Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

Özet

Zebra balığı son kullanılan bir vivo içinde modeli sistemi olarak DNA çoğaltma zamanlaması geliştirme sırasında çalışmaya. İşte Zebra balığı embriyo profili çoğaltma zamanlaması için kullanarak iletişim kurallarını ayrıntılı. Bu iletişim kuralı kolayca çoğaltma zamanlaması mutantlar, tek hücre türleri, hastalık modelleri ve diğer türler çalışmaya adapte edilebilir.

Özet

DNA çoğaltma zamanlaması Kromatin yapısı, transkripsiyon ve DNA mutasyon oranları önemli ilişkiler sergileyen bir önemli hücresel özelliği olduğunu. Geliştirme sırasında ve kanser, çoğaltma zamanlaması değişiklikler gerçekleşir ama gelişiminde rolü çoğaltma zamanlaması çalış ve hastalık olmadığı bilinmiyor. Zebra balığı son zamanlarda çoğaltma zamanlaması çalışmaya vivo içinde modeli sistemi kuruldu. İşte Zebra balığı DNA çoğaltma zamanlaması belirlemek için olacak kullanarak iletişim kurallarını ayrıntılı. Embriyo ve yetişkin Zebra balığı hücrelerden sıraladıktan sonra yüksek çözünürlüklü genom çapında DNA çoğaltma zamanlaması desenleri DNA kopya sayısı sonraki nesil sıralama veri analizi ile değişiklikler belirlenerek oluşturulabilir. Zebra balığı modeli sistemi içinde geliştirme vivo ortaya ve değişiklikleri tek tek hücre tipleri, hastalık modelleri ve mutant hattındaki değerlendirmek için de kullanılabilir çoğaltma zamanlaması değişiklikleri değerlendirilmesi için izin verir. Bu yöntemler çalışmalar araştırma geliştirme sırasında mekanizmaları ve çoğaltma zamanlaması kuruluş ve bakım belirleyicileri olanak tanır, mutasyonlar ve tumorigenesis ve perturbing etkileri rolü çoğaltma zamanlaması çalış çoğaltma zamanlamasını geliştirme ve hastalık.

Giriş

Başarılı bir şekilde bölmek hücreler için onlar ilk doğru ve sadakatle tüm onların genom çoğaltması gerekir. DNA çoğaltma zamanlama programı¹olarak bilinen bir tekrarlanabilir model genom çoğaltma oluşur. DNA çoğaltma zamanlaması Kromatin organizasyon, epigenetik işaretleri ve gen ifade^2,3ile ilişkilidir. Çoğaltma zamanlaması değişiklikleri geliştirme ortaya ve Kromatin işaretleri ve organizasyon^4,5için değişiklik ve transkripsiyon için önemli ölçüde ilgili programlar vardır. Ayrıca, çoğaltma zamanlaması mutational frekansları ile ilişkilidir ve kanser^6,7,8çeşitli zamanlama değişimler gözlenmektedir. Bu gözlemler rağmen mekanizmaları ve çoğaltma zamanlaması kuruluş ve yönetmelik belirleyicileri hala büyük ölçüde bilinmeyen ve bu gelişmede rol ve belirsiz bir hastalıktır. Ayrıca, son zamanlarda genom çapında çoğaltma kadar omurgalı geliştirme meydana gelen değişiklikler zamanlama yalnızca hücre kültür modellerinde muayene.

Zebra balığı, Danio rerio, geliştirme sırasında çoğaltma zamanlaması vivo içinde çalışmaya uygun olarak tek bir çiftleşme çift, geliştirmek embriyolar yüzlerce memeli geliştirme^{9birçok benzerlikler ile hızla yol açabilir, 10}. Ayrıca, Zebra balığı geliştirme, hücre döngüsü, Kromatin organizasyon ve ilişkileri DNA çoğaltma zamanlaması¹¹ile paylaşan transkripsiyon programları değişiklik vardır. Zebra balığı da mükemmel bir genetik model özellikle transgenesis, mutagenesis ve hedeflenen mutasyonlar tarafından manipülasyon için mükellef olduklarını, ve vardır birçok genlerin omurgalı geliştirme¹²için gerekli genetik ekranlar belirledik. Bu nedenle, Zebra balığı genler çoğaltma zamanlaması kuruluş ve bakım dahil tanımlamak ve çoğaltma zamanlaması omurgalı geliştirme yapmak etkilerini gözlemlemek için kullanılabilir. Transgenik satırları tek tek hücre tipleri, farklı gelişim timepoints veya hastalık ortamlarda izole üzerinden çoğaltma zamanlaması değerlendirmek için kullanılabilir. Önemlisi, çoğaltma zamanlaması, hastalık oluşumu ve ilerleme^9,13,-¹⁴rolünü araştırmak için kullanılan insan hastalık çeşitli Zebra balığı modelleri vardır.

Son zamanlarda, ilk çoğaltma zamanlaması profilleri Zebra balığı vivo içinde¹⁵zamanlama çoğaltma çalışma modeli sistemi kurulması, oluşturulan. Bunu yapmak için hücreleri Zebra balığı embriyo gelişimi ve yetişkin Zebra balığı izole bir hücreye birden fazla aşamalarında toplanmıştır. Hücreleri sonra G1 ve S faz popülasyonlar izole etmek için DNA içeriğine göre (floresan aktif hücre sıralama) FACS tarafından sıralanır. G1 örnek kopya numarası denetimi olarak kullanarak, numara varyasyonları nüfus tespit ve göreli çoğaltma zamanlaması¹⁶anlaması için kullanılan S aşamasında kopyalayın. Çoğaltma zamanlaması değişiklikleri daha sonra doğrudan farklı gelişim örnekleri ve hücre tipleri arasında karşılaştırılabilir ve bu vivo omurgalı geliştirme boyunca oluşan çoğaltma zamanlaması değişiklikleri belirlemek için kullanılmıştır. Bu yöntem esas bu timidin analogları veya DNA^4,6immunoprecipitation ile etiketleme gerektirmez genomik diğer yöntemler üzerinde birçok avantaj sunar.

İşte profil genom çapında DNA çoğaltma zamanlaması, iletişim kurallarını ayrıntılı yüksek çözünürlüklü Zebra balığı. Bu protokoller geliştirme oluşan bu ilişkiler değişimler profil oluşturma yanı sıra, Zebra balığı genom genomik ve epigenetik özellikleri ile ilişkileri belirlemek için kullanılmıştır. Bu iletişim kuralları da kolayca değişiklikler çoğaltma zamanlaması Zebra balığı mutant suşu ve hastalık modelleri çalışmaya adapte. Buna ek olarak, bu yöntemleri üzerine çoğaltma zamanlaması belirli hücre türleri, Zebra balığı tek hücre türlerinden ilk sıralama tarafından çalışma için genişletilebilir bir temel sağlar. Zebra balığı çoğaltma zamanlaması çalışmaya ve sonuçta bu önemli epigenetik özellik biyolojik fonksiyonları ortaya çıkarmak için bir mükemmel vivo içinde modeli sistemi olarak hizmet verebilir.

Protokol

Tüm hayvanlar Oklahoma tıbbi araştırma Vakfı kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokolleri ile sıkı uygun olarak ele.

1. yetişkin Zebra balığı üreme için ayarlama

1. Tek bir baskı yetişkin erkek ve dişi Zebra balığı büyük bir kohort üremek için kullanın. Zebra balığı bile tek bir baskı genetik makyaj küçük farklılıklar vardır, büyük bir kohort sonuçların nüfusun genetik değişkenliği temsilcisi ve nüfusun küçük bir alt kümesi değil sınırlı olduğundan emin olmak için kullanın.
2. Embriyo toplanan önceki gece üreme yetişkin onlarca tank doğurmak içine yerleştirin, kadın ve erkek yaklaşık olarak eşit sayıda kullanın. Deneme bağlı olarak, aşağıdaki üreme stratejileri kullanın.
   1. Strateji 1 ıslahı: bireysel üreme tanklarda birkaç erkek ve dişi Zebra balığı yerleştirin, bir bölücü dişilerle erkekler ayrı. Bu yaklaşım kullandıysanız, birçok farklı üreme tankları tertibat ve embriyo her biyolojik değişkenlik temsilcisi nüfusun olduğundan emin olmak için havuz.
   2. Strateji 2 üreme: erkek ve dişi Zebra balığı büyük yetiştirme tankında onlarca birleştirir. Bu strateji kullanmak yeterli sayıda embriyo vardır sürece, kurucuları ve vardır bu nedenle nüfus genetiği temsil eden çeşitli geldiler varsaymak makul.

2. matings - toplama, sıralama ve deneyler için Zebra balığı embriyo konut zaman aşımına uğradı

1. Zamanlanmış matings, sabahları olmak ışık döngüleri en kısa zamanda başlayan gerçekleştirin. Gecede oluşturulan herhangi bir embriyo atmak.
2. Balık (3-5 cm) sığ sularda üremeye embriyo ile kaçmak için yanlış alt ile 10 dakika süreyle izin verir.
3. 10 dakika sonra embriyo bir süzgeç aracılığıyla dökme ve 10 cm tabak yıkama şişe içine durulama tarafından toplamak. Tüm embriyoların aynı zaman noktada toplanan havuzu işaretle onları toplama ve hemen bir kuluçka 28.5 ° C'de yer zamanla
4. Embriyolar yüzlerce tek bir çiftleşme çift bir günde beklenebilir. Yetişkinler 10 min elde edilen embriyo sayısı daha az yirmi kadar devir doğurmak için izin.
5. Yaklaşık 1-1.5 h koleksiyonu, ölü ve döllenmemiş embriyo kaldırmak için sıralama embriyo sonra. Embriyo sıralamak için kuluçka kaldır ve diseksiyon mikroskop altında gözlemlemek.
   1. Embriyo sayısı ve 10 cm tabak başına 100 embriyo yoğunluğu yerleştirin.
   2. Taze E3 orta (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄) eklemek ve embriyo 28.5 ° C kuluçka dönmek.

3. Dechorionate, deyolk ve Zebra balığı embriyo düzeltmek

Not: Bu bölümde protokolü 48 saat sonrası döllenme (hpf) önce embriyo için tasarlanmıştır. Daha sonra yaşlardaki embriyo chorions kaldırmak için gerek yoktur (48 sonra hpf), onlar genellikle doğal düşmek gibi. Deyolk veya chorions kaldırmak için gerek yoktur balık büyük 5 gün fertilizasyon (dpf) sonrası.

1. Embriyoların istenen gelişimsel yaşa gelince, "Aşamaları, embriyonik geliştirme, Zebra balığı"¹⁷göre hafif mikroskopla morfolojik gelişimi uygun sahne doğrulayın.
2. 15 mL konik tüp 1500 aşamalı embriyo transfer ve birkaç kez E3 ile yıkayın.
   1. E3 1 mL ve 100 her embriyo için Pronase çözümü (30 mg/mL) 20 µL ekleyin ve hafifçe girdap. 1500 embriyolar kadar dechorionated E3 15 mL ile tek bir tüp içinde olabilir.
   2. Tüp yan yattı ve embriyo maksimum hacim oranı yüzeye emin olmak için bile bir katmanda düzenlemek. Yavaşça tüm chorions kadar her 2-3 dk embriyo kapalı düşmüş tüp kışkırtmak. Toplam dechorionation süre Pronase etkinlik bağlı olarak değişir.
3. Süpernatant kaldır ve yavaşça embriyo 3 kez ile E3 10 mL durulayın. Embriyo Protokolü'nün bu bölümün geri kalanında buz yerleştirin.
4. E3 kaldırmak ve yıkama embriyo ile taze hazırlanmış buz gibi deyolking arabellek (0.5 x kalsiyum olmadan Ginzburg balık zil'ın çözüm: 55 mM NaCl, 1.8 mM KCl, 1,25 mM NaHCO₃).
   1. Buz gibi deyolking arabellek 500 embriyolar için 1 mL ekleyin.
   2. Bir P1000 kullanarak yavaşça pipet embriyo yukarı ve aşağı 5 - 10 kat için sarısı çuval bozabilir.
   3. 1 mL 1.5 mL microfuge tüp ve 5 min için 4 ° C ve 500 x g santrifüj aktarın.
5. Buz gibi 1 x PBS (fosfat tamponlu tuz, pH 7,0) zil'ın çözümü kaldırmak için 1 mL ile süpernatant ve yıkama Pelet kaldırın. Santrifüj 4 ° C'de ve 5 min için 500 x g.
6. Dikkatle süpernatant kaldırmak ve 1 mL 1 x PBS hücrelerde resuspend. Tüp Buza koyun.
7. Buz gibi soğuk etanol (alkol) 3 mL 15 mL konik tüp ekleyin. Alkol girdap tüp düşük ayarı hafifçe üfleyin.
   1. P1000 yavaş yavaş (saniyede 1 damla) damla Zebra balığı embriyo hücre süspansiyon alkol içine vortexing ederken yavaşça kullanarak.
   2. 1 ml embriyo hücre süspansiyon % 75'i son fiksasyon çözüm için bir toplam eklemek alkol.
8. Hücre sonra 1 mL süspansiyon eklendi, hafifçe karıştırın ve en az 1 h için-20 ° C'de yer için girdap tüp. Bu tüpler maksimum hacim oranı yüzeye emin olun ve embriyo ve birbirine destek hücrelerinin sayısını azaltmak için onların yanına koyun için tavsiye edilir. Embriyo hücreleri-20 ° C'de 2-3 hafta için saklayın.

4. DNA ve embriyo sıralama FACS boyama

Not: Bu bölümde Protokolü'nün 1 dpf, embriyo için tasarlanmıştır.

1. Alkol-sabit embriyo hücreleri-20 ° C ve 5 min için 4 ° C 1500 x g, santrifüj kaldırın.
   1. Tüp buz ve Kaldır süpernatant üzerinde dikkatlice yerleştirin. Bir P1000 kullanarak, yavaşça 1 mL taze hazırlanmış soğuk PBS-BSA (1 x PBS, %1 sığır serum albümin) hücrelerde resuspend.
   2. 4 ° C ve 5 min için 1500 x g hücreleri santrifüj kapasitesi ve Buza koyun.
2. Çözüm (50 µg/mL PI, 100 µg/mL RNase A, PBS, pH 7,0) Boyama Kaldır süpernatant ve resuspend hücrelerinde propidium iyodür (PI) 200 µL için her 1000 embriyo kullanarak.
   1. 30 dk buz üzerinde hafifçe her 5 dk karıştırma için PI çözümde kuluçkaya hücrelere izin.
   2. Bir 40 µm naylon hücre süzgeç 50 mL konik tüp buz üzerinde yerleştirin. Yavaşça karıştırın ve mesh filtrelemek için hücreleri pipet.
      Not: Eğer embriyo aynı timepoint üzerinden birden çok tüpler protokol madde 3 te toplanmıştır, tüm birlikte sıralanır Bu embriyoların bu noktada birleştirmek.
   3. Düz bir şırınga dalgıç sonu içinde kullanarak, yavaşça mesh sayfasında bulunan bir hücreler kalan herhangi bir kümeleri bozabilir.
   4. Hücreleri ile soğuk PBS-BSA 500 µL Filtresi için her 1000 embriyo ile yıkayın.
   5. 40-µm kafes 15 mL konik tüp buz üzerine getirin ve hücre süspansiyon 50 mL konik tüp ikinci kez 15 mL tüp içine filtre.
3. Uygun bir hücre enstrüman sıralama kullanarak, lazer uyarma 561-nm ve emisyon algılama propidium iyodür algılamak için 610/20 için ayarlayın.
   1. Kısaca vortexing ve alet 4 ° C'de yer tarafından lekeli hücrelerinin Mix 15 mL tüp
   2. Hücreleri yavaş akış oranı, ideal 1.0 mL/temiz hücre döngüsü profil elde etmek ve G1 karıştırma önlemek üzere min, ya da nüfus G2/M hücreleri S ile faz çalıştırın.
   3. İlk olarak, FSC-A x SSC için kapı-bir (ileri dağılım alanı) yan dağılım alanına göre enkaz (şekil 1A) kaldırmak için.
      Not: Embriyo hücreleri boyutları sahne ve hücre türüne bağlı olarak farklı. Nötr yoğunluk (ND) filtre 1.0 ve hücreleri mevcut büyüklüğüne bağlı olarak 1.5 arasında açık olması gerekir. En hücreleri toplamak ve enkaz kaldırmak için geniş bir alana kapı.
   4. İkinci, kapı SSC-alan (SSC-A) PI-enkaz, hücre birini (şekil 1B) kaldırmak için alanı tarafından (PI-A), için.
   5. Üçüncü olarak, için kapı SSC-A SSC-kalan herhangi bir hücre birini (şekil 1 c) kaldırmak için W (genişlik) tarafından.
4. Cep numarasını (sayısı) ile bir çubuk grafik üzerinde nüfus geçişli görüntü y ekseni ve propidium iyodür alanında x ekseni (PI-A). 24 hpf embriyolar için bu rakam 1 dolduğu gibi klişeleşmiş hücre döngüsü profil vermelidir.
   1. S faz nüfus şekilde, G1 ve G2 nüfusu en az bir miktarı G2 tepe sol tarafına G1 tepe sağ taraftan kapıyı ayarlarsınız. 24 hpf embriyolar için bu genellikle kapı nüfusunun yaklaşık % 10-15 kapsar (bkz. şekil 1 d).
   2. G1 nüfus şekilde, G1 en yüksek tepe üstünde değil geçmek için sol taraftaki geçidi ayarlarsınız. G1 kapıya kadar dar genişliğini ayarlayın (bkz. şekil 1 d).
   3. Kapı G1 ve S faz popülasyonlar uygun ilk gating (şekil 1E) emin olmak için geri.
5. G1 ve S faz nüfus 3 mL ile 15 mL konik tüpler içine PBS-BSA sıralayın. Kesir (G1 ve S fazı) başına 500.000 ve 1 milyon veya daha fazla sıralanmış hücreleri arasında elde etmek için gereken hedefi.
6. Sıralama tamamlandıktan sonra 1500 g x ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüj tüpleri.
   Not: Küçük hücreli Pelet görmek zor olacaktır ve bu engellemeden önlemek için bu yüzden tercihen bir sabit açılı rotor üzerinde sallanan bir kova rotor kullanmak önemlidir.
7. Dikkatle süpernatant kaldırmak ve Pelet 1 mL 1 x PBS ile resuspend. Hücreleri bir 1.5 mL microfuge tüp ve santrifüj 6.000 x g ve 4 ° C 5 min için transfer.
8. Dikkatle tüm sıvı tüpünden çıkarın ve kuru Pelet-20 ° C'de dondurmak Pelet-20 ° C'de 2-3 hafta için saklayın.

5. DNA izolasyon, RNase bakım ve DNA arıtma

1. -20 ° C ve buz üzerinde yer hücre Pelet kaldırın.
   1. Cips ve resuspend için SDS arabelleği (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA, 1 M NaCl, % 0.5 SDS) 400 µL ekleyin.
   2. İndinavir K 0.2 mg/mL nihai bir konsantrasyon ve vortexing tarafından kısa bir süre karıştırın.
   3. Örnekleri 56 ° c 2 h, girdap her 15dk için kuluçkaya.
2. 2 h sonra fenol kloroform (fenol: kloroform: izoamil alkol 25:24:1, 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA ile doymuş) 400 µL ekleyerek fenol kloroform ayıklama gerçekleştirmek.
   1. 16.000 x g aşamaları ayırmak 5 min için de 20 s ve santrifüj örnek için girdap.
   2. Üst sulu faz (400 µL) ve 1.5 mL tüp transferi dikkatli bir şekilde çıkarın.
3. Alkol yağış 40 µL 3 M sodyum asetat (pH 5.2), 2 µL glikojen ve 1 mL alkol ekleyerek gerçekleştirin.
   1. Girdap iyice karıştırın ve -20 ° DNA çökelti C gecede yerleştirmek için. Örnek ayrıca-80 ° C'de veya 1 h için kuru buzda çöktürülmüş.
   2. 4 ° C ve 16.000 x g Pelet DNA için 30 dk santrifüj örnek.
   3. Atma süpernatant ve yıkama Pelet 1 mL % 70 alkol. Santrifüj 4 ° C'de ve 16.000 x g 5 min için.
   4. 2-3 dakika için ortam sıcaklığında süpernatant ve air-dry Pelet atmak.
4. Pelet 96 µL autoclaved su içinde dağıtılması ve 4 µL RNase A, (2 mg/mL) ekleyin.
   1. De vortexing tarafından mix ve 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
5. Fenol kloroform ayıklama adımları 5.2.1 - 5.2.2 fenol kloroform ve aşağıdaki yordamı 100 µL ekleyerek gerçekleştirin.
6. Alkol yağış ekleyerek 10 µL 3 M sodyum asetat, 1 µL glikojen ve alkol ve aşağıdaki yordamı adımla 5.3.1 - 5.3.5 250 µL yerine getirilir.
7. Pelet TE arabellek (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH8.0)) 60 µL içinde resuspend ve kantitatif floresan tabanlı yöntemi kullanma DNA konsantrasyonu belirlemek. Mağaza DNA-20 ° C'de
   Not: DNA DNA bağlama floresan-esaslı boyalar veya başka bir yöntemle UV Spektrometre tabanlı yöntemlerden daha güvenilir kullanarak ölçmek önemlidir.

6. DNA kütüphaneler ve sonraki nesil sıralamanın hazırlanması

Not: G1 kopya numarası örneği biyolojik her kaynak için (Yani WT, mutant, transgenik, hücre kültürünü, vb) her sıralama çalışması için gereklidir. Tüm S aşama örnekleri aynı G1 referansı çalıştırmak aynı sıralama aynı biyolojik kaynaktan karşılaştırın. Örnekler arasındaki tutarlılığı sağlamak için her örneğinin çalışma en az iki biyolojik çoğaltır.

1. DNA 1 µg son hacmi 50 µL ve sonication için özel bir tüp aktarmak için sulandırmak.
2. 250-300 BP üreticisinin teknik özellikleri ve iletişim kuralı göre odaklanmış bir ultrasonicator içinde bir hedef için genomik DNA kesme.
3. Kalite ve üreticisinin teknik özellikleri ve iletişim kuralı göre bir otomatik Elektroforez makinasıyla yamultulmuş genomik DNA boyutunu doğrulayın. ~ 250-300 büyük bir zirve sağlamak bp yamultulmuş genomik DNA'ın.
4. Bir DNA Kütüphane hazırlık seti ile çok katmanlı oligos sıralama Illumina platformda için kullanarak sıralama kitaplıkları üreticisinin protokole göre hazırlayın.
5. Otomatik Elektroforez makinasıyla Kütüphane hazırlık kalitesini üreticisinin protokole göre doğrulayın. ~ 400-450 büyük bir zirve sağlamak bp, ve astar dimer (80-85 bp) ve bağdaştırıcı dimer en az tepeler vardır (~ 120 bp).
6. Kitaplık üreticisinin protokolüne göre yeni nesil DNA sıralama için bir DNA Kütüphane miktar kit kullanarak ölçmek.
7. 5 nM ve birleştirmek bir konsantrasyon kitaplığına seyreltik 15 µL multiplexed kitaplıkları benzersiz olarak istenilen elde etmek için gerektiği şekilde eşleme örnek başına sayıları oku.
   Not: Örnek başına benzersiz olarak eşleme okuma sayısı çözünürlüğünü belirler. Zebra balığı genom çoğaltma zamanlamasını değerlendirmek için kullanım 5 milyon eşlenen az okur. Bu 10-20 milyon okuma ile başlatmak için tavsiye edilir.
8. Eşleştirilmiş uç 100 bp tüm genomu DNA sıralama örneklerinin bir sonraki nesil sıralama, üreticinin talimatlarına göre platformunda.

7. sıralama veri analizi

Not: Bu bölümünde yer alan yönergeleri analiz için bir kılavuz olarak hazırlanmıştır. Ek yöntemleri, işleme, vb filtreleme sıralama hizalama için kullanın. Bu bölüm iletişim kuralının tercih edilen bu eser analiz yöntemi ele alacağız. Ek yöntemler kullandıysanız, bu amaçlar uyacak işlevleri ve parametrelerini ayarlamak. Aşağıdaki komutları Ubutnu veya Mac terminal, yüklü uygun paketleri ile girilir.

1. Zebra balığı genom en son sürümlerini edinmek (danRer10, aynı derecede-in bu iletişim kuralı ne zaman yazılmıştır) aşağıdaki komutları kullanarak UCSC Genom tarayıcı:
   wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz
   1. Aşağıdaki komutu ile fa.gz dosyasını açın:
      gunzip danRer10.fa.gz
   2. Genom BWA-mem aşağıdaki komutları kullanarak kullanarak sıralama verileri hizalama:
      BWA mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
2. .Sam dosya .bam dosya samtools ile aşağıdaki komutu kullanarak dönüştürmek:
   samtools -bS input.sam göster > output.bam
   1. Samtools birlikte aşağıdaki komutu kullanarak hizalanmış sıralama dosyaları Sırala:
      samtools sıralama output.bam > output_sorted.bam
   2. Samtools birlikte aşağıdaki komutu kullanarak .bam dosyasını dizin:
      samtools dizin output.bam
3. Mark PCR aşağıdaki komutları kullanarak Picard'la çoğaltır:
   Java-Xmx2g-picard.jar MarkDuplicates kavanoz \
   Input=input.bam
   OUTPUT=OUTPUT.bam
   REMOVE_DUPLICATES = false
   METRICS_FILE=output_metrics.txt
4. Aşağıdaki komutu kullanarak her kromozom için okuma metin (.txt) dosya oluştur:
   Ben içinde {1,25}; Krom yapmak "chr" $i; = echo $CHROM; samtools input.bam $CHROM göster | -f 2,4,5,7,8,9 kesmek > readsChr$ {i} .txt; bitmiş
   Not: Bayrak, sütunlar elde edilen .txt dosyası konumu, mapQ, çifti chr, çifti yer ve parça boyutu, anılan sıraya göre.
5. Matlab (veya herhangi bir diğer benzer bilgisayar yazılımı) textscan işlevini kullanarak .txt dosyaları okur.
   1. Düşük eşleme kalite okur 30 mapQ eşik ayarlayarak filtre uygulamak.
   2. Okuma bayrakları ile değil birincil hizalama, PCR çoğaltmaları veya farklı bir kromozom çifti eşleme için kaldırın.
   3. Herhangi bir okuma 2000 bp bir mesafe eşiğin ötesinde onların çifti ile filtre.
   4. İstatistikler elde edilen okuma okuma istatistikleri, kapsamı, INSERT boyutu ve kalitesi (Şekil 2) sayısını belirlemek için değerlendirin.
6. Okuma kapsamı içinde 100 bp sabit pencere eşiği her örnek için her kromozom uzunluğu boyunca 100 bp aralıklarla okuma sayısı sayarak belirler.
   1. Ortanca okuma sayısı tüm windows için hesaplayın.
   2. Yüksek kapsama bölgelerinde medyan windows 5 standart sapmalar büyük kaldırarak filtre.
7. Analiz için bölgeleri G1 başvuru örnekleri sürgülü windows kullanarak 200 okuma ile segmentleri her kromozom boyunca bularak tanımlayın.
   1. Her S faz örnek Okuma derinlemesine S faz okuma sayısı eşlik eden G1 başvuru için tanımlanan 200-Okunma Sayısı Windows sayarak belirler.
8. Yazılım, bir ilişkilendirme faktörü (p), 10^-16ile csaps işlevini kullanarak ham veri düz.
9. Z-skor 0 ortalaması ve standart sapması 1 ile düzgünleştirilmiş verileri normalleştirmek.

Sonuçlar

Yayımlanan çoğaltma zamanlama verilerini kullanarak, temsilci çoğaltma zamanlaması profilleri ve kalite kontrol tedbirleri¹⁵temin edilmektedir. İlk adımlar işleme hizalayarak genom, okuma uzunluğu ve genom kapsamı istatistikleri hesaplama ve unpaired, düşük kaliteli, filtreleme ve PCR yinelenen okuma için sıralama veri içerir. Okuma istatistikleri için tipik Zebra balığı sıralama örnek Şekil 2' de gösterilir. S...

Tartışmalar

Zebra balığı DNA çoğaltma zamanlaması eğitim için yeni ve benzersiz vivo içinde modeli sistemi sağlar. Ne zaman zamanlanmış matings olarak yapılmaktadır bu deneysel protokol için ayrıntılı, embriyo binlerce deneyler için tek bir gün içinde toplanabilir. Bu embriyoların zaman uyumlu olarak tam zamanlı ve net olarak karakterize aşamalarında gelişme geliştirmek. Zebra balığı kolayca ve doğru bir şekilde Zebra balığı embriyo dışarıdan geliştirmek ve optik net gibi bir stereomic...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
KCl	Fisher Scientific	P217-500
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
MgSO4	EMD Millipore	MMX00701
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-500
Pronase	Sigma	10165921001	protease solution
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	D1408
Ethanol (EtOH)	KOPTEC	V1016
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A9647-100G
Propidium Iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-500
EDTA	Sigma	E9844
SDS	Santa Cruz	sc-24950
Proteinase K	NEB	P8107S
Phenol:Chloroform	Sigma	P3803-100ML
Sodium acetate	J.T.Baker	3470
Glycogen	Ambion	AM9510
RNase A	Thermo Scientific	EN0531
Quanit-iT	Invitrogen	Q33130	Reagents for fluorescence-based DNA quantification
Covaris AFA microTUBE	Covaris	520045	specialized tube for sonication
Covaris E220 Sonicator	Covaris	E220	focused ultrasonicator
Agilent 4200 Tapestation	Agilent	G2991AA	automated electrophoresis machine
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582	Reagents for automated electrophoresis machine
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina	NEB	Cat#E7370L	DNA library preparation kit
NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1)	NEB	Cat#E7335S	multiplex oligos for DNA library preparation kit
NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2)	NEB	Cat#E7500S	additional multiplex oligos for DNA library preparation kit
NEBNext Library Quant Kit for Illumina	NEB	E7630L	quantification kit for library preparation
Agencourt AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63882	magnetic beads
Illumina HiSeq 2500	Illumina	SY–401–2501	next generation DNA sequencing platform
40 µm Falcon Nylon Cell Strainer	Fisher Scientific	08-771-1
VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm	VWR	89107-632
6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100	VWR	89078-446
Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color	Denville Scientific	C2170 (1001002)	Dnase/Rnase free
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Wash Bottles	VWR	16650-022	Low-Density Polyethylene, Wide Mouth
Strainer	VWR	470092-440	6.9 cm, fine mesh
Corssing tank	Aquaneering	ZHCT100	individual breeding tank
iSpawn	Techniplast	N/A	large breeding tank
FACSAria II	BD biosciences	N/A	cell sorting machine
Wild M5a steromicroscope	Wild Heerbrugg	N/A	dissecting microscope
Qubit 3 Fluorometer	Thermo Scientific	Q33216	quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration
Matlab	Mathworks	version 2017a
Matlab Statistics Toolbox	Mathworks	version 11.1
Matlab Curve Fitting Toolbox	Mathworks	version 3.5.5