Akış Sitometresi kullanarak insan yağ dokusu içinde bağışıklık hücreleri karakterizasyonu

Özet

Bu makalede bağışıklık hücreleri yağ dokusu ve daha sonraki analiz Akış Sitometresi kullanarak yalıtım tarafından yağ dokusu bağışıklık hücre içeriğini analiz etmek için bir yöntem.

Özet

Subkutan ve viseral Yağ dokusundan (AT) mevduat bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonu tip 2 diyabet gibi obezite ile ilişkili komplikasyonların gelişmesine katkıda bulunan bir düşük dereceli iltihabı neden olur. Nicelik ve nitelik itibariyle mevduat insan bağışıklık hücre alt kümeleri araştırmak için bir Akış Sitometresi yaklaşım geliştirdik. Stromal vasküler kesir (SVF), bağışıklık hücreleri içeren subkutan ve visseral biyopsi, collagenase sindirim tarafından izole edilmiştir. Adiposit Santrifüjü sonra kaldırılır. SVF hücreleri bağışıklık hücre alt kümeleri arasında ayırt etmek için seçilen ve Akış Sitometresi kullanılarak analiz birden çok membran bağlı işaretler için lekeli. Bu yaklaşım, pro ve anti inflammatory makrofaj alt kümeleri, bir sonucu olarak dendritik hücreler (DCs), B-hücreleri, CD4⁺ ve CD8⁺ T-hücreleri, ve NK hücreleri tespit ve sayılabilir. Bu yöntem AT bağışıklık hücreleri ve her belirli alt miktarı hakkında ayrıntılı bilgi verir. Mevcut çok sayıda floresan antikor olduğundan, Akış Sitometresi yaklaşımımız çeşitli diğer hücresel ve hücre içi işaretleri ilgi ölçmek için ayarlanabilir.

Giriş

Obezite ile düşük dereceli AT ile karakterize iltihap¹ ve pro-inflamatuar bağışıklık hücreleri (KDV, oturdu), visseral ve subkutan infiltrasyonu. Pro-inflamatuar bağışıklık hücreleri KDV birikimi tip 2 diyabet²geliştirmek için birincil bir risk faktörü olan insülin direnci yol açar. Doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sisteminin bağışıklık hücreleri makrofajlar, nötrofiller, mast hücreleri gibi obez AT CD4 bulunur⁺ ve CD8⁺ T-hücre ve B-hücreleri^{3,4,5,6 ,7}. Endotel hücreleri, stromal hücreler, adipocyte ataları, fibroblastlar ve perisitlerden, bu bağışıklık hücreleri SVF⁸ oluşturmaktadır ve AT⁹pro-inflamatuar maddeler ana kaynaktır.

AT inflamatuar durumunu yaygın olarak Western blot¹⁰, qPCR¹¹ve immünhistokimya¹¹gibi teknikleri tarafından araştırıldı. Ancak, bu teknikler, tüm AT, adipositler ve SVF kullanıldığında kullanılır. Bu zor tutar ve bağışıklık hücreleri AT mevcut alt kümelerine belirlemek yapar. Bağışıklık hücreleri tanımlamak ve onları, makrofajlar gibi kategorilere ayırmak için çeşitli hücre işaretleri var. Makrofajlar önemli heterojenite içinde işlev ve hücre yüzey marker ifade¹²i göster. Bu nedenle, sık sık iki makrofaj nüfus kategorize edilir: M1 ve M2. M2 makrofajlar genellikle alternatif olarak aktif makrofajlar^12,13 denir ve yalın, metabolik olarak normal insanlar¹⁴AT bulunur. Ancak, obezite sırasında fenotipik anahtarı M2 makrofajlar M1 makrofajlar için oluşur. Bunlar klasik makrofajlar CD11C¹² hızlı ve ölü adiposit taç benzeri yapıları¹³oluşturmak üzere birikir M1 aktif. Bu gösterilmiştir o CD11C⁺ AT makrofajlar insülin eylem zayıflatabilir ve obez insanlar¹⁵insülin direnci ile ilişkili. AT M1 ve M2 makrofajlar tanımlamak için immünhistokimya bir seçenektir. Bu teknik doku makrofajlar konumu hakkında bilgi verir. Ancak, bir boyama kullanılan işaretleri sayısı sınırlar. Ayrıca, ölçmek zordur. Bu nedenle, farklı bağışıklık hücre alt kümeleri KDV ve uydu mevduat araştırmak için biz bir Akış Sitometresi yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım bize hücre alt kümeleri tanımlamak ve her alt AT yataklarında mevcut sayıları saymak için bir Akış Sitometresi Analizi ile hücre başına birden çok işaretçileri kullanmak için fırsat verir.

Protokol

Visseral ve subkutan örnekleri tıbbi etik Komitesi Jessa hastane, Hasselt ve Hasselt Üniversitesi, Belçika, Helsinki Deklarasyonu doğrultusunda tarafından onaylanan çalışma kayıtlı konulardan alınmıştır.

1. hazırlanması reaktifler

1. Collagenase çözüm
   1. 1 g geçiyoruz Collagenase ben fosfat 10 ml serum fizyolojik (PBS, kalsiyum ve magnezyum olmadan) 100 mg/mL stok çözüm yapmak için arabelleğe alınmış. 200 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın
   2. Collagenase XI 1 g 10 ml 100 mg/mL stok çözüm yapmak için PBS çözülür. 200 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın
   3. Dnaz 10 mg dağıtılması ı yapmak a 10 mg/mL stok eriyik için PBS 10 mL. 180 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın
   4. 100 µL Collagenase ekleyin ben (100 mg/mL), 100 µL Collagenase XI (100 mg/mL) ve 90 µL Dnaz 10 mL DMEM Ham'ın F12 için ben (10 mg/mL). Collagenase çözüm her yalıtım için taze olun.
2. Eritrosit lizis arabellek
   1. 0,84 g NH₄Cl ultrasaf su 100 ml geçiyoruz.
   2. PH 7.4 kullanmadan önce ayarlayın. Bir cam şişeye 4 ° C'de depolayın
   3. Eritrosit lizis arabellek buz kullanmadan önce yerleştirin.
3. FACS arabellek
   1. 0.5 g sığır serum albumin (BSA) 100 mL % 0.5 BSA PBS elde etmek için PBS çözülür.
   2. 65 mg NaN₃ 10 mM NaN_%3 0.5 BSA PBS elde etmek için 100 mL % 0.5 BSA PBS çözülür. Bir cam şişeye 4 ° C'de çözümde mağaza
   3. Kullanmadan önce buzda yer FACS arabellek.
      Dikkat: NaN₃ çok zehirli. Bir duman mahallede çalışma ve koruyucu gözlük ve eldiven NaN₃işleme koruma için giymek.
4. İnsan IgG blok
   1. 10 mg insan IgG 10 ml 1 mg/mL elde etmek için PBS çözülür. 100 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın
   2. İnsan IgG blok buz kullanmadan önce yerleştirin.

2. izolasyon SVF AT üzerinden

1. 1 g biyopsi bir 50 mL santrifüj tüpü (örneğin, Falcon tüp) bir neşter ve transferi ile küçük parçalara (± 2 mm²) kesti. Her örnek, 10 mL collagenase çözeltisi ekleyin.
   Not: tamamen tüp kapağını kapatın ve kapağı ¼ geri döndürmek.
2. Nazik (60 devir/dak) sallayarak altında bir su banyosu içinde 37 ° C'de 60 dk için kuluçkaya.
3. Elde edilen süspansiyon 200 µM ile filtre ve yeni bir 50 mL santrifüj tüpü örnek toplamak. 7 mL PBS filtre durulama ve tüm hücreleri elde etmek için filtre üzerine ekleyin.
4. 280 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi
5. Kayan adipocyte kesir pipetting tarafından kaldırın. Hücre Pelet SVF var.
   Not: SVF elde etmek için adipocyte kesir kaldırın. Çünkü bu sadece PBS ve değil kayan adiposit kaldırır tüm uç örnek batış kaçının.
6. SVF PBS collagenase kaldırmak için süspansiyon 70 µM ile filtre, filtre 5 mL PBS ile durulayın ve 280 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi 5 ml resuspend
7. Süpernatant kaldırmak ve Pelet 3 mL eritrosit lizis arabellek resuspend.
8. Buz üzerinde 5 min için kuluçkaya. PBS 7 mL kuluçka sonra ekleyin.
9. 280 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi

3. boyama SVF Akış Sitometresi Analizi için

1. Hücre Pelet 90 µL 4 ° C FACS arabelleği dağıtılması ve 1 mg/mL insan IgG blok 10 µL ekleyin. Hücre süspansiyon 96 v-shape iyi plaka 2 Wells bölün. Plaka Buza koyun ve 15dk için kuluçkaya insan IgG blok izin.
2. Yıkama ve plaka ile 280 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi için her örnek için 100 µL FACS arabellek ekleyin Süpernatant plaka baş aşağı bir düzgün hareket plaka dokunarak olmadan devrilme tarafından kaldırın.
   Not: kalan herhangi bir sıvı bir doku ile plaka üst plaka baş aşağı tutarak kaldırmak emin olun.
3. Antikor kokteyller Tablo 1 ve Tablo 2' de açıklandığı gibi makrofaj ve DC alt kümeleri (FACS Masası 1) ve T ve B hücre alt kümeleri (FACS panel 2) için hazır olun. Tablo 1 ve Tablo 2 ' de anlatıldığı birimler antikor konsantrasyonları optimize sonra seçilir ve bir KDV veya uydu örnek için yeterli.
   Not: FACS Masası'nda 1, CD303 ve CD141 işaretleri onaylamak için bu CD11C⁺ CD11B^düşük hücrelerdir DCs. Ancak, bu işaretler bir canlı/ölü boyama içerecek şekilde panelinden dışlamak için tavsiye edilir. Her iki FACS Masası 1 ve 2 CD303 panelinde 1 PE kanalı olarak hariç kullanılmayan ne zaman boyama canlı/ölü Fixable kırmızı ölü hücre leke Kit canlılığı ile kombine edilebilir. Üreticinin yönergelerine göre boyama canlılık gerçekleştirin.
4. 29,5 µL antikor FACS paneli 1 kokteyl Pelet ve 23 µL antikor FACS panel 2 kokteyl resuspend. Buz üstünde karanlıkta 30 dk için kuluçkaya.
5. Her şey için 150 µL FACS arabellek eklemek ve ikinci bir yıkama adım gerçekleştirmek için hücre Pelet resuspend. 280 x g ve 4 ° c, 5 min için plaka santrifüj kapasitesi Süpernatant plaka baş aşağı devrilme tarafından kaldırın.
6. 150 µL % 1 formaldehit çözüm hücreleri düzeltmek için her şey için ekleyin. Hücre süspansiyon P200 pipet ile pipetting tarafından karşılık gelen FACS tüp her kuyudan aktarın. 7 gün karanlık up FACS tüpler 4 ° C'de depolayın.
   Not: Doğrudan ölçüm olanağı da sağlar. Her şey yerine % 1 formaldehit 150 µL FACS arabellek eklemek, karşılık gelen FACS tüpler için P200 pipet ile pipetting tarafından hücreleri aktarmak ve hücreleri analiz.
   Dikkat: Formaldehit çok toksiktir. Formaldehit çözümleri inhalasyon önlemek ve eldiven ve koruyucu gözlük koruma için bir duman başlıklı çalışırken hazırlayın.

4. Akış Sitometresi Analizi

1. İlk ölçüm önce bir günahı negatif kontrol ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) ayarlamak için kullanın. Akış Sitometresi üretici yönergelerine göre voltaj ilgi tüm örneğin alınma olasılığını FSC ve SSC grafikte görünür ve enkaz ve canlı hücreleri arasında bir ayrım yapılabilir şekilde ayarlayın.
2. Üreticinin protokol sonrası antikor yakalama boncuk ile çok renkli tazminat çözümlemesi gerçekleştirin.
3. Eksi bir (FMO) denetimleri floresan antikor mix yaparak hazırlamak ancak bir antikor karışımından dışarıda. 8 antikor karışımları FACS paneli 1 ve 6 antikor karışımları FACS panel 2 için oluşturma her antikor için bunu. Bu FMO antikor karışımları bu protokol için daha önce açıklandığı gibi SVF leke için kullanılır.
4. Tüm FMO denetimleri ölçmek ve gating stratejisi FMO denetimlere dayalı ayarlayın. FMO denetimleri mümkün auto-floresan hücreleri algılamak için kullanır.
   Not: bir antikor karışımından kaldırarak, bu kanalda tespit herhangi bir floresan arka plan/autofluorescent sinyal düzeydir. Bu nedenle, farklı FMO karşılaştırarak FACS sonuçları denetlemek, gates belirli nüfus gatings pozitif hücreleri temel alan ve auto-floresan üzerinde temel almayan sağlanması üzerinde çizilebilir.
5. Akış Sitometresi yerleştirerek ve ölçüm başlamadan önce 800 rpm'de girdap FACS tüpler.
   Not: En az 50.000 olayları canlı kapısında yeterince hücre her subpopulation ölçülür sağlamak için önerilir.

Sonuçlar

KDV'den izole ve oturdu SVF Akış Sitometresi kullanılarak ölçüldü. Akış Sitometresi ölçümleri hücresel işaretleri (şekil 1A ve 1B) göre farklı hücre popülasyonlarının gösterilen araziler oluşturmak. İlk olarak, komplo tarafından ileri genişliği (FSC-W) dağılım ve toplamları daha fazla analiz tek hücre düşük FSC-W. çoğunluğuna tarafından elimine edilebilir dağılım alanı (FSC-A), hücre ileri Sonraki, canlı hücreler seçilir ve hücresel enkaz hariç, doğru boyut ve karmaşıklık FSC kullanarak hücreleri çoğunluğuna tarafından-bir ve yan dağılım alanı (SSC-A), anılan sıraya göre. Ölü hücreleri küçük ve bu nedenle ayrı bir nüfus olarak görünür küçük bir ile FSC-A. Sonraki, bağışıklık hücreleri pan-lökosit işaretçiyi CD45 (Panel 1 ve 2, şekil 1A) kullanımı ile seçildi. Diğer bağışıklık hücreleri T hücreleri gibi (CD3), B-hücreleri (CD19), nötrofiller makrofajlar analiz etmek için (CD66b⁺ CD11b⁺), ve NK hücreleri (CD56) farklı antikorlar bu hücreler hedefleme kullanarak ama aynı ile daha fazla çözümleme hariç fluorochrome. Kalan hücrelerin daha fazla alt bölümü CD11b ve CD11c ifadesine dayanıyordu. Bu aşağıdaki nüfus sonuçlandı: CD11b⁺ CD11c⁺ makrofajlar, CD11b⁺ CD11c^- makrofajlar ve CD11b^{düşük /-} CD11c⁺ DCs (FACS Masası 1, şekil 1B). Ortalama Floresans yoğunluğu (MFI) ölçümü izin CD303 ifade miktar (plazmasitoid DC marker) ve CD141 (DC marker), CD11b üzerinde⁺ CD11c⁺ makrofajlar ve CD11b^{düşük /-} CD11c⁺ DCs. Her iki işaretleyiciyi de ifade edildi CD11b içinde daha yüksek^{düşük /-} CD11c⁺ hücreleri onaylayan bu CD11b^{düşük /-} CD11c⁺ hücreleri olduğunu DCs (şekil 1 c).

CD45⁺ hücreleri (şekil 1A) T-hücre ve B-hücre ayrıldı CD3 ve CD19, sırasıyla kullanarak. T-hücreleri T yardımcı hücreleri alt (CD4⁺) ve sitotoksik T-hücreleri (CD8⁺). Son olarak, CD3^-CD19^-hücreler NK hücreleri işaretçisi CD56 kullanarak ölçmek için çizilen (FACS panel 2, şekil 1 d). Her kapı hücre sayısı sayısal ve bütün canlı hücreler (Tablo 3) bu hücre türü yüzdesini hesaplamak için kullanılabilir.

Tüm ortalama hesaplama sağlayan her konu grubu içinde örneğin özel bir bağışıklık hücreye, Yani, pro-inflamatuar CD11b bolluk görüntüleme yağsız ya da obez erkek konular için canlı hücreler yüzdesi hesaplanabilir⁺ CD11c⁺ makrofaj visseral AT içinde (Şekil 2).

Şekil 1. Strateji visseral yağ dokusunun çoğunluğuna FACS. (A) FACS arsa ileri dağılım genişliği yoğunluğu (FSC-G) ve (FSC-A) tarafından bir FACS komplo takip sadece tek hücreleri (kırmızı) seçmek için bir kapı içeren ileri dağılım alan yoğunluğu ile tüm olayların (siyah) dayalı FSC-A ve yan dağılım alan yoğunluğu üzerinde (SSC-A) canlı hücreleri (açık yeşil) seçerek bir kapı içeren. Sonraki SSC-A ile arsa ve CD45 floresan yoğunluğu içeren tüm CD45 seçerek bir kapı⁺ (bağışıklık) hücreleri (mavi). (B) FACS CD19, CD3, CD66b ve CD56 floresan yoğunluğu CD11b floresan yoğunluğu ve CD19, CD3, CD66b ve CD56 negatif tüm hücreleri seçmek için bir kapısı (kahverengi) daha fazla nüfus lige karşı bir komplo. Sonraki komplo CD11b ve CD11c floresan yoğunluğu dayalı olarak daha fazla alt bölümü. Gates CD11b içeren görüntülenir⁺ CD11c⁺ makrofajlar (koyu yeşil), CD11b⁺ CD11c^- makrofajlar (mor) ve CD11b^{düşük /-} CD11c⁺ dendritik hücreler (mavi). (C) CD11b tutarı⁺, CD11c⁺, veya CD11b^{düşük /-} CD11c⁺ CD303 ve CD141 ve ortalama karşılık gelen miktar için floresan yoğunluğu (x ekseni) düzeylerinin görüntüleme hücreleri (y ekseni) Floresan yoğunluğu (MFI). Önceki CD45 görüntüleme (D) FACS arsa⁺ için her iki CD3 T-hücreleri (macenta), B-hücreleri (koyu yeşil) ve sigara autofluorescent hücreleri (yeşil) negatif seçme gates içeren CD3 ve CD19 floresan yoğunluğu dayalı nüfus (mavi) ve CD19. Aşağıdaki çizim CD4 ve CD8 Floresans CD4 seçme gates ile dayanır⁺ (açık yeşil) ve CD8⁺ (macenta) T-hücreleri. Aynı bir perdeleme strateji deri altı yağ dokusu için kullanılır. Aynı bir perdeleme strateji deri altı yağ dokusu için kullanılır. Bu rakam Wouters vd değiştirildi ¹⁶ Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2. Obez KDV içeren daha fazla pro-inflamatuar makrofajlar. CD11b miktarı⁺ CD11c⁺ makrofajlar tüm canlı hücreler yalın ve obez erkeklerin KDV yüzdesi olarak sundu. Tüm veri anlamına gelir ± SEM vardır; n = 20 için yalın ve n = 31 için obez. p ≤ 0,01 yalın vs. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Hedef	Tanım hedef	Mevcut	Fluorochrome	Miktar	Klon
CD11B	myeloid integrin marker	granülosit, monosit/makrofajlar, dendritik hücrelerdüşük ve doğal katil hücreler	BV421	2.5 ΜL	ICRF44
CD19	ortak B hücresi antijen	Blastoid B hücre ve plazma B hücre için pro-B hücre b hücre gelişimi	FITC	3 ΜL	HIB19
CD3	ortak T hücre antijen	T lenfositler, doğal katil T hücreleri ve timositleri	FITC	3 ΜL	UCHT1
CD66B	carcinoembryonic antijen (CEA) üyesi-glikoprotein ailesi gibi	granülosit	FITC	5 ΜL	G10F5
CD56	ağır glikozile yapışma protein	doğal katil hücreler ve doğal katil T hücreleri	FITC	5 ΜL	B159
CD303	tip II transmembran glikoprotein	plazmasitoid dendritik hücreler	PE	1 ΜL	201
CD141	thrombomodulin	monosit/makrofajlardüşük, dendritik hücre subpopulation	APC	1 ΜL	M80
CD11C	transmembran glikoprotein yazın; integrin αx	monosit/makrofajlar, dendritik hücreler, granülosit, doğal katil hücreler, B ve T hücre alt grubunu	APC-Cy7	0.5 ΜL	Bu15
CD45	ortak lökosit antijen	lenfosit, monosit, granülosit, eozinofil ve timositleri dahil olmak üzere tüm insan lökosit	PE-Cy7	1 ΜL	HI30
FACS arabellek	-	-	-	7.5 µl	-

Tablo 1. Antikor için kokteyl FACS panel alt kümeleri makrofaj ve dendritik hücreler örneğin alınma olasılığını belirlemek için 1. Bir örnek analiz için açıklanan antikor miktarıdır.

Hedef	Tanım hedef	Mevcut	Fluorochrome	Miktar	Klon
CD19	ortak B hücresi antijen	Blastoid B hücre ve plazma B hücre için pro-B hücre b hücre gelişimi	BV421	1 ΜL	HIB19
CD3	ortak T hücre antijen	T lenfositler, doğal katil T hücreleri ve timositleri	V500	3 ΜL	UCHT1
CD56	ağır glikozile yapışma protein	doğal katil hücreler ve doğal katil T hücreleri	APC	5 ΜL	HCD56
CD4	Ig süper, tip ı transmembran glikoprotein	T yardımcı hücresi, timositleri, monosit/makrofajlar, tip II doğal katil T hücreleri	PerCP-Cy5.5	1 ΜL	RPA-T4
CD8	Α-alt disülfür bağlı bimolecular kompleks	sitotoksik T hücreleri, timositleri, doğal katil hücre alt grubunu	APC-H7	2 ΜL	SK1
CD45	ortak lökosit antijen	lenfosit, monosit, granülosit, eozinofil ve timositleri dahil olmak üzere tüm insan lökosit	PE-Cy7	1 ΜL	HI30
FACS arabellek	-	-	-	10 µl	-

Tablo 2. Antikor için kokteyl FACS paneli 2T ve B hücre popülasyonlarının tanımlamak için. Bir örnek analiz için açıklanan antikor miktarıdır.

Makrofaj paneli
Geçidi adı	# Hücreleri	% canlı
Tek hücre	183054
canlı	10477	100
CD45	4100	39.13
döküm-	771	7,36
CD11C- CD11B+	430	4.1
CD11C+ CD11B+	104	0,99
CD11C+ CD11Bdüşük /-	15	0,14
T-hücre, B-hücresi, NK hücre paneli
Geçidi adı	#Cells	% canlı
Tek hücre	34616
Canlı	3728	100
CD45+	1589	42.62
NK hücreleri	29	0.78
CD3+	953	25,56
CD4+	40'lı	16.12
CD8+	328	8.8
CD19+	20	0.54

Tablo 3. Farklı hücre tipleri KDV bağışıklık Hücre bolluğu. Her kapı hücre sayısı ve farklı hücre tipleri yüzdesi dayalı canlı hücreler toplam miktarı.

Tartışmalar

Bu yöntemler KDV SVF yalıtmak anlatan ve oturdu ve bu dokularda bağışıklık hücreleri göreli miktarda ölçmek. Ayrıca, belirli hücre tipleri üzerinde işaretleri ifade belirleme yöntemleri devlet.

Akış Sitometresi doku bağışıklık hücrelerinin fenotip dokuların immünolojik devlet için güçlü bir tekniktir. Doku bağışıklık hücreleri miktar birçok uygulamaları olabilir. Sonuçlar açıklandığı gibi belirli bağışıklık hücreleri (örn, vs obez yalın) hasta grupları arasında varlığı karşılaştırmak mümkündür. Buna ek olarak, aynı zamanda Akış Sitometresi aynı hastaların kan gerçekleştirerek, dolaşan hücre ve doku hücreleri arasındaki ilişkileri araştırılması. Bu uygulama ile biz monosit dolaşan belirli bir alt pro-inflamatuar CD11C ile ilişkili olduğunu belirlemek mümkün⁺ yağ doku makrofajlar¹⁶.

Çok sayıda mevcut floresan antikor Akış Sitometresi çok yönlü yapmak gibi ayarlamalar açıklanan protokol uygulamaları genişleyecektir. Farklı antikorlar ile neredeyse tüm hücre tiplerinin ayırt edilebilir ve birçok işaretleri ifade tespit edilebilir. Ayrıca işaretleri intracellularly floresan antikor hücre içi bağlantısına izin için hücre zarının permeabilizing tarafından leke mümkündür. Bu özellikleri ötesinde aşırı Basitleştirilmiş M1 ve M2 makrofaj alt türlerinden çok farklı makrofaj nüfusun ayrım sağlar. Yüzey marker ifade ölçümü yanı sıra, intracellularly bilgi makrofaj işlevselliği sağlayan proteinler (Yani, sitokinler) Boyanabilen. Ayrıca, nükleer silahların yayılmasına karşı işaretleri Ki67 gibi nükleer silahların yayılmasına karşı oranları ölçmek için kullanılır. Açıklandığı gibi makrofajlar ve DCs arasında ayrım DC işaretlerinin MFI düzeylerine göre. CD68 gibi bir genel makrofaj marker makrofaj Masası (FACS panel 1) dahil edilebilir. Ancak, CD68 tercih değildir ve protokol uzanacak hücre membran intracellularly gerektiren permeabilization lekeli gerekir. Diğer makrofaj işaretleri CD163 ve CD206 veya CD11c, ikincisi burada sunulan makrofaj panelinde varlık bütünleşmek gibi alt işaretleri vardır.

Bizim FACS paneller, canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için bir işaretleyici dahil değildi çünkü o ölü hücreleri daha doğru bir dışlama FSC ve SSC kullanımı daha bırakmak hangi tercih olacaktır. Sık kullanılan DNA canlılığı boyalar propidium iyodür (PI) veya 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) yanı sıra ücretsiz Amin boya canlı/ölü Fixable ölü hücre leke kiti gibi farklı boya renk seçenekleri olan tepki boyama. Ancak, PI ve DAPI ne zaman hücreleri fixing kullanılamaz. İletişim kuralında açıklandığı gibi canlı/ölü Fixable kırmızı ölü hücre canlılığı boyama her iki panelleri strateji çoğunluğuna genel FACS etkilemeden entegre edilebilir.

Buna ek olarak, verileri canlı hücreleri tüm veri göreli anlamına gelir yüzdesi olarak ifade edilir. Yalnızca bir tam girerek, Akış Sitometresi hücre sayısı bilinen her hücre tipi tam numaraları belirlemek mümkün. Hücreleri yaklaşık bir sayısını SVF kesir hücrelerde sonra sayım sayım odası kullanarak hesaplanan. Ancak, bu sayı SVF ayırmak için kullanılan biyopsi doku miktarı için ayarlanacak olurdu, ama bu, obez için yalın karşılaştırırken sınırlamaları vardır. Onlar lipidler ile doldurulur ve büyük ölçüde genişlettik obez AT benzer bir kitle daha az adiposit oluşur. Bu bir küçümseme veya adipocyte, gram başına bağışıklık hücrelerinin sayı olarak gösterilmesini sağlar Eğer bağışıklık hücre sayının neden olabilir.

İnsan çalışmalarda hastaların eklenmesi genellikle büyük önem deneysel prosedürler standardizasyon yapmak zaman uzun bir süre içinde yapılır. Akış Sitometresi veri hastalar arasında karşılaştırma için birkaç seçenek vardır. Bu protokol için açıklandığı gibi hücreleri ölçüm analiz çeşitli örneklerinin aynı gün izin önce düzeltilebilir. Bu da onları boyama, boyama yordamı tüm örnekleri arasında eşit olarak sağlar ancak hücre canlılığı etkilenebilir önce SVF dondurarak elde edilebilir. Son olarak, Ayrıca bu çalışmada istihdam, tazminat düzeyleri yüklemek için floresan boncuk vardır ve sitometresi izleme boncuk iki haftada sitometresi günlük ölçümleri standartlaştırmak için kullanılmıştır. Bu son seçenek en verimli olur ne zaman uzun bir zaman aralığını kapsayan bir çalışma örnekleri ölçme.

Akış Sitometresi için kısıtlayıcı bir faktör genel Floresans kullanımıdır. Aynı anda tespit edilebilir floresan etiket sayısını emisyon spectra birbiri üzerine çakışması nedeniyle sınırlıdır. Ancak, akıllı FACS paneli geliştirme ve çeşitli antikor kokteyller KDV veya uydu örnek başına kullanımı ile bu sorun bu protokol için açıklandığı gibi üstesinden gelebilir. Önemli bir FACS paneli geliştirme FMO denetimleri yönüdür. Panelin bir dışında tüm antikorları kullanarak, FMO tam paneli ile karşılaştırırken potansiyel autofluorescence düzeyleri takdir edilebilir. Bu doğru nüfus çoğunluğuna izin verir ve yeni bir FACS panel ayarlarken bu yordamları yapılmalıdır. Buna ek olarak, yeni nesiller FACS cihazların en fazla 50 parametreleri aynı anda birçok özellikleri tespiti hücre başına izin algılayabilir. Hücreleri, özellikle makrofajlar autofluorescence floresan yönü ile ilgili başka bir sorun var. FACS lazer hücrelerle (özellikle ile 488 nm dalga boyu uyarma) uyarma sonra bu hücreleri floresan bir sinyal yayarlar (esas olarak < 640 nm) örtüşme antikor emisyon spectra ile etiketleri bu otelde^17,18. Bunun için hesabınıza, günahı hücreleri her kanaldaki autofluorescence belirlemek için ölçülmelidir. Bu bilgiyle, fluorochromes autofluorescent sinyal aşan bir sinyal gücü görüntüleyen seçilmesi gerekir. Bu autofluorescent arka plan sinyal nüfusun gating stratejisi belirlerken dikkate alınmalıdır. Bu nedenle, bu protokolü ve akıllı FACS panel tasarım uygulama tarafından derinlik fenotip makrofaj alt içinde mümkündür. Yeni farklı AT makrofajlar ve işlevlerine ile karakterizedir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Hettich Rotanta 460R	5660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12	Gibco ThermoFisher	31330-095
Collagenase XI from Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C7657-1g
Collagenase I from Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C0130-1g
DNAse I from bovine pancreas	Sigma Aldrich	DN25
NH4Cl	Merck	1.01145.0500
Bovine Serum Albumine	Sigma Aldrich	A4503-100
NaN3	Merck	1.06688.0100
200 µM syringe Filcons	BD Biosciences	340613
70 µM filter	Greiner Bio-one	542070
Fc block / human IgG	Sigma Aldrich	14506
Formaldehyde	Merck	1.04003.2500
CD11b-BV421	Biolegend	301324
CD19-Fitc	BD Biosciences	555412
CD3-Fitc	BD Biosciences	561807
CD66b-Fitc	BD Biosciences	555724
CD56-Fitc	BD Biosciences	562794
CD11c-APC-Cy7	Biolegend	337218
CD45-PE-Cy7	BD Biosciences	557748
CD19-BV421	Biolegend	302234
CD3-V500	BD Biosciences	561416
CD56-APC	Biolegend	318310
CD4-PerCP-Cy5.5	Biolegend	300528
CD8-APC-H7	BD Biosciences	641400
CD303-PE	Biolegend	354204
CD141-APC	Biolegend	344106
FACS-Canto II	BD Biosciences
96 v-shape well plate	Greiner Bio-one	651101
PBS PH 7.4	Gibco ThermoFisher	10010023
FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube	Corning	352052
IgG from human serum	Sigma Aldrich	I4506
Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD Biosciences	552844
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD Biosciences	552843
LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L23102
IKA MS 3 basic shaker	Sigma Aldrich	Z645028-1EA