Tek hücreli Nefelometri mRNA ve yüzey Protein Simian virüs, immün yetmezlik enfekte CD4 ifadede+ T hücreleri izole Rhesus makak üzerinden

Özet

Açıklanan 96 genlerin ifade quantitate için bir metodoloji olduğunu ve 18 yüzey proteinler tarafından tek hücreleri ex vivodifferentially tanımlanması için izin, genler ve proteinler kandan hücrelere göre virüs enfeksiyonlu hücrelerdeki dile getirdi. Yaklaşım⁺ T çalışma SIV-enfekte CD4 için uyguladığımız rhesus makak izole hücreler.

Özet

Tek hücre Analizi hücre türdeş olmayan nüfus dissekan için önemli bir araçtır. Kimlik ve yalıtım nadir hücre-ebilmek var olmak zor. Bu zorluğu aşmak için bir metodoloji birleştirerek akış sitometresi dizine ve yüksek üretilen iş çoğaltılmış nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) geliştirilmiştir. Amaç tanımlamak ve maymun immün yetmezlik virüsü (SIV) karakterize oldu-enfekte hücreleri rhesus makak içinde mevcut. Nefelometri floresans aktif hücre (FACS) sıralama tarafından yüzey protein ve mRNA qPCR tarafından virüs bulaşan hücreleri çok boyutlu bir profil oluşturmak için ana bilgisayar gen ve protein ölçümleri ile kombine viral gen ekspresyonu tanımlanır . Biz yaklaşım, hedeflenen tek hücreli proteolitik-transkripsiyon değerlendirme veya tSCEPTRE vadeli. Yöntemi gerçekleştirmek için hücrelerin floresan antikor ile belirli bir hücre alt ve/veya aşağı akım fenotipik analiz FACS yalıtımı için kullanılan yüzey işaretleri lekeli. Tek hücreleri hemen lizis, multiplex ters Transkripsiyon (RT), PCR öncesi amplifikasyon ve yüksek işlem hacmi qPCR 96 tutanaklar, ardından sıralanır. FACS ölçümleri sıralama sırasında kaydedilir ve daha sonra gen ifadesi verileri bir kombine protein ve transkripsiyon profil oluşturmak için iyi konuma göre bağlı. SIV-enfekte çalışmaya doğrudan ex vivohücre, hücre birden çok viral RNA türler qPCR tespiti tarafından tespit edilmiştir. Viral transkript kombinasyonu ve miktar her sağlamak bir çerçeve içine viral ömrünün (Örneğin, karşı verimli verimli) farklı aşamalarında hücreleri sınıflandırma. Ayrıca, SIV⁺ hücre tSCEPTRE göre hastalık bulaşmamış tek hücreleri differentially ifade ana bilgisayar genler ve proteinler değerlendirmek için aynı örnek izole edildi. Analiz daha önce hesaba katılmayan viral RNA ifade heterojenite yanı sıra vivo SIV-aracılı çoğu gen düzenlemesi tek hücreli çözünürlük ile enfekte hücreleri arasında ortaya koydu. TSCEPTRE yöntemi herhangi bir hücre popülasyon yüzey protein marker(s), ana bilgisayar veya patojen gene(s) veya bunların kombinasyonları ifade tarafından kimliği için mükellef analizi için uygundur.

Giriş

Çok sayıda hücre içi patojenlerin çoğaltmak için konak hücre makine kez konak hücre biyolojisi değiştirme veya ana hücrelerinin yayılma şanslarını en üst düzeye çıkarmak için çok özel altgrupları hedefleme güveniyor. Sonuç olarak, hücre biyolojik süreçlerin yaygın olarak, ana bilgisayarın genel sağlık için zararlı sonuçları ile kesintiye. Virüsler ve içinde çoğalıyorlar konak hücreleri arasındaki etkileşimler anlama bulaşmayı önlemek amacıyla gelişmiş tedaviler ve stratejileri geliştirmede yardımcı olabilir hastalığı mekanizmaları aydınlatmak. Ana bilgisayar-patojen etkileşimleri çalışma sağlayan doğrudan analitik araçlar bu amaçla doğru gereklidir. Tek hücreli analiz tek belirsizliğe yer bırakmadan bir hücresel fenotip özniteliği bir belirli genotip ya da enfeksiyon durumu¹için bulunmasını sağlar. Örneğin, patojenik enfeksiyonları sık konak hücreleri doğrudan ve dolaylı değişimler neden. Bu nedenle, ayrım bulaşmamış karşılıklarından enfekte hücreleri doğrudan enfeksiyon veya ikincil etkileri, öznitelik ana hücre değişiklikleri için gerekli gibi Genelleştirilmiş iltihabı. Ayrıca, SIV ve insan immün yetmezlik virüsler (HIV), gibi birçok patojenler için konak hücre enfeksiyon birden çok aşamalardan gibi gelirleri erken, geç, ya da gizli, her biri farklı gen ve protein ifade profilleri² tarafından karakterize edilebilir ^{, 3 , 4 , 5}. hücre karışımları toplu analizleri bu heterojenlik⁶yakalamak başarısız olur. Aksine, son derece multiplexed tek hücreli analizleri viral her iki ifade ölçmek mümkün ve ana bilgisayar genler enfeksiyon etap üzerinden türevleriyle birlikte enfeksiyon özgü hücresel tedirginlikler gidermek için bir yol sunar. Ayrıca, ana bilgisayar-patojen etkileşimlerde fizyolojik açıdan analiz ilgili ayarları virüslü canlılar arasında meydana gelen olayları tanımlaması için kritik. Böylece, ex vivo çoğu doğrudan olasılığı en iyi yakalama vivo içinde uygulanacak yöntemleri işler.

SIV ve HIV hedef CD4⁺ T hücreleri, ana bilgisayar antiviral "kısıtlama" faktörler ve tümleyici antijen sunan molekül immün gözetim^{7,8, önlemek ve üretken enfeksiyon kurmak için hangi onlar karşı koymak 9,10,11}. Tedavi olmadan, enfeksiyon sonuçları büyük CD4 kaybına⁺ T hücreleri, sonuçta sonuçlanan kazanılmış bağışıklık yetmezliği sendromu (AIDS)¹². Antiretroviral tedavi ayarında gizlice enfekte hücre rezervuarlar iyileştirici stratejiler için zorlu bir engel poz yıllardır devam ediyor. Vivo HIV/SIV-enfekte hücre özellikleri'ni anlama ana bilgisayar ökaryotlar arasındaki farklılıklar patogenez ve sebat enstrümantal ortaya çıkarmak için potansiyele sahiptir. Ancak, bu son derece, öncelikle enfekte hücreleri low frequency ve onları kolayca tespit edebilmek reaktifler eksikliği nedeniyle zor oldu. Viral RNA, uyarlamak hücreleri 0,01-1'de bulunması için tahmin edilmektedir CD4%⁺ T hücreleri kan ve lenf dokusu^13,14,15. Süpresif tedavi altında gizlice enfekte hücreleri 10^-3–10^{-7 16,17,18}, daha az sıktır. Viral protein boyama deneyleri içinde vitro enfeksiyonlar, tür hücre içi Gag, eğitim için iyi iş 0,01 – 0.1 arka plan boyama nedeniyle suboptimal %, benzer veya daha fazla enfekte hücreleri^{13, frekans 14}. Yüzey boyama için iyi karakterize SIV/HIV Env özgü monoklonal antikorları kullanarak Env protein de büyük olasılıkla benzer nedenlerden dolayı zor olabilir kanıtlanmıştır. Son zamanlarda, Gag tarafından ifade hücre algılama geliştirmek için yeni araçlar amaç birleşmeyle deneyleri belirli gag RNA veya alternatif görüntüleme teknolojileri^14,15,19. Ancak, bu tür yaklaşımlar sınırlı kalır nicel ölçümler sayısı içinde gerçekleştirilen her cep telefonundan.

Burada, biz (1) 18'e kadar yüzey proteinleri ve 96 genlerin ifadesi her bulaştırmak için ex vivo duyarlı ve spesifik viral gen nicel qPCR ve (2) tarafından quantifies doğrudan tek virüs bulaşan hücreleri tanımlayan yöntembilim tanımlamak (ve virüs bulaşmamış) hücre. Tek hücre yüzey proteini ölçüm hemen hücre lizis tarafından takip FACS tarafından Bu metodoloji birleştirir ve gen ifade analizi ile hedeflenen qPCR Biomark sistemdeki multiplexed. Entegre sıvı devre (IFC) teknoloji 96 örneklerinden 96 genlerin çoğaltılmış Nefelometri aynı anda, 9,216 odaları tek tek qPCR reaksiyonlar gerçekleştirildiği bir matris tarafından başarılı izin verir. Analiz için tüm transcriptome koruyarak hemen gerçekleştirilen iken canlı hücre FACS sıralama yüksek içerikli protein bereket ölçümleri kaydeder aşağı akım. Virüs bulaşan hücreleri tanımlamak için alternatif olarak spliced ve unspliced viral RNA'ların (vRNA) ilişkin deneyleri özel dahildir 96 genler, şu anda içinde ağırladı deneyleri sayısının Toplam Kullanıcı tanımlı deneyleri bir panel ile birlikte qPCR Analizi IFC. Gen ekspresyonu ve protein her hücre için toplanan bilgilerin iyi konuma göre bağlantılıdır. Biz daha önce başka bir yerde bu analiz sonuçları²⁰bildirdi. Burada, daha ayrıntılı metodolojik yönergeleri yanı sıra daha da açıklayıcı fenotipleme SIV-enfekte CD4 sağlamak⁺ T hücreleri.

TSCEPTRE dönem, bu yaklaşım herhangi bir geçerli hücre popülasyon fluorescently etiketli antikorlar ve transcriptome temin qPCR deneyleri ile uyumlu ifade için reaktif süspansiyonlar uygulanabilir. Örneğin, farklı gen ve protein ifadede nadir hücreleri veya hücre yüzey proteini işaretleri tarafından kolayca ayırt karakterize için kullanılabilir. Numune hazırlama bir standart iletişim kuralı'nı piyasada bulunan antikor boyama dayanır. Cytometers tek hücreli sıralama yeteneği ile de ticari olarak kullanılabilir, ancak ek Biyogüvenlik önlemleri bulaşıcı canlı hücreleri işlemek için gereklidir. Tek - hücre protein ifade profil burada başvurulan her hücre iyi konuma göre kayıt sıralama, dizine gibi piyasada bulunan FACS yazılım sıralama ortak bir özelliği var. Sayısal Analiz differentially ifade ana bilgisayar genlerin hücre popülasyonlarının ilgi arasında burada açıklanmayan ancak başvurular için daha önce yayımlanmış yöntemleri sağlanmıştır.

Protokol

Not: Protokolü iş akışı şeması Şekil 1' de gösterilen. Üç temel adımdan oluşur: FACS, RT ve cDNA öncesi amplifikasyon ve qPCR 96 genler için aynı anda. Hücreleri dilutions sınırlama ve tek hücre, sıralama sıralama iletişim kuralı, iki sürümü daha ayrıntılı olarak adım 5 ve adım 6, sırasıyla açıklanmıştır. Bu stratejileri farklı araştırma soruları adresi ama benzer yordamları izleyin.

1. ön koşul veya önceki analizleri

1. Yukarıda açıklanan⁶kullanılmak üzere tüm gen ifade deneyleri doğrulayın.
   Not: Bu adım de deney tarihi öncesinde yapılıyor. Tüm deneyleri doğrulamak, ticari ve özel, tek hücreli düzeyine kadar ilgili RNA'ın verimli ve doğrusal amplifikasyon emin olmak için gerekli. Birçok ticari olarak kullanılabilir ve özel deneyleri bu özellikleri karşılamak için başarısız. İşleme ve otomatik eğri uydurma ifade deneyleri 96 genlerinin eşzamanlı yeterlilik için Ek kodlama dosyaları 1 – 5içinde sağlanır, ancak bireysel deneyleri R² ve doğrusal Sığdır yamaç kullanarak nitelikli. Temsilcisi başarılı ve başarısız olan tahlil niteliği araziler Şekil 2' de gösterilmiştir.
2. Bir akış sitometrik panel hücre yüzey işaretleyicileri ilgi leke antikorların geliştirmek.
   1. Antikorlar ilgili bir örnek örneğin, al yanaklı periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs), boyama ile her antikor titre. Başlamak ile antikor başına 100 µL testinde 20 µL tepki boyama ve sekiz iki kat seri dilutions oluşturun. En fazla yoğunluk süre paraca desteklemek belgili tanımlık negatif ve pozitif nüfus arasında net bir ayrım boyama sergileyen en iyi konsantrasyon tanımlayın.
   2. 1.2.1. adımda belirlenen en yüksek konsantrasyonu, tüm antikorlar karışımı kullanarak ek hücre sample(s) üzerinde kombine boyama değerlendirin. Boyama için bireysel antikor lekeleri gözlemlenen benzer olduğundan emin olun. Boyama ne zaman herhangi bir antikor yalıtım modunda kullanılan görülmektedir az ise, böyle antikorlar yerine alternatif fluorochrome conjugates göz önünde bulundurun.

2. gen ifade tahlil hazırlık

1. Birleştirme 96 gen ekspresyonu deneyleri bir RNase/DNaz-Alerjik 1-15 mL tüp (boyut sıralama plaka numarası ile farklı olabilir). Bu çalışmada kullanılan deneyleri paneli Tablo 1 ve Tablo 2belirtilir. Elde edilen malzeme "Tahlil Mix" adlandırılır. Her tahlil 180 son bir konsantrasyon için eklemek ileriye ve geriye doğru astar nM. DNA süspansiyon tahlil Mix uygun seyreltme ulaşmak için arabellek ekleyin.
   Not: pratik amaçlar için özel tahlil (Kullanıcı tarafından oluşturulan) hisse senetleri 18 µM piyasada bulunan "20 x" gen ifade qPCR deneyleri (Tablo reçetesi) konsantrasyon ile tutarlı olacak şekilde hazır olun. 18 µM karışımları özel ileriye ve geriye doğru astar her gen DNA süspansiyon arabellek hisse senedi çözümlerinde yapılır. Ticari olarak mevcut deneyleri (Tablo reçetesi) Ayrıca probları, bunlarla probları değildir RT veya cDNA öncesi amplifikasyon ve olabilir için gerekli böylece özel deneyleri için ihmal. Bu bir dahil etmek için tavsiye edilir veya sıralama, hücre kurtarma ve cDNA sentez verimliliğini değerlendirmek için kalite kontrol için daha fazla oda temizliği gen kullanın. CDNA oluşturmak için rasgele astar kullanımı değil belirledi ama gene özgü astar verimli olacağı tahmin edilmektedir.
2. 2 adet tahlil plaka adım 7.1 (çok katmanlı qPCR) kullanmak için hazır olun. Her içine de bir 96-şey PCR tabak belirlenmiş beklenen her 96 x 96 çip dizi için her testin 6 µL pipet. Örneğin, 5 chips için her testin 30 µL 96-şey plaka tek bir kuyuda yer alacak. 96 deneyleri kullanılıyorsa, her şey 96-şey plaka bir tahlil içerir. Plaka ile yapıştırıcı seal kilitleyin.
   Not: İdeal olarak, adımlar 2,1 ve 2,2 aynı anda birden çok donma-çözülme çevrimleri gen ifade deneyleri için önlemek için gerçekleştirilir. Tahlil plaka tüm genlerde de tahlil Mix (adım 2.1) mevcut olmalı. Tahlil mix ve tahlil plaka-20 ° C veya uzun veya kısa vadeli kullanım için 4 ° C, sırasıyla depolanabilir.

3. yüzey leke hücrelerin

Not: RNA uzlaşma gibi hücre içi boyama, permeabilization ve fiksasyon bu yöntem ile uyumlu değildir.

1. Tazminat örnekleri Malzemeler tablo hücre boyama için kullanılan daha 2.5-fold daha yüksek konsantrasyon, tazminat boncuk 40 µL için listelenen her antikor ekleyerek hazırlayın. Işıktan korunan 25 ° C'de 20 dk için kuluçkaya. Boncuk ve 500 x g , santrifüj 25 ° C'de 3 min için PBS 3 mL ekleyin PBS Aspire edin ve boncuk PBS ~ 300 µL içinde resuspend.
2. Akış sitometrik hücre sıralayıcısı için örnek işleme hazırlamak: tazminat tüpler elde etmek, tazminat matris oluşturmak ve matris için deneysel numune alma dosyalar için geçerlidir.
3. Floresan antikor kokteyl ana karışımı her antikor Malzemeler tablo, lekeli tüm örnekleri için 1,5 mL sarı tüp belirtildiği gibi uygun hacmi birleştirerek hazırlar. Girdap ve santrifüj kokteyl 21.000 x g 2 dk antikor cips için 25 ° c de toplar.
   Not: burada kullanılan antikor Malzemeler tablolistelenir.
4. 2 dk. Ekle 0,5-2 mL PBS 12 ml 15 mL Tüp, 500 x g , santrifüj 25 ° C'de 3 dk içinde hücre süspansiyon için 37 ° C su banyosu cryopreserved hücrelerde çözülme ve PBS Aspire edin. PBS ve transfer 5 mL polistren Tüp 3 ml resuspend. Yukarıdaki gibi santrifüj kapasitesi ve ~ 20 µL kalan PBS bırakarak PBS, Aspire edin.
   Not: Boyama sıcaklık için daha sıcak veya soğuk sıcaklık koşulları buna göre (bkz. Adım 1.2) boyama antikor titrasyonu değiştirerek özel uygulamalar için gerektiği gibi adapte.
5. 2 x 10⁷ antikor 80 µL hücrelerde kokteyl yıkanmış resuspend ve ışıktan korunan 25 ° C'de 20 dk için kuluçkaya. 2 x 10⁷ hücreleri, aşan örnekleri artırmak için boyama tepki birim buna göre korumak için < 2 x 10⁷ hücreler/100 µL.
6. PBS, 3 mL ekleyerek hücreleri yıkama 500 x g 3 min için de centrifuging ve süpernatant aspirating.
7. İyice 300-500 µL PBS ve filtre hücrelerinde bir 35 µm naylon hücre süzgeç kap ile pipetting tarafından resuspend. Hücreler buz tutmak ve ışıktan sıralama kadar korumalı.

4. hücre toplama plakaları, FACS sıralama gerçekleştirmek ve Generate cDNA hazırlamak

1. RT-preamp tepki Mix parçaları (Tablo 3) bir tek RNAse/DNaz-Alerjik steril tüp pipetting tarafından birleştirmek.
   Not: Bu adım önce veya 3. adımda boyama sırasında gerçekleştirilebilir. RT enzim burada qPCR sinyal DNA şablona katkısını belirlemek için atlanabilir.
2. RT-preamp tepki Mix 10 µL 96-şey PCR sıralama koleksiyon tabakları istenen dizi halinde dağıtmak için bir çok kanallı pipet kullanın. Yapıştırıcı film ile plakalarının ve tabakları önceden soğutulmuş 96-şey Alüminyum blok üzerinde yer.
3. Akış Sitometresi gating düzeni lekeli örnek yaklaşık 20.000 hücrelerden veri kazanılması by sıralama hücre kurmak. Tazminat matris için toplanan veriler geçerli emin olun. Gates çizmek ve gen ifade analizi için izole olmak cep population(s) ilgi tanımlar gating ağacı tanımlayın.
   Not: potansiyel SIV vRNA⁺ hücreler topluluğu için kullanılan gating ağacı Şekil 3' te gösterilmiştir.
4. Her kuyuya sıralanması için numarası ve hücre alt grubunu belirtmek için uygun araç ayarlarını girin. Ya sıralama için ek ayrıntılı talimat sınırlayan bir hücre seyreltme serisi veya tek hücre adım 5 ve 6, sırasıyla sağlanır.
5. FACS hazırlanan 96-şey PCR koleksiyonu kalıplara hücreleri sıralamak. Sıralama önce yapışkan mühür kaldırın ve sıralama takip taze bir mühür ile değiştirin.
   Not: Önceden soğutulmuş Alüminyum blok tabaklarda her zaman belirleyin, sıralama sırasında da dahil olmak üzere.
6. Hemen sıralama, girdap ve santrifüj sonra koleksiyon plaka 2000 x g 4 ° C'de 1 dk de
7. Thermocycle bir PCR makinesi aşağıdaki koşullar kullanarak önceden ısıtılmış bir kapak ile plaka: 50 ° C 15 dakika (RT), 95 ° C için 2 dk, ardından 95 ° C 18 döngüsü tarafından 15 s ve 60 ° C 4 dk (öncesi amplifikasyon) için.
8. DNA süspansiyon arabelleği yeni bir 96-şey PCR plaka 20 µL içine cDNA 5 μL aktararak cDNA 1:5 oranında seyreltin. Seyreltilmiş cDNA 4 ° C veya -20 ° C süresiz olarak bu noktada depolanabilir. CDNA şimdi qPCR (adım 5.2, 7,4) için bir şablon olarak kullanılmak üzere hazırdır.
   Not: Bu seyreltme RT-preamp tepki olarak mevcut astar için aşağı akım qPCR katılmazlar sağlar.

5. varyasyon A: FACS sıralama hücreleri vRNA⁺ sıklığını belirlemek için bir sınırlama seyreltme dizisine hücreleri veya deneysel kalite kontrol gerçekleştirin

Not: tek hücreli sıralama gerçekleştirmeden önce Bu çoğaltma içinde seri dilutions içine hücreleri sıralayarak ilgi, hücrelerin frekansını belirlemek için kullanım olabilir. Bu adımı da değerli kalite kontrol için sıralama verimliliği, hücre lizis, RNA kurtarma ve cDNA sentezi, 5.3 adımda anlatıldığı gibi sağlar. VRNA⁺ hücre frekans önceden belirlenmesi uygun şekilde güçlendirilmiş vRNA⁺ hücre gen ifade analizi için yeterli örnek boyutu elde etmek için sıralanması gerekir tek hücre sayısı daha doğru tahmin sağlar.

1. FACS adımları 4.1-4.2, olduğu gibi hazırlanan 96-şey tabak içine hücreleri sıralamak ve birden çok çoğaltır kuyuda başına 1-1000 hücreleri toplamak.
   Not: Her hücre seyreltme, Çoğalt kuyu sayısı genellikle ters hücre konsantrasyon iyi ücret ile ilişkilidir. Enfekte hücre frekans de %1 altında olduğunda, hücre dilutions iyi başına 100 – 1000 hücre üzerinde odaklanmalıdır. Bir örnek sıralama plaka harita Şekil 1' de, sol üst sağlanır. İyi başına 1.000 hücre aşan nedeniyle sonuçta ortaya çıkan artışlar kaçınılmalıdır tepki birim ve aşağı akım cDNA sentez ve miktar ile müdahale.
2. QPCR reaktifler Tablo 4ana mix çözümde birleştirir. 25 µL tepki birim için ana Mix 22.5 µL 2.5 µL seyreltilmiş cDNA şablonunun adım 3.9 ile birleştirilmiştir. Standart Bisiklet koşullarını kullanarak qPCR gerçekleştirmek (Örneğin, 94 ° C 5 min için 94 ° C 40 döngüsü tarafından takip 15 s ve 60 ° C için 1 dakika için).
   Not: Singleplex qPCR reaksiyonlar geleneksel gerçek zamanlı qPCR enstrüman kullanarak verimli hücre sıralama, RNA kurtarma ve cDNA sentez göstermek için bir ya da birkaç deneyleri bir ekonomik ön analiz olarak tavsiye edilir. VRNA⁺ hücre frekansını hesaplamak için de kullanılabilir. Biomark kullanarak çok katmanlı qPCR reaksiyonlar genellikle büyük ölçekli tek hücreli analizleri için daha uygundur.
3. Kalite kontrol için Et arsa değerleri (Et Ct_max − Ct =) karşı hücre sayıları göre iyi bir günlük₁₀ ölçekte başına ve doğrusal regresyon analizi uygulayın.
   Not: Tutarlı çoğaltır, doğrusal regresyon yamaç 3.3 (± 0,3) ve R² > 0,9 verimli bir deney göstergesi. En iyi ve suboptimal sıralama örnekleri, RT-preamp deneyler Şekil 4' te gösterilmiştir.
4. VRNA⁺ hücreleri sıklığını belirlemek için hücre sayıları x ekseni (günlük₁₀ ölçek) ve kısmını iyi başına göre Arsa vRNA, y ekseni üzerinde her hücre seyreltme için olumlu kuyuları. Örneğin, Şekil 1 (alt sol, Poisson dağılımı) bakın. Bir doğrusal regresyon modeli verileri bir pozitif hücre ortalama, kuyu pozitif (y ekseni üzerinde 0.632)^%2163,2 karşılık gelen liman hücreleri belirlemek için uygulanır. Bu hücre seyreltme sayı (x ekseni kesişim noktası) yüzde ifade edilen frekans dönüştürün. Örneğin, bir vRNA⁺ hücre başına 48 hücreleri % 2.1 bir frekans için eşdeğerdir.

6. varyasyon B: FACS sıralama hücreleri tek hücre analizi için

1. 4.1-4.8, adımları izleyin ve iyi konuma göre eşlenen bir hücre de akış sitometresi'nın Dizin sıralama özellik sıralanmış, her hücre için bireysel FCS dosyaları oluşturmak için kullanarak başına göre belirtin.
   Not: sıralama koleksiyon tabakları kullanılabilir thermocyclers sayısını aşıyor, ters transkriptaz inactivation adım (95 ° C için 2 dk) sonra Bisiklete binme durdurulabilir ve thermocyclers mevcuttur kadar cDNA 4 ° C'de depolanabilir. Bu durumda, 95 ° C ilk döngüsü 15 öncesi amplifikasyon başlamak s.
2. İsteğe bağlı: cDNA "havuzları arta kalan su katılmamış cDNA kullanarak ilgi nadir hücreler için ekrana gelen Kullanıcı tanımlı toplu işlemleri tek hücre cDNA oluşan" oluşturun. Su katılmamış tek hücreli önceden güçlendirilmiş cDNA 2 µL çok kanallı pipet tarafından yeni bir 96-şey plaka aktarın. CDNA belirlenen havuzundan tüm ek tek hücrelerden pipetting 2 µL tarafından aynı de yineleyin. CDNA havuzları gene(s) ilgi pozitif hücrelerinin geleneksel qPCR kullanarak içeren belirlemek için (Örneğin, vRNA) için ekran. Havuzu cDNA her hücreden, sadece küçük bir aliquot gerektirdiğinden cDNA kalan ~ 8 µL tek hücreli analizleri için bulunmaya devam eder.
   Not: Kaynak-yoğun katlı qPCR tarafından sorguya tek hücre sayısını azaltmak için bir çaba tek hücreli gen ifade analizleri gerçekleştirmeden önce havuzu oluşturma stratejileri tavsiye edilir. Hangi faiz (Örneğin, SIV mRNA +) hücrelerinin bir ön tek-plex qPCR tahlil tarafından tanımlanan durumlar için uygundur. CDNA havuzları oluşturmak üzere basit yüksek üretilen iş stratejileri bir koleksiyon sıralama tabağın (tüm 12 satır A hücreleriyani ) satırları veya sütunları (sütun 1 tüm 8 hücreleriyani ), su katılmamış cDNA 2 µL birleştirerek yeni bir tabak içinde tek bir kuyuya içerir. En iyi strateji havuzu belirlemek için adım 5.4 faiz hücrelerinin beklenen sıklığını göz önünde bulundurun. Örneğin, hücrelerin % 10'u olumlu olacağı tahmin ediliyor, altı tek hücreli cDNA örnekleri oluşan havuzları sık eksi olacak ve o havuzda temsil hücreleri böylece aşağı akım tek hücreli analizleri dışlanabilir.

7. qPCR Biomark platformda multiplex

Not: Bu bölümde sürüm A veya B yukarıda açıklanan takip edebilir. Burada açıklanan çalışmada, sadece tek hücre Analizi uygulandı.

1. Testin her iyi reaktif yükleme 4 µL içeren yeni bir 96-şey PCR tabak içine qPCR tahlil plaka her testin tahlil plaka (adım 2.2 hazır) x 2 pipetting 4 µL hazırlayın. 4 ° C'de tahlil plaka korumak
   Not: Tahlil plaka 4 ° c ilâ bir hafta ve bir ay için-20 ° C'de stabil. Böylece, birden çok patates kızartması için yeterli malzeme hazırlamak ve uygun şekilde depolamak yararlı olabilir.
2. Denetim satır sıvıları astar şırınga dan çip iki alımı valfleri dağıtmak. Koruyucu plastik plaka altından kaldırın. Çip A1 konumundaki çentikli tarafı ile bir IFC denetleyicisi yerleştirin. Ana menüden "Prime" komut dosyası seçin. Komut dosyasını çalıştırın.
3. Gerçek zamanlı tepki Mix 50 µL PCR Master Mix (Tablo reçetesi) 500 µL her mikrosıvısal çip ile reaktif yükleme örneği karıştırarak hazırlayın. 4.4 µL PCR plaka, bundan böyle "örnek plaka" belirlenmiş yeni 96-şey her kuyuya pipet.
4. 1:5 seyreltilmiş cDNA gerçek zamanlı tepki karışımı içeren örnek plaka içine adım 4,8 3,6 µL pipet.
   Not: Eğer bir PCR aşağı-seçimi gerçekleştirildi nadir (Örneğiniçin vRNA⁺) hücreleri aşağı akım analizi için 6.2. adımda anlatıldığı gibi ekran, sadece olumlu havuzlarında temsil hücreleri ekleyin.
5. Çip astar tamamlanmasını takiben, çip alıcılar dağıtım 5 µL de çip çentikli (tahlil) tarafında karşılık gelen içine tahlil plaka ve 5 µL örnek plaka de (örnek) öbür çip üzerinde karşılık gelen içine yükleyin. Çip IFC denetleyicisi olarak yerleştirin ve "mix yük" komut dosyasını çalıştırın.
6. Çip çoğaltılmış qPCR gerçekleştirmek için Biomark platformu aktarın. Araç kurulum ve gerçek zamanlı PCR analiz yazılımı tarafından sağlanan ve PCR ile 40 devir gen ifade (GE) 96.96 Standart V.1 protokolünü kullanarak adım adım talimat takip qPCR programlama ile devam edin. ChipRun dosya belirtilen bir klasöre kaydedin.
   Not: Birden fazla cips günlük ve birden fazla gün içinde çalışabilir.
7. QPCR veri analiz.
   1. Gerçek zamanlı PCR analiz yazılımı açın. "ChipRun.bml" Dosyadan Aç "dosya | Açık"menü.
   2. "Çip Explorer" ve "Çip Run Özeti" LightBox penceresinin sol üst köşesinde bulun. Chip Run Özeti üç bileşenlerini belirlemek: analiz görünümleri, örnek kurulum ve dedektör Kur.
   3. "Dedektör yapısı üzerinde"'nı tıklatın. "Görev" altında "Yeni" tıklatın ve kapsayıcı türü "SBS plaka" ve konteyner biçimi "SBS96" seçin. "Eşleştirme" yanında tıkırtı üstünde... düğmesini tıklatın ve "M96-tahlil-SBS96.dsp" seçin.
      1. İsteğe bağlı: her bulmak (tahlil) bir sayı ya da adı her şey "adı" bölümünde de^st 1 çift tıklatarak atayın. De "F2" tuşuna basarak geçmek.
   4. "Örnek yapısı üzerinde"'nı tıklatın. "Görevi altında" "Eşleştirme" yanında, tıklatın... düğmesini tıklatın ve "M96-örnek-SBS96.dsp" seçin.
   5. "Analiz görünümleri" seçeneğini tıklatın. "Temel düzeltme Lineer (türev) için", "Görev altında", "qPCR" sekmesini seçin ve "Ct eşik yöntemi Kullanıcı (dedektörleri) için". "Ct eşikleri" sekmesinde, "Başlatma" otomatik kutusunu kontrol edin. Yukarıdaki "Analiz" düğmesini tıklatın.
   6. 'Analiz görünümlerini"üst sağ çeyreği'ikinci sekmesinde"Sonuçları tablo "'ı tıklatın. Açılan menüde "Isı harita görünümü". Isı haritası verilerle görüntülenir.
      1. İsteğe bağlı: Tekdüzen ROX floresans karşıdan karşıya belgili tanımlık küçük parça sağlamak için "Görüntü görünüm" yerine "Isı harita görünümü" aynı menüden seçin. İkinci ısı haritası üzerinde doğru penceresinden "ROX" seçin. İlkinden sağdaki pencereye 1-40 döngüleri birini seçin. Dördüncü doğru penceresinden ROX floresan siyah beyaz görüntüye geçiş yapmak için tıklatın. Görüntüyü splatters, parçacıklar, bildirir veya yonga üzerinde kusurları görünür. ROX tekdüzelik fena halde gizlenmiş çip yeniden çalıştırın.
   7. Isı haritası altında "Eşik" ve "Günlük grafik"'ı tıklatın. Ct eşikler el ile her dedektör deneyleri (ısı haritası sütunlarından) tıklatıp sürükleyerek eşik amplifikasyon eğrileri veya üssel faz kesiştiği gerektiği gibi ayarlayın. İşiniz bittiğinde, "Analiz"'ı tıklatın.
8. QPCR verileri bir .csv dosyası olarak verin. Verileri bir elektronik tablo veya istatistiksel analiz yazılımı (Örneğin, JMP) içine alın ve sonuçlarına göre çip örnek ve tahlil pozisyonlar eşleyin. Hücreler viral genlerin ifade üzerinde temel alan yeni bir sütun oluşturup koşullu bir formül kullanarak gruplar halinde düzenleyin. Altında "Analiz", "Y X tarafından uygun" seçin ve grup karşı gen ekspresyonu arsa. İstatistiksel analiz için geçerli.
   Not: Temsilcisi tek hücreli nicel ifade dört SIV RNA türlerin Şekil 5Abivariate parsellerde tasvir edilir. Nicel ana bilgisayar gen ekspresyonu SIV RNA⁺ hücrelerdeki Şekil 5Biçinde gösterilir.
9. Nicel protein ifade değerleri tek hücreli FACS verileri ayıklayın.
   1. .fcs açın FACS dosyaları sıralamak için 96-şey plaka FlowJo sürüm 9 kullanarak (adım 6.1) karşılık gelen. Vurgulanan dosya adıyla seçin "platformu | Olay numarası kapı | Dizin oluşturulmuş sıralama gates oluşturmak". Tek tek hücreler satır tarafından görüntülenen görünür.
   2. Tüm 96 hücreleri (değil satır) vurgulayıp seçiniz "çalışma alanı | İhracat | «««Seçin"tüm telafi fluors. "Veri türü" altında "FCS Dosya" seçin, "Ver"'i tıklatın ve belirlenen bir klasör seçin.
   3. Yeni .fcs dosyaları tek tek hücreler için yeni bir FlowJo çalışma alanına sürükleyin. Tüm hücreleri vurgulayın, "İstatistik" ("Σ" düğmesini sol üst köşede) eklemek tıklatın "| Demek | Tüm fluor parametreleri".
   4. "Tablo Düzenleyicisi" sol üst köşede soldan dördüncü düğmesini tıklatarak açın. İlk hücrenin tüm fluores vurgulayın ve tablo Düzenleyicisi penceresine sürükleyin. Tablo Düzenleyicisi penceresinde üst "Oluşturmak ve görünüm tablosu" aynı düğmeye tıklayın. Bu 96 hücreleri ve her fluor için sayısal bir parametre bir tablo oluşturur.
   5. Çıkış bir veritabanı yazılımı (Örneğin, MS Excel, JMP), ya da kopyalama/yapıştırma veya "Uygulaması kaydetmek ve denize indirmek" tıklayarak (dördüncü tablosunun üstünde belgili tanımlık sol düğme) kopyalayın.
      Not: Bu yordam FlowJo sürüm 9 için özeldir. FlowJo yorum 10 farklı bir yordam dizini oluşturulmuş veri almak için kullanır. Dizin oluşturulmuş akış veri kopyalanan/kopyaladım içine JMP doğrudan hücre sıralayıcısı tarafından oluşturulan .csv dosyalarından da olabilir.
10. Tek hücreli FACS veri ve plaka numarasına göre qPCR veri birleştirme ve de getirin. Birleştirilmiş tek hücreli gen (qPCR) grafik ve istatistiksel analizleri gerçekleştirmek ve protein ifadesi (FACS) verileri.
    Not: Tek hücreli örnekleri qPCR kombine ve FACS veri Şekil 6 ' da gösterilen (yüzey proteini ifade profilleri SIV-enfekte, spliced vRNA⁺ rhesus makak hücreler için ev sahibi), Şekil 7 (CD4 gen ekspresyonu yüzey karşı CD4 protein ifade spliced vRNA⁺ rhesus makak hücreleri) ve daha önce²⁰yayınlandı. Hücre population(s) ilgi genlerinde differentially tanımlamak için ifade, tek hücreli analiz yöntemleri daha önce açıklanan önerilen^20,22,23,24, için hangi hesabı hücreleri bir gen için hem de sürekli gen ifade değeri pozitif oranı.

Sonuçlar

Tüm iletişim kuralı için iş akışı Şekil 1' de tasvir edilir. İki varyasyon göre hücre sayısı tarafından tanımlanan oluşur: her iki sınırlayıcı seyreltme ya da metinde açıklandığı gibi hücreleri, tek. Logosuna 2 kat seri RNA dilutions astar-sonda yeterlilik analizlere örnekleri Şekil 2' de gösterilmiştir. Potansiyel SIV⁺ hücreleri tanımlamak için gating strateji Şe...

Tartışmalar

Protokol, burada açıklanan tSCEPTRE olarak adlandırdığı, multiparameter akış sitometresi ile nicel tek hücreli mRNA ifade son derece çoğaltılmış RT-qPCR tarafından tarafından tek hücre yüzey proteini Nefelometri bütünleştirir. Bu iki teknoloji Birliği yüksek içerikli anlık görüntülerini kombine transkripsiyon ve bir yüksek-den geçerek biçimde tek hücre proteini profili sağlar. Biz SIV vivo içindeile enfekte şimdiye kadar zor hücrelerini tanımlamak için yöntemini kullanın v...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA extraction and PCR reagents and consumables
Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate	BioExpress/VWR	T-3060-1
Adhesive PCR Plate Seals	ThermoFisher	AB0558
Armadillo 384-well PCR Plate	ThermoFisher	AB2384
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems/ThermoFisher	4311971
DEPC Water	Quality Biological	351-068-101
Glass Distilled Water	Teknova	W3345
Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen/ThermoFisher	11732088
SUPERase-In Rnase Inhibitor	Invitrogen/ThermoFisher	AM2696
Platinum Taq	Invitrogen/ThermoFisher	10966034
dNTP Mix	Invitrogen/ThermoFisher	18427088
ROX Reference Dye (if separate from kit)	Invitrogen/ThermoFisher	12223012
DNA Suspension Buffer	Teknova	T0223
RNAqueous kit	Invitrogen/ThermoFisher	AM1931
TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
CD6	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs00198752_m1
TLR3	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs1551078_m1
Biomark reagents
Control Line Fluid Kit	Fluidigm	89000021
TaqMan Universal PCR Mix	Applied Biosystems/ThermoFisher	4304437
Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000736
Sample Loading Reagent	Fluidigm	85000735
Dynamic Array 96.96 (chip)	Fluidigm	BMK-M-96.96
FACS reagents
SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)	Spherotech Inc.	CMIgP-30-5H
CompBeads Anti-Mouse Ig,k	BD Biosciences	51-90-9001229
5 ml Polystyrene tube with strainer cap	FALCON	352235
Aqua Live/Dead stain	Invitrogen/ThermoFisher	L34976	dilute 1:800
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2	BD Biosciences	563916	dilute 1:40
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200	BD Biosciences	563914	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8	BD Biosciences	564804	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2	Biolegend	302948	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2	BD Biosciences	564710	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2	Biolegend	301842	dilute 1:83
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8	Biolegend	302048	dilute 1:167
Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7	Biolegend	302340	dilute 1:37
Anti-CD38-R PE clone OKT10	NHP reagent recource	N/A	dilute 1:100
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50	BD Biosciences	564364	dilute 1:10
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6	BD Biosciences	561358	dilute 1:20
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A	Biolegend	313528	dilute 1:80
Instruments
BioPrptect Containment Enclosure	Baker
BD FACS Aria	BD Biosciences
ProtoFlex Dual 96-well PCR system	Applied Biosystems/ThermoFisher	4484076
Quant Studio 6 qPCR instrument	Applied Biosystems/ThermoFisher	4485694
IFC controller HX	Fluidigm	IFC-HX
Biomark HD	Fluidigm	BMKHD-BMKHD