JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Polimer omurga ve bu nedenle, hücre microenvironment tam ayar için izin olarak Rekombinant protein mühendislik hydrogels 3D hücre kültürü için avantajlı olan. Burada, rekombinant elastin benzeri protein arıtma süreci ve kendi uygulamasında 3D hidrojel hücre kapsülleme açıklanmaktadır.

Özet

İki boyutlu (2D) doku kültürü teknikleri temel hücre biyoloji anlayışımız için gerekli olmuştur. Ancak, geleneksel 2B doku kültürü sistemleri olmaması önemli bir sonuçlanan bir üç boyutlu (3D) matris kesin-den sonuçlanmak arada toplanan vitro ve içinde vivo. Bu sınırlamaya yönelik olarak, araştırmacılar-si mühendislik in vivo hücre microenvironment Biyokimya ve biyofizik özelliklerini taklit edebilirsiniz 3D hidrojel doku kültürü platformlar. Bu araştırma gerek 3D hücre saklama ve aşağı akım biyokimyasal testleri destek malzeme platformlar geliştirmek için motive vardır. Rekombinant protein mühendisliği protein sıra ayrıntılı denetim için izin vererek ve bu nedenle, dolayısıyla, sonuç potansiyel mekanik ve biyokimyasal özelliklerinin 3D hidrojel malzemesi tasarım ve geliştirme için benzersiz bir araç seti sunar matris. Burada, bağımsız olarak ayarlanabilir mekanik özellikleri ve hücre yapışkanlı ligand konsantrasyonu ile form hydrogels için kullanılan recombinantly türetilmiş elastin benzeri protein (ELP), bir ifade için bir iletişim kuralı mevcut. Daha fazla hücre kapsülleme ELP hydrogels içinde için bir metodoloji sunmak ve sonraki immünfloresan boyama, hücreleri aşağı akım Analizi ve miktar için gömülü.

Giriş

Son yüzyıl içinde iki boyutlu (2D) doku kültürü temel hücre biyolojisi vitroçalışmak için ayrılmaz bir araç haline geldi. Ayrıca, 2D hücre kültürü için nispeten ucuz ve basit protokoller kabulünün için birçok biyolojik ve tıbbi disiplinler arasında açmıştır. Bununla birlikte, araştırmaları bu toplanan vivo içindegelen belirgin sapma, değerli zaman ayrılır ve fon klinik olarak odaklı araştırma1,2içinboşa olduğunu geleneksel 2D platform sonuçlara yol açabilir göstermektedir, 3. Bu tutarsızlık en uygun yayılması ve çeşitli hücre tiplerinin olgunlaşma için gerekli olabilir 2D yüzeylerde kültürlü hücrelere sağlanan yerel Biyokimya ve biyofizik cues eksikliği ilişkilendirilebilir ki biz ve diğerleri öngörmekteyiz.

Bu sınırlamalar ve yardım Köprüsü 2D arasındaki boşluğu gidermek için Gelişmiş üç boyutlu (3D) hidrojel platformlar için hücre-kapsülleme1,4,5 vitro ve in vivo çalışmalar, araştırmacılar var ,6. Hydrogels doku gibi mekanik özellikleri ve besinlerin hızlı ulaşım sağlar su şişmiş yapısı nedeniyle hücre dışı matriks (ECM) vivo endojen microenvironment özetlemek için ideal maddeler olduğunu ve sinyal7,8faktörler. Ayrıca, 3D hydrogels iskele mekanik ve biyokimyasal özelliklerinin üzerinde bağımsız denetim sağlamak için tasarlanabilir. Matris mekaniği9,10,11,12 ve hücre yapışkanlı ligandlar13,14,15 hücre etkilemek için iyi bilinen davranış vitro ve içinde vivo. Böylece, ayarlanabilir özellikleri ile 3D hydrogels hücreler ve onların microenvironment arasındaki nedensel ilişkiyi incelemek için bir platform sunuyoruz. Bir ideal 3D hidrojel matris için ölçüt basit, Sigara sitotoksik hücre kapsülleme yanı sıra fizyolojik ilgili mekanik özelliği bağımsız ayar ve taklit eder yerel hücre yapışkanlı motifler içerir.

Her iki sentetik (Örn., Polietilen glikol, polylactic asit, poli (Glikolik asit)) ve doğal olarak elde edilen (e.g., aljinat, kollajen, Matrigel) hydrogels var avantajları 2D vitro kültür platformlarına; Ancak, aynı zamanda onların uygulanabilirliği sınırı önemli eksiklikleri var. İlk, birçok sentetik ve doğal olarak elde edilen platformlar memeli hücrelere potansiyel olarak toksik olabilir sert crosslinking koşullar gerektirir, önde gelen azalma hücre canlılığı7. Ayrıca, birçok sentetik platformlar yerli bioactivity eksikliği ve artan maliyetini ve karmaşıklığını16ekleyebilirsiniz ikincil kimyasal reaksiyonlar ile functionalized gerekir. Son olarak, doğal olarak elde edilen malzemeler genellikle iç biyo-aktif etki alanları içerir iken, onlar sık sık yüksek toplu iş toplu iş değişkenlik tarafından boğulmuş ve genellikle nispeten zayıf jelleri7,17şekillendirme için sınırlıdır.

Protein sıra üzerinde açık denetime izin vererek Rekombinant protein mühendislik malzemeleri tasarımı için benzersiz bir araç seti sunar ve uzatma tarafından son hidrojel potansiyel mekanik ve biyokimyasal özelliklerinin18İskele yapısı. Ayrıca, Escherichia coli (e.coliproteinler ifade etmek için) iyi bilinen biyolojik makine yararlanarak, malzemeler düşük maliyetle ve tutarlı bir şekilde sınırlı Inter - ve içi-toplu değişkenliği ile üretilmektedir. Burada sunulan elastin benzeri protein (ELP) üç mühendislik etki alanı vardır: (1) bir T7 ve His6 etiket etiketleme yoluyla fluorescently antikorlar öğesini için izin veren, elastik mekanik özellikleri confers ve kimyasal için izin veren (2) bir 'elastin-gibi' bölgesi Crosslinking ve (3) hücre yapışkanlı motifler için kodlar 'biyo-aktif' bölge.

Elastin benzeri bölgemizde nerede dört 'xaa' amino asit siteleri isoleucine (Ile), ama olabilir herhangi bir amino asit prolin hariç olacak şekilde kurallı (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)5 elastin sırasını temel alır. Bu sıra rekombinant ELPs19,20Bisiklete binme termal üzerinden basit arıtma sonrası ifade için istismar alt kritik çözüm sıcaklık (LCST) davranışı ile endows. Bu LCST özelliği termal olarak toplamak için farklı sıcaklıklarda Konuk 'Xaa' kalıntı21,22değiştirerek ayarlanabilir.

Burada, bir beş elastin benzeri tekrarlar 'Xaa' konumuna hidrojel crosslinking için kullanılmaktadır Amin sunulması (Lys) lizin amino asit ile değiştirilmiştir. Önceki çalışmalarımız sitotoksik sigara ve sağlam crosslinking Amin-reaktif crosslinker tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium klorür (THPC)23ile reaksiyonu ile göstermiştir. Değişen toplam protein içeriği ve crosslinker konsantrasyon tarafından bir fizyolojik ilgili sertlik aralığı (~0.5-50 kPa)9,23,24span için ayarlanan hydrogels üretmek edebiliyoruz. Mekanik özellikleri ayarlama ek olarak, hücre adezyon hidrojel içinde ELP protein omurga içinde kurallı hücre yapışkanlı etki alanlarının entegrasyonu kaynaklanır. Örneğin, genişletilmiş fibronektin kaynaklı 'RGDS' amino asit dizisi birleşme hücre adezyon ve şifreli, süre konformasyon esneklik sağlar bağlayıcı 'RDGS' değişken hücre-matris yapışması24kısıtlar. Hücre-Yapıştırıcı Yapıştırıcı proteinler hem de toplam protein konsantrasyonu oranını modüle tarafından biz etkili ligand konsantrasyonu geniş bir yayılma hydrogels üretmek edebiliyoruz. Sonuçta, bir hidrojel platform bağımsız olarak çeşitli hücre tiplerinin en iyi 3D kültür için ayarlanan bilgisini iletmiyor biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri ile geliştirdik.

Matris sertlik ve yapışkanlı ligand ayar ek olarak, rekombinant hydrogels hücre yayılan, yayılması ve 3D içerik4 içinde geçiş için gerekli olan tasarım belirli malzeme bozulması profilleri, yeteneği teklif , 9. bu bozulma özellikle genişletilmiş 'RGDS'9 veya elastin benzeri sıra25hedef proteaz hücre salgılanmasını tarafından tanınan. ELP hydrogels hücre canlılığı ve işlev immunocytochemistry yanı sıra DNA/RNA/protein ayıklama nicel reverse için de dahil olmak üzere eğitim için gerekli olan sonraki biyokimyasal testleri desteklemek için de gösterilmiş olan Transkripsiyon-polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) ve Western blot9. ELP türevleri de vivo içinde modeller bir dizi kullandık ve bağışıklık sistemi26tarafından iyi tolere bilinmektedir.

Hücre-kapsülleme çalışmaları için malzeme bir platform çok çeşitli yararları genellikle Biyokimya ve biyofizik ayar aynı derecede eksikliği sentetik veya doğal olarak elde edilen malzeme platformları için karşılaştırıldığında sahiptir olarak birlikte, ELP alınan ve tekrarlanabilirlik. Ayrıca, ELP'ın basit ve sitotoksik sigara kullanımı ile çok çeşitli hücre tiplerinin (Örn., piliç dorsal kök gangliyon14,24, fare nöral progenitör hücre9, insan mezenkimal kök hücrelerin27, sığır Yenidoğan kondrosit28, insan endotel hücreleri29,30) 2D hücre kültürü için karşılaştırıldığında endojen 3D ECM daha fizyolojik ilgili bir model sağlar. Burada, biz recombinantly türetilmiş bir ifade için bir iletişim kuralı mevcut, kapsülleme ELPs tunable hidrojel platformu olarak kullanmak için 3D hücre. Biz daha fazla metodoloji ve kapsüllenmiş hücre confocal mikroskobu aşağı akışı floresan etiketleme için mevcut.

Protokol

1. ELP ifade iletişim kuralı

  1. 1. gün: başlangıç kolonisi büyüyor
    1. Ampisilin ve kloramfenikol ağar kaplamalar ısıyla Luria 25 gr et suyu ve agar Ultrasaf Su 1 litre başına 15 g hazırlayın. Çözüm ~ 60 ° C'ye soğuduktan sonra 1 mL (100 mg/mL Ultrasaf Su) ampisilin stokunun ve kloramfenikol hisse senedi (% 70 etanol içinde 34 mg/mL) 1 mL 1 L 100 µg/mL ve 34 µg/mL son konsantrasyonları için agar çözümü ekleyin , sırasıyla. 10 cm Petri yemekler serolojik pipet ile 20 mL nihai çözüm aktarmak ve agar kuvvetlendirmek izin verir. Parafilm ve mağaza 4 ° C'de Petri yemekler şal
      Not: Petri yemekler 4 ° C'de iki haftaya kadar saklanabilir.
    2. BL21 küçük bir örnek çizgi (DE3) pLysS E. coli önceden yapılmış bir bakteriyel stoktan bir ampisilin ve kloramfenikol agar plaka üzerinde ilgi ELP kodlama pET15b vektör içeren.
      Not: Ampisilin ve kloramfenikol vektörler, pET15b ve pLysS sırasıyla içeren bakteriler için seçin.
    3. Çizgili plaka baş aşağı bir kuluçka 37 ° C'de yer. Bakteri kolonileri gecede büyümeye izin.
      Not: 16 h daha uzun süre plakaları ampisilin düşer ve ampisilin direnç olarak yerine kolonileri oluşabilir kuluçkaya değil.
  2. 2. gün: Starter kültür ve ifade medya hazırlanması
    1. E. coli kültür kuluçka makinesi kaldırın. Parafilm plaka ve mağaza için en fazla 4 gün 4 ° C'de
    2. Starter kültür şişesi (250 mL) ve ifade kültür şişeler (12 x 1 L) ve basınçlı kap hazırlamak. 1 L ifade medya için müthiş suyu 47,6 g ve 4 mL gliserol 1 L bir 2 L şaşkın kültür şişesi ultrasaf su ekleyin ve alüminyum folyo ile kap.
      Not: 60-100 mg/L protein ifade medya tipik verimleri vardır.
    3. Önceden ısıtılmış, 37 ° C sallayarak kuluçka makinesi autoclaved starter yüklemek ve ajitasyon kuluçkaya.
    4. Steril filtre (0,22 µm filtre) ampisilin stok (Ultrasaf Su 100 mg/mL) 250 µL starter kültür 100 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Hemen 250 devirde starter kültür Tantanacı başlar.
      Not: Kloramfenikol sadece koloni seçimi agar plakaları için kullanılan ve sıvı kültürleri için dahil değildir.
    5. Çizgili tabaktan bir tek ELP plazmid içeren E. coli kolonisi ekleyerek starter kültürü aşılamak ve 16 h için 37 ° C'de titremeye starter kültür sağlar.
    6. Şişeler içine ısındı, 37 ° C İnkübatörler sallayarak önceden ifade kültür ortamı yerleştirin ve şişeler ertesi sabah aşılamak hazır durumda gecede ajitasyon kuluçkaya.
  3. 3. gün: E. coli ifadede protein Inducing
    1. Temiz, steril filtre ampisilin stok (Ultrasaf Su 100 mg/mL) olun. Ampisilin stokunun 1 mL her şişesi 100 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ifade medya ekleyin.
    2. 250 d/d de ifade medya Tantanacı başlar.
    3. Medya 2 mL örneğini herhangi bir ifade şişeyi alın ve bir küvet için bir optik yoğunluk 600 okuma için boş bir eklemek nm (OD600).
    4. 16 h starter kültür kuluçka tamamlanmasından sonra her ifade şişesi 20 mL starter kültür her ifade şişesi ile serolojik pipet aktararak aşılamak.
    5. 1 h ajitasyon tamamlanmasından sonra bir ifade şişeler OD600 ölçmek. Bu adımı OD600 farklı bir şişesi her zaman kontrol her 20 dk ölçmek.
    6. Bir OD600 0,6 olarak, ifade şişeler ile 32 ° c içeren shakers sıcaklığını azaltmak
    7. OD600 her 10 min denetleyin. Bir OD600 0,8, 1 mL 1 m, steril filtre β-izopropil thiogalactoside (IPTG) her ifade şişesi için Ultrasaf Su ekleyerek ifade ikna etmek.
    8. 7 h için ifade etmek E. coli ifade şişeler içinde izin.
    9. ifade sonu önce 20 dk önceden serin büyük kat santrifüj ile 4 ° c
    10. Tüm 12 L ifade medya bireysel santrifüj kapsayıcılar ve denge toplamak.
    11. Santrifüj kapasitesi de ifade Medya > 12.000 x g zemin santrifüj kullanarak 4 ° C'de 15 dakika.
    12. Kapalı süpernatant her santrifüj konteyner üzerinden dökün. Bir spatula kullanarak, hücre topakları önceden ağırlığını zip kilit torba toplamak.
    13. Pelet on tampon (25 g Pelet başına arabellek 100 mL) steril filtre yeniden askıya alma ve Pelet masaj tarafından herhangi bir aşırı hava kabarcıkları kaldırın. On tampon 1 litre 5.8 g sodyum klorür, 1.21 g tris temel ve ethylenediamine tetraacetic asit (EDTA) disodyum tuzu dihydrate 0,37 gr 900 mL ultrasaf su ekleyin. 8,0 pH ayarlama ve 1 M'ye getirin Bu adımda, pH şeritler yeterlidir.
    14. İkincil bir konteyner içine yeniden askıya alınan hücre Pelet içeren zip kilit çanta yere ve gece-80 ° C'de dondurmak.
  4. Gün 4-6: bakteriyel hücre duvarı donma-çözülme çevrimleri ile rüptür
    1. Donmuş Pelet dondurucudan kaldırmak ve yavaş yavaş bir orbital çalkalayıcı kullanarak nazik ajitasyon ile 4 ° C'de erimek izin.
    2. Bazı sıvı mevcut olana çözülme Pelet izin. Ekle ~ 30-40 mg deoksiribonükleaz ben (DNaz) için lysate çözdürülen. Ayrıca, 100 mM phenylmethylsulphonyl Flor (PMSF; bir proteaz inhibitörü) 1 mL isopropanol hücre lysate 100 mL başına ekleyin. Lysate gecede sarsmaya izin.
      Not: DNaz ve PMSF ekleme yalnızca ilk donma-çözülme döngüsü için gereklidir.
      Dikkat: PMSF Eğer inhale zehirlidir. Bir yüz maskesi PMSF toz işlerken kullanılır.
    3. Hücre lysate tamamen çözdürülen sonra lysate-80 ° C'de gecede, veya kadar tamamen donmuş dondurmak.
    4. Donma-çözülme yordamı üç devir toplam için yineleyin. Lysate 4 ° C'de son donma-çözülme sonra çözdürülen bırakın. 100 µL ham, lysate Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) analysis arıtma ve sonuç için saklayın.
    5. Sonra son tezcan, çözdürülen 1 M NaOH kullanarak 9.0 lysate pH ayarlayın. Bu adımda, pH şeritler yeterlidir. En az 1 h için 4 ° C'de kuluçkaya (gecede uygundur) bir orbital çalkalayıcı üzerinde.
  5. Gün 7-9: sıcak ve soğuk spin termal Bisiklete binme aracılığıyla ELP arıtma
    1. 4 ° c 20 dk aralıklarla önce kat santrifüj ne yapıyorsun?
    2. Aliquot ve denge çözdürülen santrifüj kaplara lysate.
    3. Örnekleri, santrifüj kapasitesi > 15.000 x g 4 ° C'de 1 h için 100 µL süpernatant SDS-sayfa analizi için arıtma tamamlanmasından sonra saklamak.
      Not: centrifuging sonra ELP protein süpernatant onun yüksek suda onun LCST altındaki sıcaklıklarda nedeniyle içinde kalmalıdır (< 32 ° C).
    4. Süpernatant yeni santrifüj kaplarına aktarın ve uygun şekilde dengelemek.
    5. Sodyum klorür (NaCl) 1 M (için süpernatant her 100 mL NaCl 5,84 g) son bir konsantrasyon üç ayrı bölümde ekleyin. NaCl için yeterli dağılmasına izin vermek için üç bölümde eklenir emin olun.
    6. Titreyen bir kuluçka 250 rpm'de 37 ° C'de 3 h için tahrik.
    7. ajitasyon, sonundan önce 1 saat önceden sıcak bir yere santrifüj ile 37 ° c
    8. Santrifüj kapasitesi > 37 ° C'de 1 h için 15.000 x g Arıtma tamamlanmasından sonra 100 µL süpernatant SDS-sayfa analizi için depolamak ve kalan süpernatant atın.
      Not: centrifuging sonra ELP protein, düşük suda onun LCST üzerindeki sıcaklıklarda nedeniyle pelleted (> 32 ° C).
    9. Pelet pelet 1 g autoclaved, Ultrasaf Su 10 mL ekleyerek yeniden askıya alma. Protein dağılmasına yardımcı olmak için Pelet püre için metal bir spatula kullanın.
    10. Çözdürülen 1 M NaOH kullanarak 9.0 lysate pH ayarlayın. Bu adımda, pH şeritler yeterlidir.
    11. Gecede bir orbital çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de kışkırtmak.
    12. Toplam üç devir için sıcak ve soğuk spin termal Bisiklete binme yordamı yineleyin (i.e., üç toplam devir için adımları 1.5.1 1.5.11 aracılığıyla yineleyin).
  6. Gün 10-15: ELP diyaliz ve lyophilization
    1. Önceden soğutulmuş bir santrifüj yeniden askıya alınmış Pelet santrifüj kapasitesi > 15.000 x g 4 ° C'de 1 h için 100 µL süpernatant SDS-sayfa analizi için arıtma tamamlanmasından sonra saklamak.
    2. Protein çözüm kalan süpernatant 3,5 kDa diyaliz zarda 4 L 4 ° C'de önceden soğutulmuş Ultrasaf Su karşı dialyzing tarafından desalt Diyaliz su günde 6 kere 3 gün olmak üzere toplam iki kez değiştirin.
      Not: 5 ve 30 mL arasında tipik süpernatant birimleri vardır.
    3. Önceden Soğutmalı Santrifüj diyaliz çözümde santrifüj kapasitesi > 15.000 x g 4 ° C'de 1 h için Süpernatant arıtma sonundaki SDS-sayfa analizi için 100 µL saklayın.
    4. Çıkan süpernatant önceden ağırlığını konik tüpler-80 ° C'de dondurmak.
    5. Donmuş çözüm 3 gün ve kütle protein verim belirlemek için nihai ürün için lyophilize.
    6. Parafilm son içeren tüpler ELP ürün ve mağaza liyofilize 4 ° C'de
    7. SDS-protein saflığı sayfayı çalıştırın.
      Not: SDS-sayfa protokollerde belirli özel jel koşullara göre değişir. Bizim deneyler için son liyofilize protein konsantrasyonu 0.5 mg/mL deiyonize su içinde çözünmüş ve 140 V denaturing koşullar altında (w/v) % 12'si akrilamid jel 70-100 dk için çalıştırın.

2. hücre katma 3D Elastin benzeri Protein Hydrogels

  1. Silikon kalıp hazırlama
    1. Bir biyopsi yumruk ile istenilen çap delik bir 0,5 mm kalın silikon sayfası oluşturur ve her deliğin çevresinde bir kare kesip için kullanın. Kalıplar istenilen sayıda için yineleyin.
      Not: Çap ve kalıpları kalınlığı hücre kültür koşul ve belirli bir uygulama için ayarlanabilir. Pratik, hücre kültürlerinde 50 106 hücre/mL, 4 mm ve 5 mm çapları 0,5 mm kalınlığında kalıpları are salık vermek yeterli DNA/RNA ve protein çıkarma, anılan sıraya göre. İmmunostaining için 2 mm biyopsi yumruk yerine üç çoğaltır iyi boyanabilen üç bitişik delik başına kare kalıp oluşturmak için kullanılabilir.
    2. Bireysel kalıp her tarafında plastik wrap cımbızla kaldırın.
      Not: kirlenme gelecekteki plazma verimliliği bağ düşürebilir maruz silikon yüzeyi ile temas önlemek.
    3. Cımbız kullanarak, aynı sayıda çıplak Silikon kalıplar ve cam coverslips (No. 1, 12 mm çapında) 48-şey plaka ters kapağındaki satır dönüşümlü olarak düzenleyin. Bir kez tam, kirlenmesini önlemek için 48-şey plaka kapak kapak.
    4. Oksijen Plazma tedavi tüm 48-şey plaka kapak (i.e., kalıpları ve cam slaytlar). Hemen sonra forseps bitişik cam coverslip üzerine silikon kalıp ters çevirmek için kullanın. Bağ sağlamak için kalıp bastırın. 1s için oda sıcaklığında kuluçkaya kalıpları izin.
      Not: Oksijen plazma tedavi süresi kullanılan araç bağlı olarak değişir. Bizim araç için tipik koşullar bir çalışma gaz basınç pencerede 0,3-4 arasında bulunmaktadır mbar, oksijen gaz akışı 20 cm3/min ve plazma için 10-20 s maruz örnek.
    5. Kalıpları tarafından ısıyla sterilize. Oda sıcaklığında kalıpları kullanmak kadar steril bir ortamda saklamak.
      Not: Kalıpları bu aşamada süresiz olarak saklanır.
  2. Elastin benzeri protein hisse senedi çözüm hazırlanması
    1. ELP liyofilize 4 ° C depolama biriminden çıkarın. Sıcak tüp buğu yok emin olmak için açmadan önce oda sıcaklığına protein protein üzerinde tekrar tekrar kullanımı üzerinde oluşturur.
    2. Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) sabit ajitasyon ile 4 ° C'de ELP dağıtılması (i.e., iplik) bir gecede.
      Not: ELP hisse senedi çözüm konsantrasyonu daha fazla Kullanıcı tanımlı hacimsel oranı crosslinker çözüm ilavesi ile seyreltilmiş. Örneğin, bir % 3 (w/v) son ELP konsantrasyon için 4:1 bir hacimsel oranı ELP çözüm: crosslinker çözüm seyreltilmiş hisse senedi çözüm ELP %3,75 (w/v) hazırlayın. Konsantrasyon istenen uygulama için gerektiği şekilde ayarlayın.
    3. Steril ELP hisse senedi çözüm 0,22 µm şırınga filtre kullanarak filtre. ELP buz kullanılmadığı zaman saklamak.
  3. Biyogüvenlik kabini, bir 24-iyi doku kültürü plakasına steril Cımbız kullanarak steril kalıpları aktarın.
  4. THPC hisse senedi çözüm hazırlanması
    1. THPC kullanmak için sadece önceden DPBS içinde sulandırmak. THPC çözüm son ELP konsantrasyon ve istenen crosslinking oranı göre konsantrasyon ayarlayın.
      Not: iletişim kuralı için bir final ELP konsantrasyonu % 3 (w/v) ELP hisse senedi çözüm THPC çözüm 4:1 oranında hacimsel ile karıştırılarak yapılır. Gerektiği gibi ayarlayın.
    2. THPC çözüm (suda % 80) 2.6 µL DPBS 997.4 µL için ekleyin.
      Not: Bu konsantrasyon THPC 1:1 stokiometrik oran hidroksi metil gruplarının THPC tarih ve ELP protein üzerinde birincil aminler açıklanan 4:1 hacimsel oranı için son %3 (w/v) ELP hidrojel Solutions'da karıştırma zaman karşılık gelir. THPC çözüm viskoz ve çözüm damlacıkları pipet ucu tarafına yapışabilir. Doğru konsantrasyonları için DPBS sulandrarak böyle damlacıkları kaçının. THPC hisse senedi kapsayıcı fosfamin oksidasyonunu ve crosslinker inactivation önlemek için azot gazı ile tasfiye.
    3. Girdap çözüm mix ve buz üzerinde tutmak için.
    4. Steril filtre THPC stok 0,22 µm şırınga filtre kullanarak çözüm. THPC hisse senedi çözümle daha fazla alt stokiometrik crosslinking oranları elde etmek için steril DPBS seyreltik (Örn., 0.5:1 veya 0.75:1).
      Not: THPC oksijen duyarlı ve seyreltik çözüm hazırlık sonraki birkaç saat içinde kullanılmalıdır.
  5. Hücreleri tek hücre süspansiyon içine tripsin-EDTA ile kuluçka tarafından ayırmak, hücreleri cips ve bir hemasitometre kullanarak ortamda yeniden askıya hücreleri saymak.
    Not: Bu adım için tam iletişim kuralları ağır istenen hücre tipi ve uygulama üzerinde bağlıdır. Bu iletişim kuralı kullanılan nöral progenitör hücre için % 0,025 tripsin-EDTA kuluçka 1,5 dakika oda sıcaklığında yapılmıştır. Hücreleri 200 x g 2 min için de pelleted. Artan hücre canlılık için hücreleri normal Orta koşullarda askıya. 1-50 106 hücre/mL son hidrojel birim hücre kapsülleme aralığından için kullanılan tipik hücre yoğunluğu. Gerektiği gibi ayarlayın.
  6. Aliquot steril 1,5 mL santrifüj tüpü hücrelere istediğiniz sayıda.
  7. Dikkatle Senaryo Özeti ~ 200 x g 3 dakika süreyle santrifüj kapasitesi, süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet buz üzerinde tutun.
    Not: Tamamen ELP ve THPC crosslinker daha fazla seyreltme azaltmak için tüm süpernatant Aspire için önemlidir. Belirli aralıklarla hızları ile hücre tipi değişir.
  8. Öyle ki son hacim (ELP çözüm: THPC çözüm 4:1 oranında varsayarak) % 80'i birimdir hücre Pelet ELP hisse senedi çözümde yeniden askıya alma. Mix 20 - 25 kez pipet hücreleri ve ELP homojen karışımı üretmek için.
    Not: sıcaklık artışı ve sonraki aşama geçiş ELP azaltmak için tüp alt sürükleyici kaçının. Her 2 mm kalıp üç çoğaltır ile son hacim 7.5 µL gerektirir (i.e., 6 µL ELP hisse senedi çözüm ve THPC hisse senedi çözüm 1.5 µL) eşit 3 delik bölünmüş (i.e., 2.5 µL son hacim delik başına). 4 ve 5 mm kalıpları için son hacmi 7,5 µL ve 15.5 µL sırasıyla gereklidir.
  9. THPC hisse senedi çözüm hücre/ELP süspansiyon kalan % 20 son hacim için ekleyin. Mix 20 - 25 kez pipet homojen bir karışım üretmek için.
  10. Hemen karşılık gelen son birim hücre/ELP/THPC karışımı bir dairesel hareket tarafından her kalıba pipette. Tüm kalıpları için yineleyin.
  11. Örnekleri, oda sıcaklığında 15 dk, 15 dk 37 ° C'de ek bir kuluçka takip için kuluçkaya.
    Not: İlk kuluçka dönemi bu sıcaklığı yukarıda ELP'ın LCST artan ve onun termal faz ayrımı inducing önce ilk hidrojel polietilenin kolaylaştırmak yardımcı olacaktır.
  12. Yavaş yavaş sıcak hücre kültür ortamının 750 µL jelleri engellemeden kaçınarak 24-şey plaka her şey için ekleyin.
  13. 37 ° C'de hydrogels için 7 gün kuluçkaya.
    Not: 1-2 günde hücre türüne bağlı olarak önerilen değişiklikleri orta tam. Jel üzerinde stres sınırlamak için Pasteur pipet yapıştırılmış bir cam ile 200 µL pipet ucu orta kuyudan alıyorum kullanın.

3. Immunocytochemistry 3D ELP Hydrogels hücrelerinin

  1. Fiksasyon çözüm 10 mL % 16 (w/v) paraformaldehyde (PFA) 30 ml DPBS karıştırarak hazırlayın. Çözüm ile 37 ° c sıcak
  2. 24-şey plaka ortamından Aspire edin ve yavaşça DPBS 1 mL ile yıkayın.
  3. Her şey için 750 µL fiksasyon çözüm ekleyin ve 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Doku kültürü kuluçka PFA buharı ile diğer kültürlerin kirlenmesini önlemek için kullanmayın.
  4. Dikkatle her şey için bir uygun tehlikeli atık konteyner PFA atarak, fiksasyon çözümden Aspire edin.
    Dikkat: PFA maruz deri ve göz tahrişine neden olabilir. Eldiven/koruyucu gözlük giymek ve kimyasal duman mahallede çalışma.
  5. 1 mL DPBS her örnek için ekleyin. Hemen DPBS Aspire edin ve İngiltere'de yılın atık konteyner içine atın.
  6. Örnekleri DPBS 1 mL 10 dakika ile iki kez yıkayın.
    Not: Örnekleri DPBS içinde 4 ° C'de için Parafilm ile plaka mühürleme sonra bir haftaya kadar saklanabilir.
  7. Her örnek permeabilization çözüm (DPBS 100 mL ve Triton X-100; 0.25 mL 750 µL ile permeabilize PBST) üzerinde bir rocker 15 dönüş/dak, oda sıcaklığında 1 h için.
  8. PBST Aspire edin ve her örnek için çözüm (PBS 95 mL, 5 gram Sığır serum albumin (BSA), 5 mL serum ve Triton X-100 0.5 mL) engelleme 750 µL ekleyin. Bir rocker 15 dönüş/dak, üzerinde 3 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    Not: Serum içinde ikincil antikorlar yükseltilmiş ana tür engelleme çözüm bulunması gerekir (Örn., keçi, eşek) ve bir 0,22 ile steril filtre µm filtre kullanımdan önce.
  9. Antikor seyreltme çözüm (97 mL DPBS, BSA 2.5 g, 2.5 mL serum (Kimden adım 3.8 olduğu gibi aynı ana tür) ve Triton X-100 0.5 mL) hazırlayın. Antikor seyreltme çözüm kullanarak birincil antikor sulandırmak ve her örnek için 500 µL çözüm ekleyin. Parafilm ile plaka mühür ve bir gecede bir rocker üzerinde 4 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Testin ve Sox2 birincil antikor antikor seyreltme çözümden üreticilerin orijinal konsantrasyon içinde seyreltilmiş 1: 400.
  10. Her örnek antikor çözümden Aspire edin ve 15 dönüş/dak, bir rocker üzerinde oda sıcaklığında PBST örnekleriyle 60 dakika yıkayın. Yıkama adım 3 kez tekrarlayın.
  11. İkincil antikorlar ve 5 mg/mL stok DAPI (1:2, 000) antikor seyreltme çözüm kullanarak sulandırmak ve her örnek için 500 µL çözüm ekleyin. Alüminyum folyo ile 24-şey plaka kapak ve bir gecede bir rocker üzerinde 4 ° C'de kuluçkaya.
    Not: ikincil antikorlar ışığa duyarlı olduğundan, örnekleri üzerinden photobleaching tüm sonraki adımlar için korunması gerekir. Keçi Anti-fare ve keçi Anti-tavşan ikincil antikor antikor seyreltme çözümden üreticilerin orijinal konsantrasyon içinde seyreltilmiş 1:500 vardı.
  12. Her örnek antikor çözümden Aspire edin ve rocker üzerinde oda sıcaklığında PBST ile örnekleri 30 dakika yıkayın. Yıkama adım 3 kez tekrarlayın.
  13. Bir damla hard-set montaj orta bir cam slayt yüzeyine yerleştirin. Forseps kullanarak, aşırı çözüm hafifçe bir kağıt havlu üzerinde kalıp kenarına Blot tarafından kalıptan çıkarın. Dikkatle kalıp montaj Orta baş aşağı üzerine yerleştirin ve kabarcıklar tanıtan kaçının.
  14. Montaj Orta oda sıcaklığında 48 h için sertleşmesine izin. Mağaza oda sıcaklığında veya 4 ° c, örnekleri Montaj orta tam 48 h için kırılma indisi orta sertleştirme boyunca değişeceği gibi görüntüleme önce ayarlamak izin verir. Mühür ile cam kapak örnekleri slayt oje kirlenme veya örnek hareketi azaltmak için temizleyin.
  15. Confocal mikroskop kullanarak örnekleri görüntü.

Sonuçlar

Bu protokol için kullanılan ELPs beş bölgelerinde oluşmaktadır: T7 etiketi, His6 etiketi, enterokinase (EK) bölünme sitesi, biyo-aktif bölge ve elastin benzeri bölge (Şekil 1). T7 ve His6 Etiketler standart Western blot teknikleri ile kolay tanımlanması için izin verir. EK bölünme sitenin giriş gerekirse etiket bölge enzimatik kaldırılması için izin verir. Biyo-aktif bölge genişletilmiş, fibronektin türetilmiş hücre-yapıştırıc?...

Tartışmalar

Rekombinant protein ifade ve arıtma ile yüksek tekrarlanabilirlik Biyomalzeme sentezlemek için güçlü bir araç var. Ticari moleküler klonlama advent büyük ölçüde nedeniyle, özel rekombinant plazmid birkaç terdarikçilerin ELPs gibi malzemeler ile çalışmak için zaman önemli ölçüde küçültür satın alınabilir. Benzer şekilde, plazmid doğrudan kaynak laboratuvardan ne zaman orijinal çalışma bir federal anlaşma tarafından desteklenen ve gelecekteki iş kar amacı gütmeyen kullanım için ola...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar T. Palmer teşekkür ve H. Şekil 4 fare NPCs. vektör sanat sağlamak için Babu (Stanford Nöroşirürji) kullanılmış ve sunucusu tıbbi Sanat altında Creative Commons Attribution 3,0 dağıtıma açıktır Lisansı (https://creativecommons.org/ uyarlanmıştır licenses/by/3.0/legalcode). Bu eser parçası, Stanford Nano paylaşılan özellikleri (Ödülü ECCS-1542152 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen SNSF), gerçekleştirildi. Üssü destek üzerinden ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri (32 GM 008412) olarak kabul eder. C.M.M. bir NIH NRSA desteğinden önceden Doktora Bursu (F31 EB020502) ve Siebel akademisyenler Program kabul eder. S.C.H. Ulusal Sağlık Enstitüleri (U19 AI116484 ve R21 EB018407), Ulusal Bilim Vakfı (DMR 1508006) ve California Institute desteği rejeneratif tıp (RT3-07948) kabul eder. Bu araştırma Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı ve insan geliştirme (NICHD), Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen İttifak'ın rejeneratif rehabilitasyon araştırma ve eğitim (AR3T), fon aldı Nörolojik bozukluklar ve kontur (NINDS) ve Ulusal Enstitüsü Biyomedikal görüntüleme ve Biyomühendislik (NIBIB) Ulusal Ödülü numarası P2CHD086843 altında Sağlık Enstitüleri. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri görüşlerini temsil etmiyor.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Elastin-Like Protein Expression and Purification
10 cm Petri DishesThermo Fisher ScientificFB0875713
70% EthanolRICCA Chemical2546.70-1
Ammonium SulfateSigma-AldrichA3920-500G
AmpicillinThermo Fisher ScientificBP1760-25G
Bacto AgarThermo Fisher Scientific9002-18-0 
BL21(DE3)pLysS Competent CellsInvitrogenC606003
ChloramphenicolAmresco0230-100G 
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-AldrichDN25
EDTA disodium salt, dihydrateThermo Fisher ScientificO2793-500
GlycerolThermo Fisher ScientificBP229-4
IsopropanolThermo Fisher ScientificA451-4
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fisher ScientificBP1755-10G
Luria BrothEMD Millipore1.10285.5007
ParafilmVWR52858-000
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)MP Biomedicals195381
Sodium ChlorideThermo Fisher ScientificBP358-212
Sodium HydroxideSigma-AldrichS 8045-1KG
Syringe Filter Unit (0.22 μm)MilliporeSLGP033RB
Terrific BrothMillipore71754-4
Tris BaseThermo Fisher ScientificBP152-1
Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels
0.22 μm syringe filtersMilliporeSLGV004SL
0.5 mm thick silicone sheetElectron Microscopy Science70338-05
24-well tissue culture plates Corning353047
Disposable Biopsy Punch (2 mm)Integra Miltex33-31
Disposable Biopsy Punch (4 mm)Integra Miltex33-34
Disposable Biopsy Punch (5 mm)Integra Miltex33-35
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) Corning21-031-CM
No. 1 12 mm glass coverslipsThermo Fisher Scientific12-545-80
Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC)Sigma-Aldrich404861-100ML
0.5% Tryspin/EDTAThermo Fisher 15400054
Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels
16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences15701
Bovine Serum Albumin (BSA)Roche3116956001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Molecular ProbesD1306 
Donkey SerumLampire Biological Labs7332100
Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488)Molecular ProbesA-11017
Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546)Molecular ProbesA-11071
Goat SerumGibco16210-072
Mouse Nestin Primary AntibodyBD Pharmingen556309
Mouse Sox2 Primary AntibodyCell Signaling Technology23064S
Nail PolishElectron Microscopy Sciences72180
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Vectashield Hardset Mounting Medium Vector LabsH-1400 

Referanslar

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  3. Gómez-Lechón, M. J., et al. Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix. Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  5. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  6. Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays. Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
  7. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  8. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  9. Madl, C. M., et al. Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling. Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).
  10. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  11. Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells. PLoS ONE. 7 (5), e37178 (2012).
  12. Ehrbar, M., et al. Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling. Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).
  13. Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).
  14. Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth. Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).
  15. Kilian, K. A., Mrksich, M. Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface. Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).
  16. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).
  17. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  18. DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering. Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).
  19. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  20. Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues. Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).
  21. McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels. Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).
  22. McMillan, R. A., Conticello, V. P. Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor. Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).
  23. Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).
  24. Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth. Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).
  25. Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles. Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).
  26. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).
  27. Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels. Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).
  28. Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration. Biomaterials. , 132-140 (2017).
  29. Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation. Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).
  30. Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides. Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).
  31. Straley, K. S., Heilshorn, S. C. Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering. Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).
  32. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  33. Graumann, K., Premstaller, A. Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems. Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).
  34. Tashiro, K., et al. A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendisliksorunu 135Elastin benzeri proteinELPhidrojel3D h cre k lt rimmunostainingprotein ifadeRekombinant protein

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır