Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

Özet

Burada bir protokol için tek tek hücre tiplerinin fare nöromusküler kavşakta nüfus sinyal görüntü kalsiyum mevcut.

Özet

Doku hücreleri elektriksel aktivitesinin elektrofizyolojik teknikleri tarafından izlenebilir ama bunlar genellikle tek tek hücreler analiz için sınırlıdır. Hücre içi kalsiyum (Ca^{2 +}) sitozol artış kez elektriksel aktivite nedeniyle oluşur veya sayısız diğer uyaranlara yanıt olarak, bu işlem tarafından izlenebilir sonra hücreleri görüntüleme florasan kalsiyum duyarlı ile yüklü boyalar.  Ancak, bu boyalar doku içinde tüm hücre tipleri tarafından alınır çünkü bu yanıtı tüm doku içinde bireysel bir hücreye görüntü zordur. Buna ek olarak, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (turk) bir tek hücre türüne göre ifade edilebilir ve böylece tüm nüfus içinde sinyal Ca^{2 +} görüntüleme erişimine izin verme intrasellüler Ca^{2 +}, artış yanıt olarak belli tek hücre türleri. Burada, biz turk GCaMP3/6 Kullanım fare nöromüsküler kavşak uygulamak, motor nöronlar, iskelet kası ve terminal/perisynaptic arasında üçlü bir synapse Schwann hücreleri. Biz bu teknik klasik ex vivo doku müstahzarları yarar göstermek. Bir optik bölücü kullanarak, biz çift dalga boyu görüntüleme dinamik Ca^{2 +} sinyal ve nöromüsküler kavşak (NMJ) statik bir etiket iki hücre özgü GECI veya genetik olarak kodlanmış gerilim izlemek için kolayca adapte olabilir bir yaklaşım yerine Göstergeler (GEVI) aynı anda. Son olarak, biz floresan yoğunluğu uzamsal haritalar yakalamak için kullanılan yordamları tartışıyorlar. Birlikte, bu optik, transgenik ve analitik teknikler farklı hücre altgrupları çeşitli bağlamlarda NMJ, biyolojik aktivitesini incelemek için istihdam edilebilir.

Giriş

Gibi tüm sinapslarda, NMJ üç unsurdan oluşur: presynaptic bir terminal türetilmiş bir nöron, bir postsinaptik nöron/efektör hücre ve bir perisynaptic gliyal hücre^1,2. Sinaptik iletimi temel yönlerini ilk bu synapse³' te gösterilen, birçok açıdan, bu işlemin kısmen nedeniyle bu synapse farklı hücresel elementlerin tarafından aynı moleküllerden ifadesi bilinmeyen kalır. Örneğin, omurgalı NMJ, motor nöronlar tarafından ortak yayımlanan, reseptörleri pürin adenin nükleotit ATP ve asetilkolin (ACh), kas, Schwann hücreleri ve motor nöronlar, böylece herhangi bir yorumu karmaşık hale getiren tarafından ifade edilir Bu maddeler (Örneğin, verici yayın veya Yanıt, kas kuvvet oluşturma)⁴tarafından sarf fonksiyonel etkisi. Basit, NMJ Üçlü bileşenleridir motor nöronlar, kas hücreleri veya Schwann hücreleri bizi canlı tutan göre değişir olup olmadığını Ayrıca, hangi sık sık birden çok sinaptik girdi, sergi, nöronlarda için merkezi sinir sistemi karşılaştırıldığında kendi içsel olarak heterojen (Örneğin, embriyonik türetme, fiber alt tür, morfoloji) belirsiz. Her biri bu sorunları gidermek için aynı anda bir sinaptik öğesi yanı sıra parça, aynı zamanda, böyle bir tepki'a ayrı diğer öğeler içinde birçok hücre yanıtı izlemek için avantajlı olur. Boya banyo uygulanan birden çok hücre tipleri tarafından doku uygulamaya sonra kaplıyor ve intracellularly yüklü boya sadece görselleştirmek için kullanılabilir çünkü geleneksel stratejileri kalsiyum sinyal ölçmek için kimyasal boyalar kullanarak bu iki gol elde edemez hücre bireysel ya da küçük tabur kadar. Burada, transgenik fareler turk ifade kullanan hücre özgü kalsiyum, belirli görüntüleme ve yazılım araçları⁵, ile birlikte biz bu iki genel hedefleri ilk göstermek ve tartışmak sinyal ölçmek için tasarlanmış nasıl yanı sıra yeni transgenik araçları ikinci elde yardımcı. Bu teknik kalsiyum dynamics veya diğer hücresel olaylar gözlemlenebilir aynı anda birden çok hücre popülasyonlarının gen kodlanmış optik sensörler aracılığıyla sinyal izlemek isteyen herkes için faydalı olacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvancılık ve deneyler için bakım ve kullanım laboratuvar hayvan ve IACUC University of Nevada, Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri uygun olarak yapıldı.

1. zarlar ve frenik sinir transgenik fareler üzerinden hazırlanması

1. Transgenik fareler ve oligonükleotid astar genotip için bu fare satın alabilirsiniz.
   Not: Astar her bu fareler için "Bilgi" sayfasında listelenir.
   1. 3 - için 6-ay-yaşlı fare uygun transgenik/knock-in Cre-sürücü alleli bir kopyasını ve sıfır koşullu GCaMP3/6 gen kopyalarını koşullu GCaMP3 bir veya iki kopyasını ifade aynı yaş ikinci bir fare ile ifade etmek üreme / 6 alleli ve Cre-sürücü alleli sıfır kopyalarını.
   2. Genotip Cre ve koşullu GCaMP3/6 gen var pups ve mark olanlar — bunlar bundan böyle çift transgenik fareler olarak adlandırılır (Örneğin, Myf5-Cre, koşullu GCaMP3)⁶.
      Not: Bu şekilde bir kopyasını Cre ve koşullu GCaMP3/6 gen ifade fareler tüm verileri türetmek. Diğer mutant farelerde (Örneğin, altını gizleme) bu haçlar eklerken bu özellikle önemlidir.
2. Çift-transgenik fareler uygun yaş olduğunda (Örneğin, Doğum sonrası gün 0 veya 5 [P0 veya P5] veya yetişkin), fareler onları makas (için fareler P10 genç) ile decapitating veya bir isoflurane inhalasyon odasında yerleştirerek ötenazi — ne zaman onlar are kuyruk çifti forseps ile pinching artık duyarlı, kurban için hazırlar.
3. Hayvan tarafından işten çıkarma makas çifti ile kurban.
4. Bölüm arasında hemen altında karaciğer ve kalp ve akciğerler iridectomy makasla hemen üstünde tüm hayvan kemiği.
5. Uzak karaciğer, kalp ve akciğerler frenik sinir bir emme elektrot (yani, 1-2 cm) çizilmesi için yeterince uzun bir süre korumak için dikkatli olmak, incelemek.
   Not: Sol frenik sinir sol diyafram medial kısmı girer doku beyaz bir parça tanımlanabilir. Bu akciğerler kaldırırken kesilmiş olmalı değil. Şu frenik sinir bir parçası da superior vena cava içeren ve daha ince ve daha beyaz daha vena kava şerit içinde çalışır. Birlikte, her ikisi de sağ medial diyafram nüfuz.
6. Daha fazla göğüs kafesi ve diyafram çevresinde ince ridge dışında vertebral sütunun kaldırın.
7. Diyafram ve frenik sinir örnek bir microfuge tüp Krebs Ringer solüsyonu 1 µg/mL 594-αBTX 10 dk içinde belgili tanımlık karanlık ile yerleştirin.
   Not: 594-αBTX bu toplama işlevlerine (kişisel gözlem) engellenmeden ACh reseptör (AChRs) Etiketler.

2. uyarımı ve kas aksiyon potansiyelleri kayıt

1. Minutien iğne kullanarak, diyafram hareketsiz yoluyla 6 cm çanak üzerine silikon dielektrik jel ile kaplı ve ~ 8 mL oksijenli Krebs Ringer çözeltisi ile dolu ve mikroskop sahneye yerleştirin. Diyafram için 30 dk daha fazla Krebs-zil çözüm (8 mL/dk) ile sıvı.
   Not: Bu ilişkisiz 594-αBTX durulama yanı sıra doku diseksiyon sonra sakinleştiği.
2. Kurulan yöntemleri⁷göre emme bir elektrot olun.
   1. Bir micromanipulator kullanarak 4 X büyütme, emme elektrot Sol frenik sinir üzerinde taşımak ve emme emme elektrot bağlı olduğu Tüp bağlı 5 mL şırınga varil dışarı çekerek uygulayın.
      Not: başarılı bir şekilde emme elektrot çizildiğinde, frenik sinir gergin olduğu. Uyarıcı üzerinde açmak ve frenik teşvik sinir el ile saygısız tarafından geçiş 1 x.
   2. Diyafram 1-Hz stimülasyon cevaben görsel olarak aydınlık alan aydınlatma ile incelenerek sözleşmeleri olduğunu emin olun. Eğer değilse, artımlı olarak bir görsel inceleme kas kasılması, tarafından doğrulanabilir bir supramaximal darbe ulaşmak için gerilim kolu çevirerek gerilim ayarlayın. Eğer hala görünür değil, şırınga ile sinir darbe ve tekrar emme uygulayarak çiz deneyebilirsiniz.
3. Perfüzyon açmak ve kas özgü myosin inhibitörü BHC⁶ veya voltaj kapılı sodyum kanal antagonisti µ-conotoxin⁸ 100 µM son bir konsantrasyon için ekleyin.
   1. 100 µM BHC yapmak, DMSO 200 mM stokunun 4 µL pipet ve 1 mL Krebs Ringer çözeltisi predilute.
   2. 1 mL Krebs Ringer çözeltisi yemek kaldırın.
   3. Prediluted BHC yemek için ekleyin.
      Not: Bu predilution GCaMP3 ifade hücreleri geçici olmayan floresan yanıtta su katılmamış DMSO tarafından indüksiyon önlemeye yardımcı olur.
   4. 30 dakika bekleyin ve sonra başka bir 20-30 dk için taze Krebs-zil çözüm perfüzyon açın.
4. Kayıt elektrot hazırlayın.
   1. Eldiven giyiyor, bir borosilikat filamented bir dış çap (OD) ile 1 mm ve cam bir 0.4 mm iç çapı (ID) bir micropipette çektirmenin yerleştirin ve yerine kelepçe için aramalar sıkın. Çektirme kapıyı kapat.
   2. P-97 çektirme kullanarak programı aşağıdaki ayarı: 900 ısıda, çekme 120, 75 hızda, 250, 500 ve döngü olmadığını ek basınç anda.
      Not: Yazılım denetimleri amplifikatör kullanarak Resistance (R) ölçülür: veri toplama yazılımı direnç formülü V çözerek onaylar IR. = Yazılım denetleyicisi bir bilinen akım (ı) (genellikle 1 nA) elektrot üzerinden geçer ve böylece bize R. için çözmek etkinleştirme voltaj (V), değişikliği ölçer
   3. Embriyonik diyaframlar için direniş 60 MΩ yakın ve büyük diyaframlar, 10-20 MΩ için olduğundan emin olun. 3 M KCl ile kayıt elektrot yükleyin.
5. 10 X büyütme oranında elektrot ikinci bir micromanipulator sahne karşı tarafta bir uyarıcı elektrot kullanarak kas içine daha düşük.
6. Elektrofizyolojik veri toplama yazılımı kullanarak, istirahat membran potansiyeli 0'dan-65 için dönüşünceye kadar bekleyin mV veya aşağıda.
7. 1 Hz de teşvik ve mütevazı bir kaçmak sergiler için büyük bir potansiyel kontrol ederek bir kas aksiyon potansiyeli varlığını denetlemek (0'ın üzerinde yükselir potansiyel-65 başlatıldığında mV mV veya aşağıda). Stimülasyon artifakı bir aksiyon potansiyeli ile karıştırmayın.
   Not: Süresi (~ 5 ms) stimülasyon eserler önemli ölçüde daha uzun kudretliler.

3. örnek floresans görüntüleme

1. 594-αBTX-etiketli NMJs yeşil/sarı ışık uyarma altında yaşar kas endplate grup merkezi 20 X büyütme oranında bulun (550 nm). Geçiş için mavi ışık uyarma (470 nm) görüntü Ca^{2 +} yanıt kas, motor nöron veya Schwann hücreleri için.
2. İsterseniz, resim splitter kadar bant filtreleri ve çift dalga boyu görüntüleme için bir dikroik tek-edge filtresi ayarlayın.
3. GCaMP3/6-ifade doku tarafından sergilenen maksimal Floresan (Fmax) hesaplamak için diyafram hazırlıklar⁶' ya 3 M potasyum klorür (KCl) 12 µL eklemek.
   1. Arama tablo Bar GCaMP3/6-ifade doku KCl cevaben binning olmadan 20 X büyütmede doygunluğu sergileyen düzeyinin % 110 set parlaklık çubuğu ile deneyler yapmak.
4. Kaçırmayın için saniyede 20 kare herhangi bir hızlı olayları kaydetmek.
5. 1-45 s 20-40 Hz ile sinir stimülasyonu ile bir tren emme elektrot kullanarak impulslarinin sunarak teşvik veya farmakolojik agonistler banyo uygulama veya perfüzyon ekleyin ve dinamik floresan Ca^{2 +} yanıtları bir hücre alt toplamak statik 594-αBTX NMJ sinyal ile birlikte.
   Not: doku özgü kırmızı veya far-red GECI veya GEVI fareler, NMJ kullanılmak yayımlanırsa, onlar NMJ iki ayrı hücresel elemanlar yansıtan iki dinamik sinyal toplamak için kullanılabilir.
6. İstenen sonuçları elde çünkü görüntüleme veya elektrofizyolojik deneyler sona erdikten sonra perfüzyon hatları üzerinden su sıvı ve su 2 x - 3 x tuzları inşa değil emin olmak için emme elektrot ile emmek.

4. ihracat ve bir standart sapma harita floresan yoğunluğu (SD_iu16) tarafından veri analizi

1. 16-bit TIFF yığınlar kaydedilen görüntü sıralarını kayıt ve analiz için istediğiniz görüntüleme veri analiz sistem içine yükleyin.
2. Yazılım'ın 8d dosya menüsü, ilgi görüntü yığını seçin ve yüklemek için tıklatın.
   1. Bir kez video yükler, hücresel floresan aktivite vardır bir bölümü tanımlamak için zaman inceden inceye gözden geçirmek.
      Not: Bu bölge bir arka plan örnek oluşturmak için kullanılır.
   2. Shift basılı tutun ve bir bölgesi faiz (ROI) kutusunun arka plan örnek alanı olarak tanımlanan alan çizmek için tıklatın.
   3. Kutusu oluşturduktan sonra arka plan etkinliği değiştirmek bir çizim oluşturmak için boşluk çubuğuna basın.
   4. Izleme sağ tıklatın ve xy koordinat metin dosyası olarak izleme yapmak için Metin olarak yatırım getirisi dökümü seçeneği sunmak için çeşitli seçeneğini belirleyin.
3. Geri faiz video hareketli, tekrar faiz etkinliğin oluştuğu saat bölgesi tanımlamak için tarayın.
   1. Orta fare düğmesini kullanarak, bu zaman bölgesi sarı zaman kutusunda seçin.
   2. Videoda sağ tıklatın ve seçin Yığın OPS ve sonra Stat göster seçeneği 5.
      Not: Bu sol penceresinde bir standart sapma harita (SD) oluşturur.
   3. SD harita üzerinde tıklatın ve sonra uygun renk ısı haritası uygulamak için 19 x tuşuna basın [ ] .
   4. SD Haritayı sağ tıklatın ve hangi SD harita kaydetme seçeneği stm TIFF olarak kaydetmek sunacak STM yük ve kurtarmak, seçin.
   5. O zaman, basın [ bir gri tonlama renk haritaya dönmek için 19 x anahtar.
   6. C sonra D yoğunluğu haritalama araçları kadar getirmek için tuşuna basın. Sol fare düğmesi ve merkezi fare düğmesini kullanarak, SD Haritada gösterilen tüm floresan etkinlik eklemek için eşik ayarlayın.
   7. Eşik ayarlarını koruyarak yoğunluğu araçları kapatmak için C tuşuna basın.
   8. SD Haritayı sağ tıklatın ve seçin STM parçacıklar ve sonra Bulmak PTCLS.
      Not: Bu tek tek hücreleri floresan etkinliği ifade tanımlar.
   9. Bir kez daha SD Haritayı sağ tıklatın ve Parçacık ROIs oluşturmakseçin.
      Not: Bu orijinal video ilgi temel üst üste.
   10. Shiftbasılı tutarak, özgün video Şimdi tespit parçacık ROIs herhangi birini sağ tıklatın.
   11. Yatırım getirisi Marker ve yatırım getirisi ölçü Intseçin.
       Not: Bu video ilgi tanımlanan her yatırım getirisini floresan faaliyet araziler oluşturur. Bunlar bunlardan herhangi biri sağ tıklatarak kaydedilebilir ve Assorted, seçme Metin olarak yatırım getirisi dökümütarafından takip.
4. Bu işlemler altında yatan ayrıntılı mantık için kaynak kodu dosyası⁹bakınız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Çeşitli değişikliklere örnek olarak artar olan intrasellüler Ca^{2 +} NMJ türleri tanımlanmış hücre içinde tarafından aracılı floresan yoğunluğu, belgili tanımlık yarar bu yaklaşımın göster. Bu sonuçlar yanıt veren hücrelerin konumunu, hem de böylece kaç hücre yanıt ve ne kadar her hücre için belirli bir yanıt değerlendirilmesi için izin verdikleri yanıtlara yoğunluğunu sağlamak kayma floresan yoğunluğu haritalar olarak sunulur uyarıcı. ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada biz Ca^{2 +} yanıt sağlam nöromüsküler doku GECI ifade fare kullanarak belirli hücrelerde ölçme bazı örnekler sağlar. Bu deneyler başarıyla gerçekleştirebilmek sırasında diseksiyon frenik sinir incitmek değil zorunludur. CA^{2 +} Schwann hücreleri (Örneğin, 20 X veya 60 X) düşük veya yüksek güçte yanıtlarında görüntüye, ya BHC ya da µ-conotoxin blok hareket için kullanmak gereklidir. Düşük güç görüntüleme için tepkilerin Ca^{2 +} kas hücr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Myf5-Cre mice	Jax	#007893	Drives muscle cell expression as early as E136
Wnt1-Cre mice	Jax	#003829	Drives expression into all  Schwann cells at E13 but not P209
Sox10-Cre mice	Jax	#025807	Drives Schwann cell expression at older ages
Conditional GCaMP3 mice	Jax	#029043	Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion
Conditional GCaMP6f mice	Jax	#024105	Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion
BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)	Hit2Lead	#5102862	Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6
CF594-α-BTX	Biotium	#00007	Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ
µ-conotoxin GIIIb	Peptides Int'l	#CONO20-01000	Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8
Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard	Ellswoth Adhesives	# Sil Dielec Gel .9KG	Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins
Minutien pins (0.1mm diameter)	Fine Science Tools	26002-10	Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel
Eclipse FN1 upright microscope	Nikon	MBA74100	Allows staging and observation of specimen
Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator	Autom8	MXMScr	Allows movement of specimen
Manual micromanipulator	Narishige	M-152	Holds recording and stimulating electrodes
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Axoclamp 900A	Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording
Microelectrode low-noise data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1550	Allows electrophysiological data acquisition
Microelectrode data analysis system	Molecular Devices	PCLAMP 10 Standard	Performs electrophysiological data analysis
Square wave stimulator	Grass	S48	Stimulates nerve to excite muscle
Stimulus Isolation Unit	Grass	PSIU6	Reduces  stimulation artifacts
Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter	Sutter	FG-GBF100-50-15	Impales and records nerve-evoked muscle potentials
Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter	Sutter	BF150-117-15	Lengthened and used for suction electrode
Micropipette Puller	Sutter	P-97	Pulls and prepares recording electrodes
1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera	Photometrics	Prime 95b	Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging
Light Source	Lumencor	Spectra X	Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation
Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm	Nikon	CFI60	Provide long working distances for visualization of specimen
Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp	Sumita	LS-DWL-N	Provides illumination for brightfield observation
W-View Gemini Image Splitter	Hamamatsu	A12801-01	Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera
Single-band Bandpass Filters  (512/25-25 and 630/92-25)	SemRock	FF01-512/25-25; FF01-630/92-25	Permits dual band imaging
560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter	Sem Rock	FF560-FDi01-25x36	Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging
Imaging data acquisition system	Nikon	NIS Elements - MQS31000	Allows imaging data acquisition
Wavelength control module	Nikon	MQS41220	Module for imaging data acqusiition
Emission splitter hardware module	Nikon	MQS41410	Module for imaging data acqusiition
Imaging data analysis system	NA	Volumetry 8D5, Fiji	Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data