze koydu embriyo kurumuş gerekir, yumurtaların mikroenjeksiyon için çapa için yapışkan bant kullanır ve bir görsel gösteri tekniği içermez. Bu nedenle, burada açıklanan geliştirilmiş adım adım iletişim kuralı kalıtsal genom oluşturmak için temel herhangi bir laboratuar tarafından takip edilebilir i. vitripennis embriyo microinjections için ayrıntılı bir görsel yordam da dahil olmak üzere bir güncelleştirilmiş ve gözden geçirilmiş protokoldür Bu önemli model böcek olarak değişiklikleri.

Protokol

1. N. Vitripennis koloni yetiştirme

1. Sömürgeler ayarla (~ 3-5) 200-500 i. vitripennis yetişkin (ile kadın: erkek 3:1 oranında) hata yurt kafeslerde yerleştirerek.
   Not: hata Yurtlar, arı kullanmanın alternatifi de birden çok, küçük cam test tüpleri ile yaklaşık 15-20 eşekarısı/flakon ile pamuk tıkalı içinde yayılamaz.
   1. Eşekarısı, 25 ± 1 ° C ile %30 bağıl nem ve 1212: ışık karanlık döngüsü günlük 1:10 (v/v) küçük damlacıklar ile besleme onları korumak Sükroz/su solüsyonu.
      Not: Yayma yaban arısı kolonileri ve koleksiyonu da, oda sıcaklığında kontrollü nem olmadan yapılabilir; Ancak, düşük sıcaklığı 25 ° C hafif embriyoların gelişim zamanlaması düşürür daha.
2. En az 4 gün önce enjeksiyonları çiftleşmeye eşekarısı izin.
   1. İlk iki gün için taze beslemek şeklindeki kadın izin S. bullata pupa yanı sıra küçük damlacıklar bir 1:10 (v/v) Sükroz/su solüsyonu.
   2. Aşağıdaki iki gün için yapım onları çok gravid bir oviposition sitesinin dişi arıların mahrum etmek sineği pupa kaldırın.

2. toplama ve N. Vitripennis öncesi blastoderm sahne embriyo hizalamasını

1. Dişi arıların parasitize izin (embriyo Hayır) genç ana bilgisayarlar (S. bullata pupa) içine. Ana bilgisayarlar taze tutmak için ana bilgisayarlar hemen onları elde ettikten sonra 4 ° C'de depolayın ve yalnızca gerektiğinde kaldırmak.
   Not: Genç ana bilgisayarlar büyük ana bilgisayarlar daha koyu renkli puparium (şekil 1A) var ise kırmızı renkli puparium sahip olarak belirlenebilir.
   1. Bireysel taze S. bullata yer pupa pupa büyüklüğünde bir delik olan bir köpük tıpa içine kesilmiş merkezine. Sadece açığa ~ 0.2 cm parasitization ve daha kolay embriyo koleksiyonu maksimum konsantrasyon konağını ön sonu (tercih edilen oviposition sitesi).
      Not: arka uç kalındır ve 'krater benzeri' açılış (şekil 1B) içeren ön uç yuvarlanır.
   2. Ana bilgisayar pupa (kabaca 5 ana bilgisayar pupa 100 arı başına) bu düzenleme kafesin içine yerleştirin ve eşekarısı onları (Şekil 2- II) parasitize izin vermek için yaklaşık 45 dakika bekleyin.
      Not: Bu embriyoların ideal öncesi blastoderm aşamasında olduklarından emin olmak için oviposited ilk saat içinde mümkün olduğunca genç çok önemlidir. Eski embriyo (> 1,5 saat) değil enjekte.
   3. Parasitized ana bilgisayarlar alarak onları el ile ve yavaşça fırça / herhangi bir ikamet eşekarısı havaya kaldırın. Sonra taze ev sahibi bunların yerine her ~ enjeksiyonlar sırasında yumurta sahnelenen erken toplama devam etmek için 15 dak.
2. Taze parasitized ana bilgisayarları kafesinden el ile kaldırma. Forseps, kullanarak bir diseksiyon mikroskop altında dikkatle peel away i. vitripennis yumurta (Şekil 2- III) ortaya çıkarmak için dış puparium (pupa kabuk) posterior sonu (0.4 cm).
   Not: Pupa cilt delme önlemek için bakım alınmalıdır; Bu durumda, hemolymph mikroenjeksiyon için kaldırmak çok zor olacak wasp embriyo nemlendirin.
3. Bir coverslip bir embriyo hizalama slayt (şekil 3) hazırlamak için temiz cam slayt üzerine yapıştırmak için sıvı yapışkan destek kullanın.
   Not: Yüksek performanslı anlık yapıştırıcı bond gücünü artırmak üzere kullanılan ve hızlı kurutma, ancak coverslip slaytta hareket tutabilir herhangi bir yapıştırıcı kabul edilebilir.
4. Basamaktan embriyo dikkatle ıslak bir ince uçlu fırça ile bilgisayardan ana yumuşak pupa deri zarar vermeyeceğine emin olmak istedim.
   Not:: "embriyo çekme,' aslında bir buçuk süper ince forseps, bir çift olan bir fırça yerine kullanılabilir.
5. Aktarım ~ 20 embriyolar tek tek bir slayda, hemen ıslak bir boya fırçası ile coverslip tarafına bitişik. Ön kapak slaytın kenar karşı embriyo sonuna embriyoların arka uç aynı yönde (Şekil 2- IV) işaret gelecek şekilde yönlendirin. Bu tüm embriyolar arasında aynı konum içine enjekte ederek daha yüksek hassasiyet için izin verir.
   Not: Bu gelişmiş teknik embriyo^21,22daha önce açıklandığı gibi slayda düzeltmek için çift taraflı yapışkan bant gerektirmez. Ayrıca, işe embriyo yazılıolduğu veya kapak yumurta halocarbon yağı ile i. vitripennis embriyo mikroenjeksiyon²²için daha önce açıklandığı gibi enjeksiyon sırasında.

3. iğne hazırlık Microinjections için

1. Bir aluminosilicate kılcal cam bir iğne çektirmenin yerleştirin.
   Not: İyi bir iğne başarılı i. vitripennis için önemlidir embriyo enjeksiyonları. Enjeksiyon iğneler keskin ve koryon aracılığıyla kolay nüfuz izin vermek için ince uçlu olmalıdır. Kuvars ve borosilikat kapiller iğneler de olabilir (şekil 4) kullanılır.
2. 70 ve basınç 500 605 ısı , hız 130 için 80 gecikme , çekin bir iğne çektirmenin ayarlayın.
   Not: ek iğne çektirme ayarları kuvars ve borosilikat iğneler çekerek için Tablo 1' de görülebilir; Parametreler farklı Elcikler ve filamentler için farklı olabilir.
3. İğne çektirme doğru iğne oluşturmak için aktif hale getirin. Birden fazla iğne üretimi için gerektiği kadar yineleyin.
   Not: Bir Petri kabına ticari modeler'ın topraktan birkaç paralel rulo içeren içine yerleştirerek çekti iğneler depolanabilir.
4. İğne ucu ucuna elmas aşındırıcı plaka 10 civarında kadar hafifçe dokunarak eğim s 25 ° c (Şekil 2- III).
   Not: Aynı anda iğne ile vekiller akışının geliştirilmesi sırasında en az hasarla embriyo içine giriş teşvik ederek eğim enjeksiyon iğneler yarar.

4. embriyo mikroenjeksiyon

1. Genom değişiklik reaktifler (Örneğin, transposon + yardımcı transposase, veya CRIPSR reaktifler, vb) oluşan enjeksiyon karışım hazırlamak ve buz üzerinde tutun.
2. Enjeksiyon karışımı 2 µL enjeksiyon iğnesiyle microloader ipuçlarını kullanarak yükleyin.
   Not: tek-Kılavuzu RNA (sgRNA) (s) ve H₂' O. karışık rekombinant Cas9 protein iletişim kuralında gösterdi enjeksiyon karışım oluşur
3. Sahne Alanı'na bir bileşik mikroskop çizgili embriyo ile cam slayt yerleştirin.
4. Dikkatle arka sonunda embriyo ile dikey açı 25-35 ° lik iğne takın.

1-5 pL enjeksiyon karışım (yaklaşık embriyo'nın hacminin 2-%10) enjekte ve embriyo karışımı bu (Şekil 2- IV) enjekte edilir gibi biraz şişmeye göründüğünden emin olun.
Not: çok fazla enjeksiyon karışım embriyo enjekte edilir eğer embriyo sitoplazma dağıttılar patlamış. Ayrıca, uygun olmayan şekilde eğimli ya da kırık iğne ile çok büyük bir açılış da embriyo yırtılması neden olabilir.

1. Tıkanma oluşursa yeniden beveling iğneler deneyin. İ. vitripennis embriyo sitoplazma alışılmadık viskoz ve yapışkan, hangi sık iğne (1/25 enjeksiyonları) tıkanma olur mu.
   Not: De-iyonize su fırça kullanarak düzenli olarak ekleyerek embriyo enjeksiyon döneminde nemli tutmak önemlidir. Fırça su miktarına embriyo hareket etme ve kolaylığı ile hizalamak için anahtardır. Çok fazla su kayan ve çok az su onları hareket etmek zor embriyo sonuçlanır.
2. Enjekte ~ 20-40 yumurta (yaklaşık 10 dk almalı) bir anda o zaman bırak. Islak bir boya fırçası ile enjekte yumurta enjekte yumurta hafifçe dokunarak aktarmak ve bir ev sahibi koyun. Sonra yeni bir taze kullanarak yeniden enjekte toplu yumurta koydu devam edin (> 1 h eski).
   Not: başka bir kişi genom değişiklik bileşenleri enjekte ve ana bilgisayar pupa için enjekte embriyo nakli iken ideal bir konuma sahip bu iletişim kuralı bir kişi sürekli toplama ve yumurta astar, en etkilidir.

5. Injected G₀ Pre-stung ana bilgisayar üzerine i. vitripennis embriyo nakli

1. Dikkatle enjekte G₀ embriyolar daha önce stung S. bullata üzerine yer pupa (Şekil 2- VI) mikroenjeksiyon sonra ıslak bir fırça ile.
   Not: Bu amaçla mikroenjeksiyon için embriyo toplamak için kullanılan ana bilgisayar pupa çalışacaktır. Ayrıca, önemli çaba rağmen yoktur şu anda kullanılan²²-ebilmek var olmak elde edilebilir hiçbir yapay diyet.
   1. 40 enjekte embriyo bir vakit doluluk ve larva rekabet önlemek için tek bir önceden stung ana üzerine yerleştirin.
      Not: Enjeksiyon embriyoya zarar; ana bilgisayar pupa için enjekte embriyo dikkatsiz nakli eklenen bileşen veya sarısı dışarı sıkmak ve embriyoların ölüme yol.
2. Ana bilgisayar pupa nemli filtre kağıdı ve pamuk topları ile bir Petri çanak içine yerleştirin ve (yaklaşık 1-2 gün) enjekte embriyo yumurtadan kadar onları yaklaşık %70 nem ile 25 ° C'de kuluçkaya (Şekil 2- VII).
   Not: Önemlisi, ana bilgisayarlar bırakılabilir bir soyulmuş ile onlar kuruma önlemek oksijen Odası (Petri kabına nemli filtre kağıdı ve pamuk topları ile) içinde inkübe sürece puparium ve N. vitripennis kapalı yumurta normalde gelişecektir. Nem kontrol edilemez diye oda sıcaklığında ve nem üzerinden nemlendirilmiş pamuk topları ile kuluçka yeterli olur.
3. Ana bilgisayar pupa içine yeni bir petri %70 nem ve 25^°C G₀ embriyo kapağı sonra transfer.
   1. Ana bilgisayar pupa ve enjekte G₀ larva her gün izlemek. Ana bilgisayar pupa iğrenç bir koku varsa, eklenen larva yeni sağlıklı ana bilgisayar pupa aktarın.

6. tarama genom değişiklikler için

1. Her i. vitripennis pupa iyi boya fırçası veya embriyo çekme kullanarak ana bilgisayardan kaldırın. Enjekte G₀ larvaları yaklaşık 8 gün sonrası enjeksiyon YavruIar.
2. Kaldırılan her pupa bir yalıtılmış cam şişe içine pamuk ile takılı ve taranmış kadın bakire olacak sağlanması G₀ yetişkin hangi ortaya izin yer aşağı akım genetik haç ile yardımcı olacaktır.
   Not: Kadın erkek kanat uzunluğa göre sıralayabilirsiniz: kadın olması geçmiş zaman üstünde belgili tanımlık yan döndü vücut profil genişletmek daha uzun kanatları. Tüm microinjected kadın pupa birlikte takılı bir şişe yerleştirilebilir ve aynı erkek pupa için geçerlidir.
3. Eclosion, her iki PCR veya görsel olarak sonra ekran G₀ bireyler (engellemeden fenotipik bir gen varsa). Örneğin, CRISPR silme işlemleri belirli bir gen oluşturmak için kullanılan ve kesintiye gen görünür bir fenotip veriyor, sonra sıralayın ve bireylerin etkilenen fenotip (Şekil 2- VIII) mutant bir sürümü ile devam²¹. Ancak, temel bir gen, bir mutant gibi görünür olmayan bir fenotip için etkilenen gen kodlar, yeniden elde etmek ve için ekran için bir geçiş düzeni (çapraz G₀ olan vahşi türü dişi erkek veya çapraz G₀ vahşi türü erkek ile kadın) gerçekleştirin ölümcül ya da kısırlık raporlaması ile kalıtsal mutantlar.
   Not: D. melanogaster, i. vitripennis yetişkin benzer CO₂ basit manipülasyon için sağlayan maruz immobilize. Ayrıca, eşleşmemiş kadın % 100 haploit erkek broods için bu nedenle bir mutant eşleşmemiş erkek daha sonraki analiz için kullanılan mutant erkek sayıda çıkmasına neden olabilir çıkmasına neden.
   Not: Temel genlerdeki mutasyonlar hayatta kalan G enjekte₀ kadın (muhtemelen bir mutasyon için heterozigoz) vahşi türü erkek çiftleşme tarafından tutulması gerekir; G₁ kadın döl yarısı nakliyeci-in ölümcül olacak iken bu özel durumda, G₁ erkek döl yarısı öldürücü mutasyon devralınması nedeniyle ölmemeli.
4. G₀ yetişkin ve ekran G₁ döl Eğer amaç transgenesis transgenesis işaretçileri kullanarak transgene eklemeleri için outcross. Şu anda transgenesis i. vitripennisiçinde göstermiş kalır.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralı koloni yetiştirme, ön blastoderm embriyo koleksiyonu, hizalama, mikroenjeksiyon ve enjeksiyon sonra sonraki nakli için ayrıntılı yönergeler sağlar ve i. vitripennisverimli genom mühendisliği için kullanılabilir. Şekil 2' de gösterildiği gibi genel i. vitripennis içine başarılı mikroenjeksiyon için adımlar dizisini içerir: (i) çiftleşmek için erkek ve kadın yetişkinden erişimine izin verme (~ 4 gün), (ii) temin taze ana bilgisayar sinek pupa (S. bullata) yerleştirilen bir değiştirilmiş köpük tak şeklindeki kadın ve oviposition için izin (~ 45 dk), (III) dikkatle uzakta ortaya çıkarmak ve ön blastoderm sahne wasp embriyo toplamak için parasitized ana bilgisayar pupa manikür peeling (~ 15 dk), (IV) hizalama toplanan embriyo (~ 15 dk), (v) embriyo microinjecting genom değişiklik bileşenlerine (~ 15 dk), (vi) dikkatli bir şekilde sipariş enjekte embriyo geri içine doğru gelişimi için izin vermek için önceden stung ana bilgisayarlar (~ 15 dk), ve (vii) önlenmesi enjekte embriyo/konak susuzluktan aktararak Onları yaklaşık %70 bağıl nem ile oksijen odasına (~ 15 dk). Parasitized dan sonra tam i. vitripennis embriyo gelişimi için izin vermek kabaca 14 gün boyunca inkübe. Enjekte sonra yetişkin (VIII) ana bilgisayardan ortaya, ayırma, dostum ve onları tek tek beklenen mutasyonlar varlığı için ekran.

Etkili iğne penetrasyon ve mikroenjeksiyon i. vitripennis embriyo içine, kuvars, aluminosilicate ve borosilikat türleri de dahil olmak üzere filaman kapiller cam iğne çeşitli test edilmektedir. Bu iğne kalitesi kritik kırılma/tıkanma enjeksiyon sırasında önlemek için ve her iki embriyo hayatta kalma ve dönüşüm verimliliği yüksek oranda elde etmek için bulunur. Her cam türü için istenen şırınga benzeri uzun ipucu kullanarak farklı micropipette Elcikler (P-1000 ve P-2000) i. vitripennis embriyo mikroenjeksiyon için etkili olması için iğne çekmek için etkili bir iletişim kuralı geliştirilmiştir (Tablo 1 Şekil 4).

Yordamı en iyi duruma getirmek için sağkalım oranları değişen miktarlarda genom değişiklik bileşenleri enjeksiyon takip ölçülür. Burada kullanılan genom değişiklik bileşenler karışık Kılavuzu RNA'ların ve Cas9 protein CRISPR-aracılı genom düzenleme, daha önce de i. vitripennis²¹' çalışmak gösterilmiştir vardı. Daha önce neydi benzer bildirdi, burada bir sgRNA zinober gen tasarlanmış ve sentezlenmiş hedefleme. Hedefleme ve bu gen engellemeden, kolayca tanımlanabilen bir fenotipik değişiklik organizma^19,21göz rengi görülür. SgRNA konsantrasyonları çeşitli birleştiren bir enjeksiyon karışım (0, 20, 40, 80, 160 ve 320 ng/µL) Cas9 protein (0, 20, 40, 80, 160 ve 320 ng/µL) oluşturulur ve vahşi türü i. vitripennisembriyo enjekte. Sağkalım oranı enjekte embriyo doz bağımlı (Tablo 2)²¹olduğu bulunmuştur. SgRNA ve Cas9 protein düşük sağkalım oranları (Tablo 2), belki de katkı hedef kapalı etkileri nedeniyle Müşteri adayına artan konsantrasyon. Yüksek nem (~ % 70) zamanda embriyo düşük nem olarak ekimi ana, sonra hayatta kalmak için önemli olduğu tespit (~ % 10) % 100 ölüm tüm enjekte embriyolar için sonuçlandı.

Resim 1 . Ana bilgisayar pupa hazırlanması (S. bullata) için i. vitripennis embriyo oviposition. (A) Genç ve yaşlı S. bullata pupa. Genç pupa onların manikür için daha kırmızımsı bir renk tonu var ise büyük pupa daha koyu bir manikür var. Genç pupa oviposition maksimize etmek için tercih edilir. "Ön sonunda yuvarlak bir noktasına gelir, ancak bir krater benzeri arka ucunda, açarak. pupa arka ve ön ucu da ayrılır (B) i. vitripennis embriyo oviposition. için ana bilgisayar (S. bullata) pupa hazırlık Ana bilgisayar pupa bir pupa olmuştur bir köpük fiş ekleme oyulmasıyla delik ölçekli. Oviposition ön alana, maksimum konsantrasyon için izin vermek için ön ucunun 0.2 cm maruz iken ana bilgisayar pupa yüz fiş içinde arka tarafında var. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 . Zaman çizelgesi oluşturmak için i. vitripennis mikroenjeksiyon gitmesini... mutantlardan. İ. vitripennis embriyo koleksiyonu, CRISPR/Cas9 mikroenjeksiyon ve sonrası enjeksiyon yordamlar zaman çizelgesi. İ. vitripennis yetişkin 4 gün için (Ben) bir oviposition sitesi yokluğunda çiftleşmek için izin verildi. Aşağıdaki, bir taze, eti sinek ana bilgisayar pupa, S. bullata, sadece arka sonu, 0,5 cm açığa olarak köpük tıpa yerleştirilen tanıtıldı (II) parasitization için izin vermek için gravid kadın için 45 dk için. Aynı anda mikroenjeksiyon iğneler ve CRISPR/Cas9 bileşenleri de dahil olmak üzere enjeksiyon materyalleri (III) hazırlanmıştır. Embriyo, (v) uyumlu, (IV) ana bilgisayardan toplanmış ve CRISPR/Cas9 bileşenleri (VI) ile enjekte. Enjekte embriyo dikkatle önceden sokulan bir ana (VII) geri transfer ve tam olarak gelişmiş (14 gün kadar) (VIII) inkübe edildi. Ne zaman yetişkin ortaya çıktı, mutantlar için hedef gen (IX) beklenen CRISPR/Cas9 indüklenen mutasyonların fenotipleri gösterildi. Bütün prosedür genellikle 19 gün tamamlamak için alır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 . Embriyo astar için değiştirilmiş mikroskop slayt. (A) A coverslip. (B) A mikroskop slayt. (C) bir embriyo hizalama cihazı.Bir coverslip satır embriyolar için enjeksiyon için kullanılmak üzere bir mikroskop slayt üzerine yapıştırılmış olabilir. Coverslip amacı kolayca idare ve astar embriyolar için izin vermek için bir avantaj olarak hareket etmektir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 . Enjeksiyon iğne hazırlık. İyi ve kötü aluminosilicate cam iğne(a)örnekler. (B) bir yuvarlatılmamış, doğru eğimli ve kötü eğimli iğne ipuçları. Aluminosilicate cam kılcal tüpler bir micropipette çektirmenin kullanarak çekildik. Üretilen iğne ipuçları vardı sonra yavaşça açıldı ve bir beveler kullanarak rafine. Çok keskin bir ucu iyi Pahlı iğne vardır ve kötü Pahlı iğne künt bir ucu vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Kapiller cam türü	Sutter iğne çektirme modeli	Isı	Filaman	Hız	Gecikme	Çekme	Basınç
Kuvars	P-2000	750	4	40	150	165	-
Aluminosilicate	P-1000	605	-	130	80	70	500
Borosilikat	P-1000	450	-	130	80	70	500

Tablo 1. İğne çektirme ayarları.
Not: İğne çektirme ayarı farklı makine makine her laboratuar kendi iğne çektirme ayarlarını optimize etmek gerekir. Bu tablo Li ve ark. değiştirildi ²¹

sgRNA-1	Cas9	Toplam embriyolar	Transplantasyonu (%10 nem)	Transplantasyonu (%70 nem)
			Larva ölüm	Larva ölüm	Yetişkin hayatta kalanlar
			Toplam (%)	Toplam (%)	♂	♀	Toplam (%)
Hiçbir enjeksiyon	Hiçbir enjeksiyon	100	94 (94)	96 (96)	66	26	92 (92)
Su	Su	100	0 (0)	78 (78)	44	32	76 (76)
20 ng/µL	20 ng/µL	100	0 (0)	74 (74)	34	34	68 (68)
40 ng/µL	40 ng/µL	100	0 (0)	67 (67)	30	32	62 (62)
80 ng/µL	80 ng/µL	100	0 (0)	53 (53)	24	22	46 (46)
160 ng/µL	160 ng/µL	100	0 (0)	41 (41)	16	22	38 (38)
320 ng/µL	320 ng/µL	100	0 (0)	25 (25)	10	10	20 (20)

Tablo 2. Enjeksiyon ve nakli yaşayanlar ve mutagenesis gore sgRNA ve Cas9 farklı konsantrasyonları enjeksiyonlari üzerinde dayalı. Bu tablo Li ve ark. değiştirildi ²¹

Tartışmalar

İ. vitripennis genom son sıralama işlevsel olarak bu tür²³bilinmeyen genlerde karakterize etmek moleküler araçlar için önemli bir ihtiyaç unleashed vardır. CRISPR-Cas9 sistemi ve birçok diğer gen düzenleme araçları, gen fonksiyonları bir dizi organizmalar²⁴için soruşturma değerli olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, kalıtsal mutasyonları üretmek için bu araçlar embriyo microinjections performans gerektirir. Bu nedenle, burada izin vermek için verimli yenilikleri bir dizi içeren bir tekniktir detaylı görsel gösterdi i. vitripennis embriyo microinjections.

Genel olarak, bu ayrıntılı teknik sunar mevcut yöntemleri²³, ile ilgili önemli yenilikler bir dizi izin veren için verimli i. vitripennis embriyo microinjections. Örneğin, embriyo hızlı toplama kolaylaştırmak için bir oviposition aracı (köpük tıpa) oluşturulur ve büyük ölçüde kolaylaştıran çok sayıda embriyo içinde topluluğu olan ana bilgisayarı (şekil 1), arka sonuna tamamen döşeme yumurta sınırlandırmak için kullanılır kısa bir süre. Yaban arısı kolonileri daha fazla sayıda yumurta toplamak için büyük sayılarla yetiştirme teknikleri de tanımlanan ve geliştirilmiş. Ayrıca, embriyo hizalama hızlandırmak için etkili bir şekilde hizalanmış ve embriyo yerde (şekil 3) güvenlik altına almak için çift taraflı yapışkan bant kullanmak zorunda kalmadan enjekte embriyolar için izin veren bir embriyo hizalama cihazı geliştirdi.

Ayrıca, bu embriyolar su ile nemli enjeksiyon ve embriyoların kurutulan ya da onları yağla kapsayan sırasında tutarak sağkalım oranları gelişmiş bulunur. Ayrıca, kapiller cam çeşitli test ve mükemmel iğneler i. vitripennis mikroenjeksiyon (Tablo 1, şekil 4) için oluşturmak için parametreleri belirlenir. Ayrıca, aşağıdaki mikroenjeksiyon, embriyo hayatta kalma oranları önemli ölçüde önceden stung ana enjekte yumurta kuluçka nedeniyle artış edebiliyoruz yüksek oranda nem içeren (% 70) odasında yerleştirilir. Bu yenilikler için bir daha akıcı ve başarılı mikroenjeksiyon yordam i. vitripennisiçin izin.

Enjeksiyon aparatı ve yordamlar yetiştirme açısından küçük değişiklikler bu iletişim kuralı, kullanıcı tercihlerine bağlı olarak yapılabilir. Ancak, bir dizi kritik adım mutantlar i. vitripennisiçinde başarıyla oluşturmak için gerekli olacak. Enjekte embriyo vardır örneğin, hızlı bir şekilde çalışmaya > 1 s eski ve enjeksiyon iğneler embriyo zarar en aza indirmek keskin sağlanması hem de olacak gerekli. Bu iletişim kuralı (hepsi değilse de) birçok genlerinde mutasyon için etkili gerekirken, bir büyük hedef sıra dikte edecek bir PAM (NGG) sürecini hedef için CRIPSR/Cas9 gereksinimi kısıtlamadır.

Sonuç olarak, bu gelişmiş teknik birçok türde mutasyonlar, silme gibi genom değişiklikleri oluşturmak ve transgenik oluşturmak için CRIPSR/Cas9 teknolojileri²¹veya hatta transgene eklemeleri kullanarak eklemeler hatta için kullanılabilir Hangi büyük ölçüde bu organizmanın fonksiyonel araştırma hızlandırmak i. vitripennis.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bugdorm	Bugdorm	41515	Insect Rearing Cage
Glass Test Tubes	Fisher Scientific	982010
Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata	Carolina Insects	144440
Microelectrode Beveler	Sutter Instruments	BV10
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)	Sutter Instruments	104E
Micromanipulator	World Precision Instruments	Kite R
Femtojet Express programmable microinjector	Eppendorf
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000 or P-2000
Stereo Microscope	Olympus	SZ51
Compound Microscope	Leica DM-750
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)	Sutter Instruments	BF100-58-10	Can also use Borosilicate or Quartz
Identi-Plugs	JAECE	L800-B	Foam plugs
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-A3
Micro Cover glass	VWR	48366045
Adhesive	Aron Alpha	AA471	For glueing coverslip onto microscope slide
Fine-tip paintbrush	ZEM	2595
Ultra-fine tip forcep	Fisher Scientific	16-100-121
Femtotips Microloader tips	Fisher Scientific	E5242956003