JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Hücre içi ROS hücresel yaşlanma indüksiyon içinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Burada, ROS düzeyleri hücresel yaşlanma sırasında miktarının için hassas bir tahlil açıklayın. Ayrıca bildirildi çeşitli yaş ile ilgili işlev bozuklukları için katkıda yaşlanma ilişkili salgı fenotip, değerlendirmek için protokolleri sağlar.

Özet

Hücresel yaşlanma geri dönüşü olmayan büyüme tutuklama üzerine proliferatif kapasitesi veya çeşitli gerilmeler maruz bitkinlik hali olarak kabul edilmiştir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda hücresel yaşlanma geliştirme, yara iyileşmesi, immün gözetim ve yaşa bağlı doku disfonksiyon da dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçleri için rol genişletmiştir. Hücre döngüsü tutuklama hücresel yaşlanma kritik damgasını olsa da, bir artan hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) üretim de hücresel yaşlanma indüksiyon içinde önemli bir rol oynamaya gösterdi. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda senescent hücreler komşu hücre ve dokuların bir yaşlanma ilişkili salgı fenotip (SASP) aracılığıyla güçlü parakrin faaliyetleri sergi ortaya koydu. Hücresel yaşlanma karşı tedavi stratejileri ile ilgili faiz keskin artış yaşlanma mekanizmaları, hücre içi ROS ve SASP de dahil olmak üzere tam bir anlayış ihtiyacını vurgular. Burada, kantitatif ROS duyarlı floresan boya ve akış sitometresi kullanarak H-Ras-indüklenen hücresel yaşlanma sırasında hücre içi ROS düzeylerini değerlendirmek için iletişim kurallarını açıklar. Buna ek olarak, biz mRNA ifade indüksiyon ve salgı SASP faktör analizi için hassas teknikleri tanıtmak. Bu protokoller çeşitli hücresel yaşlanma modelleri için uygulanabilir.

Giriş

Daha 50 yıl önce ortaya Hayflick ve Moorhead normal hücreleri geri dönüşü olmayan büyüme tutuklama proliferatif potansiyellerini tükenme hücre bölümler1belirli sayıda sonra üzerine girin. Bu olay şimdi ikileştirici yaşlanma bilinen ve güçlü organizmalar yaşlanma2ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir inanılıyor. Ne kadar telomerlerin ilerici erozyon ikileştirici yaşlanma önemli bir nedeni olarak, DNA hasarı, oncogenic harekete geçirmek ve oksidatif stres, gibi çeşitli hücresel vurguluyor başka tür bir hücresel yaşlanma ikna etmek için bildirilmiştir "erken yaşlanma" veya "stres kaynaklı yaşlanma" denir. İlginçtir, erken yaşlanma oncogenes H-Ras ve BRAF gibi etkinleştirme üzerine güçlü bir tümör baskılayıcı rol oynar. Fare modelleri ve insan doku biyolojik hücre yaşlanma ağırlıklı olarak nerede oncogenic Ras ve BRAF aktif hale gelir ama dayandığı malign kanserleri azaldı premalign lezyonlar içinde yoktu güçlü kanıtlar doğurmuştur Bu lezyonlar3,4,5. Yaşlanma ve tümör bastırma rolü, hücresel yaşlanma, yara iyileşmesi, doku onarımı, immün gözetim ve embriyonik gelişim6dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerinde bir rol oynamaya önceki çalışmalarda gösterilmiştir.

Her ne kadar büyüme tutuklama yaygın hücresel yaşlanma7damgasını okudu, kanıt önemli bir vücut o hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) da hücresel yaşlanma8' e katkıda bulunur göstermektedir. ROS düzeyleri yükseltme sırasında çeşitli tip-in hücresel yaşlanma ikileştirici yaşlanma ve onkogen kaynaklı yaşlanma (OIS), dahil olmak üzere, on yıl önce ilk olarak bildirildi9,10. Bir daha doğrudan, yaşlanma11,12H2O2 sublethal bir doz ile eksojen tedavi neden olmaktadır. SOD1 gibi ROS atma enzim inhibisyonu da erken yaşlanma13neden olur. Buna ek olarak, düşük ortam oksijen koşulları ve artan ROS atma gecikme yaşlanma10,14,15başlangıcı. Bu sonuçlar kuşkusuz ROS önemli arabulucu veya hücresel yaşlanma indüksiyon belirleyicileri olduğunu gösteriyor. Hücresel yaşlanma ve nasıl ROS düzeyleri hücresel yaşlanma sırasında yüksek indüksiyon ROS katkıda nasıl ancak, daha fazla araştırma gereken.

Son yıllarda yapılan çalışmalarda senescent hücreler komşu hücrelere ve dokulara den bir SASP16,17güçlü parakrin faaliyetleri var ortaya çıkardı. Yaşlı dokusunda senescent hücreleri SASP aracılığıyla birçok yolları özerk bir tükenmesi proliferatif hücrelerinin yanı sıra yaşa bağlı doku işlev bozuklukları ile tanıtmak. Çeşitli proinflamatuar faktörler, IL-6 gibi yaşa bağlı doku bozuklukları doku homeostazı, imha doku mimarisinin bozulma ile Il-8, TGFβ ve senescent hücreleri tarafından salgılanan matriks metalloproteinazların (MMPs), neden yaşlanma komşu hücrelerin ve steril iltihap18,19. Ancak, SASPs biyolojik bağlamda bağlı olarak yararlı etkileri olabilir. Buna ek olarak, senescent hücre türü ve daha fazla araştırma19ihtiyacını vurgulayan hücre sahne SASPs heterogenetic doğası bağlıdır.

Burada, hücre içi ROS düzeyleri OIS sırasında değerlendirmek için hızlı ve hassas sitometresi tabanlı teknikleri açıklar. Buna ek olarak, nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ve ELISA kullanarak SASP faktör analizi için yöntemler tanıtılmaktadır.

Protokol

1. inducing onkogen kaynaklı yaşlanma

  1. Bir H hazırlanıyor-RasV12 retrovirüsü
    1. 100 mm Kültür yemek oda sıcaklığında 2 mL % 0.001 poli-L-lizin/fosfat tamponlu tuz (PBS) 5 min için ekleyerek kat.
    2. Bir vakum için bağlı bir cam pipet kullanarak poli-L-lizin çözümü kaldırmak ve 2 mL 1 x PBS ekleyerek kültür bulaşık yıka.
    3. Plaka 3 x 106 ecotropic BOSC-23 ambalaj hücreleri kaplamalı kültür Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin içeren DMEM ile) çanak ve onları bir CO2 doku kültürü olarak 37 ° C'de kültür Kuluçka 1 d için.
    4. Ertesi gün, pBabe puro-H-RasV12 DNA ile birlikte retroviral ambalaj DNA (pGAG/pol 2 µg ve pVSVG 0,25 µg) 2 µg transfect üretici yönergelerine göre 8 h için transfection reaktif kullanarak.
    5. Transfection ortamını çıkarın ve 8 mL taze medya ekleyin.
    6. 48 h sonra viral parçacıkların içeren ortam toplama ve Santrifüjü 500 x g 5 min için de herhangi bir hücresel enkaz kaldırmak.
    7. H-Ras virüs içeren medya 0,45 µm şırınga filtre ile filtre.
      Not: herhangi bir donma ve virüs supernatants için verimli bir viral enfeksiyon, çözme kaçının. En iyi verimi elde etmek için enfeksiyon gibi aynı gün hasat bir virüs kullanın.
  2. H-RasV12 retrovirüsü ile WI-38 normal insan fibroblast bulaşmasını
    1. Plaka 5 x 104 WI-38 hücreleri 60 mm kültüründe % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin 1B H-RasV12 retrovirüsü hasat önce içeren DMEM ile yemek ve onları 37 ° C'de 1 günde kültür
    2. Ertesi gün büyüme orta kaldırın ve 1 mL H-RasV12 retrovirüsü medya ekleyin. Büyüme orta 2 µL polybrene hisse senedi çözüm (8 mg/mL distile su) içeren bir ek 1 mL ekleyin. Örnek 1 günde bir oksijen 37 ° C, % 5 CO2 doku kültürü kuluçka için kuluçkaya.
    3. H-RasV12 retrovirüsü karışımı 24 h daha sonra kaldırmak ve hücreleri 2 yıkama x 1 x PBS ile. Büyüme orta ekleyin ve 2 gün içinde oksijen 37 ° C, % 5 CO2 doku kültürü kuluçka için 2 µg/mL puromisindir hücrelerle tedavi.
    4. 2 d puromisindir seçim sonra büyüme orta kaldırmak ve hücreleri 2 yıkama x 1 x PBS ile. Büyüme orta ekleyin ve bir oksijen 37 ° C, belirtilen süre noktayı kadar (bir Şematik diyagramı Şekil 1A ' ya bakınız) %5 CO2 kuluçka hücrelerde kültür.

2. izleme yaşlanma yaşlanma ilişkili β-galaktozidaz yolu ile boyama

  1. Aşağıdaki hisse senedi çözümleri hazırlayın.
    1. 20 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) dimetil formamide (DMF) içinde hazırlamak. Çözüm-20 ° C'de depolayın
    2. Sitrik asit sodyum fosfat tampon 3.377 g (126 mM) Na2HPO4.7H2O çözülerek hazırlamak ve 0,708 g sitrik asit (36.8 mM) 100 mL distile su. 6.0, pH ayarlayın.
    3. 0, 5 M potasyum ferrocyanide hazırlayın. Mağaza karanlıkta 4 ° C'de çözümde
    4. 0, 5 M potasyum ferricyanide hazırlayın. Mağaza karanlıkta 4 ° C'de çözümde
      Not: Yaşlanma ilişkili β-galaktozidaz (SA β-gal) boyama çözüm pH kesin sonuçlar için önemlidir.
  2. Taze bir SA β-gal boyama çözüm 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM potasyum ferrocyanide, 5 mM potasyum ferricyanide, % 20 (v/v) sitrik asit sodyum fosfat tampon ve 1 mg/mL X-gal içeren stok çözüm sulandrarak olun.
  3. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri 1 yıkama x 1 x PBS ile. Oda sıcaklığında 5 min için % 3 formaldehit ile hücreleri tamir.
    Not: retrovirüsü ile bulaşmamış hücreleri bir negatif kontrol kullanılmalıdır. Hastalık bulaşmamış tek kontrol hücreleri Proliferasyona durumlarını korumak için pasajlı devam etmelidir.
  4. Fiksasyon çözüm hücrelerdeki kaldırmak ve 1 x PBS ile yıkayın. Taze hazırlanmış 1 x SA β-gal boyama çözüm (60 mm kültür tabağına 1,5 mL) ekleyin. Kurutma önlemek ve 37 ° C'de 24 h için kuluçkaya parafin film ile çanak mühür Alternatif olarak, bir nem odasında beraber tabakları kuluçkaya.
    Not: % 3 formaldehit içeren sabitleştirici çözüm tehlikeli atık bertaraf. CO2 olmadan bir Kuluçka kuluçka sırasında pH değişiklikleri önlemek için arzu edilir.
  5. Boyama hücreleri mikroskop altında ise ertesi gün durumunu; SA β-gal-pozitif hücreler Perinükleer bölgede mavi görünür.
    Not: SA β-gal-pozitif hücre düşük frekans Proliferasyona kontrol hücreleri gösterir. Boyama çok hafif ise, biraz daha uzun bir süre için kuluçka devam (temsilcisi örnek için bkz: Şekil 1B ).
  6. Bir SA β-gal boyama resmi bir CCD kamera 10 X ya da daha büyük objektif lens kullanarak elde. Resim boyama yüzdeyi hesaplamak için yeterli sayıda yakalamak (> 200 hücreleri).
  7. SA β-gal-lekeli hücre yüzdesi SA β-gal-pozitif hücre hücreleri toplam sayısına oranla sayısı miktarının hesaplamak.
    Not: SA β-gal boyama bağımsız olarak en az 3 x ve ortalama değerleri temel alınarak Çoğalt deneyler (Şekil 1 C) sonuçlarına hesaplanacağını yinelenmelidir. Uygun hücre yoğunluğu SA β-gal boyama deneme için önemlidir. Yüksek confluency için yaşlanma ilişkili morfoloji değişikliği ile müdahale ve kontrol hücreleri yanlış sinyal teşvik.

3. bir reaktif oksijen türleri indüksiyon H-Ras-indüklenen yaşlanma sırasında miktarının

  1. Plaka 2 x 105 WI-38 hücreleri 60 mm kültürüne çanağı ve H-Ras-indüklenen yaşlanma 1. adımda açıklandığı gibi kışkırtmak.
    Not: Bu protokol hücresel yaşlanma modelleri diğer türleri için uygulanabilir.
  2. Büyüme orta (2, 4 veya 6 gün) belirtilen zamanda noktada kaldırmak ve 1 x PBS hücrelerle yıkayın. Hücreleri 1 mL % 0.05 tripsin/EDTA çözeltisi ile tedavi bunları ayırmak ve 1 mL % 10 içeren büyüme ortamının ekleyerek tripsin devre dışı bırakabilirsiniz FBS. Hücre sayısını belirler.
  3. 1 x 105 hücreleri 15 mL konik tüp içine aktarmak ve Santrifüjü 500 x g 5 min için de tarafından hücreleri toplamak.
  4. Taze 2', Kültür (DCF-DA çalışma konsantrasyonu 50 µM) Orta için 10 mL 10 mm DCF-DA 50 µL ekleyerek 7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA) boyama ortam hazırlamak.
    Not: DCF-DA ışığa duyarlı olduğunu. Işığa maruz kaçınılmalıdır. DCF-DA ve boyama zaman konsantrasyon hücre türüne bağlı olarak ayarlanabilir.
  5. Büyüme orta dikkatle 15 mL konik tüp sizden kaldırın ve taze hazırlanmış DCF-DA boyama orta 1 mL ekleyin. Dikkatle hücre Pelet resuspend ve karanlıkta 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Sigara lekeli bir örnek bir negatif boyama kontrol içerir.
    Not: Proliferasyona hücreleri DCF-DA ile lekeli değil bir negatif kontrol hazırlanmalıdır.
  6. Santrifüjü 500 x g 5 min için de tarafından hücreleri toplamak ve onları yıkamak 1 x 2 mL 1 x PBS ile. 1 mL 1 x PBS hücrelerle resuspend ve örnek (FACS) tüp sıralama uygun floresan aktif hücreye transfer.
  7. Ölçü 2 ', bir uygun lazer kaynağı ile donatılmış bir akış sitometresi kullanarak 7 '-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA) Floresan sinyali. Örnekleri ile mavi lazer heyecanlandırmak (488 nm) ve Logaritmik ölçek kullanarak bir 530 ± 30 nm bulmak ile (FITC) verilmiş floresans algılamak.
    1. Negatif kontrol lekeli olmayan hücreleri ilk analiz. İleri dağılım (FSC) karşı tarafı dağılım (SSC) bir nokta arsa, perdeleme aracını kullanarak canlı hücreleri seçin ve ölü hücreleri ve hücresel enkaz ortadan kaldırmak.
      Not: Hücre boyutu değişimi FSC karşı SSC, nokta mezarlığına dikkatle izlenmelidir. FSC karşı SSC, nokta mezarlığına çoğunluğuna sonra senescent hücrelerin boyutunu önemli ölçüde arttırılırsa, DCF-DA yoğunluğu içinde aynı boyutta hücre popülasyonlarının karşılaştırılmalıdır.
    2. Bir tek parametreli histogram DCF-DA görüntüleme (488 nm) Floresan xLogaritmik ölçekte-eksen ve olayları (cep numarası) y, doğrusal ölçeği üzerindeki-eksen, gerilim pik üzerinden yerleştirmek için 488 nm lazer ayarlamak lekeli olmayan hücreler sol kenarında.
    3. Örnekleri ve her örnek için kayıt en az 10,000 olayları lekeli DCF-DA analiz. Akış Sitometresi belirli analiz yazılımı kullanarak her örnek ortalama floresans değeri elde.
      Not: ROS ölçümleri bağımsız olarak en az 3 x ve Ortalama değerlerini bu sonuçlar hesaplanacağını yinelenmelidir. Temsilcisi H-Ras-indüklenen yaşlanma sonuçları Şekil 2' de gösterilmiştir.

4. Quantifying Il-6 ve Il-8 mRNA ifade yaşlanma ilişkili salgı fenotip analizi kullanarak gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu için

  1. Toplam RNA hazırlık
    1. Plaka 3 x 105 WI-38 hücreleri 100 mm Kültür üzerine % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin içeren DMEM çanağı ve onları bir doku kültürü kuluçka 37 ° C'de 1 gün için kültür. Yinelenen kültürler her zaman noktası için hazırlayın.
    2. 1. adımda açıklandığı gibi H-RasV12 retrovirüsü hücrelerle bulaşmasını tarafından yaşlanma neden.
    3. Yıkayın hasattan önce 1 gün hücre 2 x 1 x PBS ile ve DMEM FBS olmadan 3 mL ekleyin.
      Not: Bu adım adım 5'te açıklandığı gibi ELISA için kullanılan şartına orta üretmek için yapılır. Açlık serum IL-6 ve Il-8 mRNA'ların bazı hassas hücreler içinde bir ifade neden olabilir. Böylece, IL-6 ve Il-8 mRNA ifade ve serum açlık olmadan kültürlü hücrelerde ilk karşılaştırılması gereken. Açlık serum IL-6 ve Il-8 mRNA ifadesinde önemli değişiklikler neden olmaktadır, qPCR için toplam RNA ve ELISA için şartına orta ayrı olarak hazırlanmalıdır.
    4. Klimalı orta örnekleri 24 h sonra toplamak ve orta-80 ° C'de ELISA için saklayın.
    5. Hücreleri 1 mL % 0.05 tripsin/EDTA çözeltisi ile tedavi bunları ayırmak ve 1 mL % 10 içeren büyüme ortamının ekleyerek tripsin devre dışı bırakabilirsiniz FBS. 5. adımda açıklandığı gibi ELISA sonuçları normalleştirme için hücre sayısı belirler. Santrifüjü 500 x g 5 min için de tarafından 1.5 mL microcentrifuge tüp hücrelerde hasat.
    6. Orta yumuşak emici tarafından kaldırın ve 1 mL RNA ayıklama çözeltisi ekleyin. O zaman, girdap microcentrifuge tüp şiddetle için 15 s. Daha sonra kloroform ve şiddetle girdap karışımı bir ek 15 için tekrar 200 µL ekler s.
    7. 17.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de örnek tüpler santrifüj kapasitesi Ardından dikkatle üst aşaması için yeni bir 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
      Not: İnterfaz ve alt Organik faz üst aşama aktarımı için yeni bir tüp sırasında rahatsız değil.
    8. İsopropanol RNA çökelti ve onları de nazik INVERSION tarafından karışımı 400 µL ekleyin. O zaman, Tüp, oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
    9. 17.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de tüp santrifüj kapasitesi O zaman, RNA Pelet korumak için dikkat çekici süpernatant, atın. 1 mL % 75 etanol ekleyerek RNA yıkayın ve tüp 2 – 3 x tersine çevirin. Tüp 17.000 x g 4 ° c de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
    10. Oda sıcaklığında RNA Pelet Makinası ve RNA dietil pyrocarbonate (DEPC) 50 µL içinde çözülür-distile su tedavi. 1 µL RNA çözüm kullanarak, toplam RNA konsantrasyon ile spektrofotometre ölçmek.
      Not: •kızılötesi RNA çözünürlük azaltır; Bu nedenle, RNA •kızılötesi kaçının.
  2. cDNA hazırlık
    1. Ertesi gün bir ince duvarlı PCR tüp içine ekleyerek her örnek için Ters transkripsiyon tepki karışım hazırlamak: Toplam RNA'ın 2 µg (RNase free su ile 10 µL için ses seviyesini), 10 x RT arabellek, rasgele bir astar (50 pmol), 25 x dNTP Mix (100 0.8 µL 1 µL 2 µL mM), MMLV ters transkriptaz (50 U/µL) 1 µL ve 5.2 µL RNase free, su.
    2. Aşağıdaki koşullar ile termal cycler Ters transkripsiyon tepki programa ayarlayın: 42 ° C 60 dakika ve 95 ° C 5 dk. yer PCR tüpleri termal cycler ve programı Başlat.
  3. Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu
    1. Gerçek zamanlı PCR ana mix tüm reaksiyonlar için hazırlayın. Reaksiyon karışımı her örnek için aşağıdaki gibidir: 2 x gerçek zamanlı PCR Master Mix, 1 µL her Il-6 ve Il-8 için ileriye ve geriye doğru astar ve ultra-saf distile su (DNaz-RNase-ücretsiz ve) 21 µL 25 µL. Bkz. Tablo 1.
      Not: aktin RNA astar bir iç denetimi içeren her örnek için gerçek zamanlı PCR reaksiyon karışımı hazırlayın. GAPDH, normalleştirme için bir iç denetimi olarak da kullanılabilir.
    2. Her şey bir 96-şey optik qPCR plaka 48 µL ana mix ve su ile 3 kat seyreltilmiş cDNA ürünün 2 µL ekleyin. Her reaksiyon nüsha gerçekleştirin. CDNA şablonu PCR denetimi olarak yok bir denetim iyi hazırlamak.
    3. Aşağıdaki koşullar ile termal cycler gerçek zamanlı PCR reaksiyon programa ayarlayın: 95 ° C, 40 devir of15 s 95 ° c (denatürasyon) ve 1 dk. 60 ° c (tavlama ve uzantısı), 10 dak.
    4. Gerçek zamanlı PCR gerçekleştirmek ve eşik döngüsü (CT) değeri PCR döngüsü tamamlandıktan sonra kaydedin. MRNA düzeyleri Il-6 veya Il-8 2- ΔΔCΤ yöntemi20kullanarak hesaplayın.
      Not: Göreli kat Değiştir ifadesinde aktin düzeylere normalleştirme sonra aşağıdaki formülü kullanarak belirlenir:
      Değişiklik kat 2-Δ (ΔCT) =
      Burada,
      ΔCT CT, Il-6 veya Il-8- CT, aktin; = ve
      Δ (ΔCT) = ΔCT, uyarılmış- ΔCT, denetimi.
    5. Yinelenen her örnek için ortalama değeri hesaplamak.
      Not: qPCR bağımsız olarak en az 3 x ve ortalama değerleri temel alınarak bu sonuçlara hesaplanacağını yinelenmelidir. Temsilcisi H-Ras-indüklenen yaşlanma sonuçları Şekil 3' te gösterilmektedir. Açlık serum IL-6 ve Il-8 mRNA bazı hassas hücreler içinde ifade neden olabilir. Böylece, IL-6 ve Il-8 mRNA ifade ve serum açlık olmadan kültürlü hücrelerde ilk karşılaştırılması gereken. Serum açlık Il-6 veya Il-8 mRNA ifade önemli değişikliklere neden olmaktadır, qPCR için toplam RNA ve ELISA için şartına orta ayrı olarak hazırlanmalıdır.

5. miktarının salgılanan Il-6 ve Il-8 protein düzeyleri ELISA bir salgı fenotip yaşlanma ilişkili analizi için

  1. Tezcan şartına orta 3 mL senescent WI-38 hücrelerden adım 4'te açıklandığı gibi hasat. Santrifüjü 500 x g 5 min için de hücre artıkları çıkarın.
  2. Klimalı orta 10 kat konsantre Santrifüjü 3000 x g 20 dk santrifüj filtre birimini kullanarak için de tarafından.
    Not: Şartına orta yoğunlukta mutlaka örnek türüne bağımlı.
  3. ELISA şartına orta konsantre her örneğinin 50 µL ile uygun Il-6 ve Il-8 ELISA kitleri kullanarak gerçekleştirin.
    Not: her örnek iki ELISA wells için yapılan Test. Çünkü her zaman noktası 4. adımda çoğaltılmış olması, bu analiz ELISA tahlil ve örnek hazırlama tekniği izlemek için bize izin verir.
    1. ELISA levha kaplama, IL-6 veya Il-8 antikor bir konsantrasyon olarak 0,5 µg/mL 1 x PBS ile Il-6 veya 0,125 µg/mL için Il-8 için sulandırmak. Seyreltilmiş antikorların 100 µL ELISA plaka her şey için ekleyin. Film sızdırmazlık bir ELISA plaka ile plaka mühür ve bir gecede oda sıcaklığında sallayarak olmadan kuluçkaya.
    2. Antikor çözüm aspirasyon tarafından kaldırın. Her şey 4 x 1 yıkama arabellek x 300 µL ile yıkayın (% 0.05 Ara-20 PBS). 300 µL engelleme arabelleği (PBS % 1 BSA) her şey için ekleyin. 1s için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    3. Engelleme çözüm aspirasyon tarafından kaldırın. Her şey 4 x 1 yıkama arabellek x 300 µL ile yıkayın. Seri olarak seyreltilmiş ELISA standartları seyreltme arabelleği (% 0.05 Ara-20 ve % 0.1 BSA PBS içinde) standart bir eğri oluşturmak için hazır olun.
      Not: IL-6 için seri seyreltme 31,25, 62.5, 125, 250, 500, 1000 ve 2000 pg/mL ' dir. Il-8 için seri seyreltme 2.34, 4,69, 9,38, 18,75, 37.5, 75 ve 150 pg/mL dir.
    4. Standart çözüm 100 µL ya 100 µL örnek çözüm (konsantre Orta 50 µL) 50 µL seyreltme arabelleği ile her şey için ekleyin. Wells, oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.
    5. Standart veya örnek çözüm aspirasyon tarafından kaldırın. Her şey 4 x 1 yıkama arabellek x 300 µL ile yıkayın. Algılama antikor seyreltme arabelleği için Il-6 veya 0,25 µg/mL 0.1 µg/mL konsantrasyonu ile Il-8 için sulandırmak. Seyreltilmiş antikor iyi başına 100 µL ekleyin. Wells, oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.
    6. Antikor çözüm aspirasyon tarafından kaldırın. Her şey 4 x 1 yıkama arabellek x 300 µL ile yıkayın. Streptavidin horseradish peroksidaz (HRP) 0,05 µg/mL konsantrasyonu seyreltme arabellekte oranında seyreltin. Streptavidin-HRP çözüm iyi başına 100 µL ekleyin. Wells, oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
    7. Antikor çözüm aspirasyon tarafından kaldırın. Her şey 4 x 1 yıkama arabellek x 300 µL ile yıkayın. 3, 3, 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) substrat çözeltisi her şey için 100 µL ekleyin. Renk geliştirme için izin vermek 20 dakika oda sıcaklığında wells kuluçkaya. Reaksiyon 1 M HCl durmak eriyik 100 µL ekleyerek durdurmak.
    8. Her şey absorbans 450 de ELISA okuyucu ile okumak nm.
    9. Oluşturulan standartları için standart eğri çizmek. Il-6 ve Il-8 konsantrasyonları standart eğrileri göre klimalı ortamda hesaplayın. Hücre sayısı için bir normalleştirme sonra sonuçları çizmek. Yinelenen örnekleri için ortalama değerleri hesaplar.
      Not: ELISAs bağımsız olarak en az 3 x ve ortalama değerleri temel alınarak bu sonuçlara (Şekil 4) hesaplanması gereken yinelenmelidir.

Sonuçlar

H-Ras-indüklenen yaşlanma örneği Şekil 1' de gösterilen. H-RasV12 retrovirüsü ile WI-38 normal insan fibroblast bir enfeksiyon dramatik morfolojik değişiklikler (Şekil 1B) indüklenen. Buna ek olarak, Şekil 1 ciçinde gösterildiği gibi SA β-gal boyama etkinliği son derece H-RasV12 ifade yükseldi. SA β-gal etkinlik 6 d H-RasV12 retrovirüsü enfeksiyon sonra boyama, biz ve diğer gru...

Tartışmalar

Burada, H-Ras-indüklenen yaşlanma WI-38 normal insan fibroblast içinde sırasında hücre içi ROS düzeyleri izlemek için yöntem sunulmuştur. Canlı hücrelerde hücre içi ROS düzeyleri kantitatif hücre geçirgen reaktif DCF-DA kullanarak ölçülen ve akış sitometresi. Hücresel alımı DCF-DA hücre içi esterazlar tarafından deacetylated ve daha sonra son derece floresan 2', 7'-dichlorofluorescein (DCF) oluşturmak üzere ROS tarafından okside. DCF floresan bir FL1 dedektörü (yeşil floresan) kullanara...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Ulusal Araştırma Vakfı Kore (2015R1D1A1A01060839) bir hibe (için Young Yeon Kim) ve Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen bir Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (NMG) hibe tarafından desteklenmiştir (Hayır 2016R1A2B2008887 No 2016R1A5A2007009) (için Jeanho Yun).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
poly-L-lysineSigma-AldrichP2636
BOSC 23ATCCCRL-11269
FBSGIBCO16000-044
penicillin/streptomycinwellgeneLS202-02
PBSHycloneSH30013.02
DMEMGIBCO12800-082
OPTI-MEM GIBCO31985-070
pBabe puro-H-RasV12 Addgene1768
pGAG/polAddgene14887
pVSVGAddgene1733
TurbofectThermo Fisher ScientificR0531
polybreneSigma-AldrichH92688 mg/mL
puromycinSigma-AldrichP88332 mg/mL 
formaldehydeSigma-AldrichF8775
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal)Sigma-AldrichB4252
potassium ferrocyanideSigma-AldrichB4252
potassium ferricyanideSigma-AldrichP9387
trypsin-EDTAwellgeneLS015-01
DCF-DASigma-Aldrich D688310 mM 
TrizolThermo Fisher Scientific15596026
MMLV Reverse transcriptasePromegaM1701
SYBR Green PCR master 2x mixTakaraPR820A
Random PrimerPromegaC118A
Tween-20Sigma-AldrichP9416
Ultra-pure distilled waterInvitrogen10977015
Human IL-6 ELISA assayPeproTech#900-TM16
Human IL-8 ELISA assayPeproTech#900_TM18
EQUIPMENTS
0.45 μm syringe filtersartorius16555
ParafilmBEMIS PM-996
MicroscopeNIKONTS100
Flow cytometerBD BioscienceLSR Fortessa
Amicon Ultra-4mlMerk MilliporeUFC800324
NanoDrop spectrophotometerBioDrop80-3006-61
Real-time PCR SystemApplied BiosystemsABI Prism 7500
ELISA ReaderMolecular DevicesEMax microplate reader

Referanslar

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
  3. Braig, M., et al. Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development. Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).
  4. Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
  5. Collado, M., et al. Tumour biology: senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
  6. Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype. Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).
  7. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  8. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).
  9. Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress. Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).
  10. Lee, A. C., et al. Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species. The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).
  11. Chen, Q., Ames, B. N. Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).
  12. Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).
  13. Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).
  14. Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
  15. Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).
  16. Rodier, F., Campisi, J. Four faces of cellular senescence. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).
  17. Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).
  18. Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).
  19. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Kim, Y. Y., et al. Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence. Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).
  22. Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
  23. Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
  24. Wojtala, A., et al. Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).
  25. Duncan, F. E., et al. Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte. Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).
  26. Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence. Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).
  27. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  28. Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
  29. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  30. Baker, D. J., et al. Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency. Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).
  31. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  32. Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
  33. Farr, J. N., et al. Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice. Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).
  34. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  35. Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nature Communications. 7, 11190 (2016).
  36. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im biyolojisisay 138h cresel ya lanmaH RasROSSASPIL 6Il 8ya lanma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır