Bir küresel öldürme tahlil araba T hücreleri tarafından

Özet

Bu iletişim kuralı immunotherapeutic yeniden yönlendirilen T-hücre (araba T-hücreli) sitotoksisite karşı 3D yapılandırılmış kanserli hücreleri (pulcuklarının) gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için tasarlanmıştır.

Özet

İmmünoterapi Aksi takdirde tedavi edilemez kansere karşı mücadele büyüyen ilgi alanı haline gelmiştir. Tüm immunotherapeutic Yöntemler arasında en çarpıcı sonuçlar, özellikle Pediatrik B akut lenfoblastik lösemi (B-ALL) ile elde edilen T hücreleri chimeric antijen reseptör (araba) yönlendirildi. Klasik doğrulama yöntemleri araba T hücrelerinin özgüllük kullanımı ve işlevselliği deneyleri hedef hücrelere süspansiyon ve xenograft modelleri karşı araba T hücrelerinin güveniyor. Ne yazık ki, tüp bebek yapılan gözlemleri kez vivo içinde elde edilen sonuçlar üzerinden decoupled ve çok çaba ve hayvanların bir adım daha ekleyerek bağışladı: 3D kültür kullanımı. Onlar hayvan modeli engrafted yükleyen tümör hücreleri 3D yapısını taklit potansiyel hedef hücrelere pulcuklarının üretim ideal bir alternatif temsil eder. Burada, evlat edinen hücre tedavisi (burada CD19 araba T hücreleri tarafından örneği) için bir doğrulama aracı olarak bir transduced kolorektal hücre satırından pulcuklarının üretmek için uygun fiyatlı, güvenilir ve kolay bir yöntem raporu. Bu yöntem küresel büyüme takip edebilirsiniz bir Gelişmiş canlı görüntüleme sistemi ile birleştiğinde, sitotoksisite ve tümör hücre apoptosis efektör hücreleri.

Giriş

Evlat edinen hücre aktarımı (ACT) yeni nesil kanser muamele temsil eder. Efektör hücreler (T - veya NK-hücreleri) enjeksiyon bir hasta dayanmaktadır. Bu hücrelerin genetik olarak onlara onların hedefe, tümör, rehberlik ve onu yok bir reseptör ile değiştirilebilir. Son zamanlarda bu yaklaşım B-hücre işaretçisi CD19 karşı yönetmen Chimeric antijen reseptör (araba) hasta T hücreleri seçtiğin bu kullanıcı kanser¹öldürmeye tanıttığında mümkün olduğu gösterilmiştir. Yapay bir reseptör olan araba söz konusu olduğunda tasarım spesifik antikor parçaları bir varlık belirlenmiş tek zincir değişken parçası (scFv), azaltılmış etki alanı bağlama antijen oluşur T-hücre sinyal etki alanlarına bağlı. Çeşitli tasarımlar olmakla birlikte, ikinci nesil araba tasarımları TCR sinyal için CD3z ve co-stimulatory etki alanı oluşur anılacaktır en çok kullanılan sürümleri (CD28, 4-1BB, OX40, vs.) ^{1 , 2}. ne zaman CD19 araba-T hücreleri efficaciously B hücre maligniteler^3,4ile çok sayıda hasta tedavi immünoterapi alan Yasası'nın bu yeni form dikkatini çoğunu yönetmen. Bu başarının, araştırmacılar diğer epitopları için sınırlı başarı ile solid tümör hedefleyerek benzer tasarımlar yararlanmaya çalıştı. Ne yazık ki, tümör belirli antijenleri ve araba T işlenen sert tümör microenvironments kıtlığı daha az etkili solid tümör⁵doğru hücreleri.

Şu anda, en sık kullanılan vitro doğrulama stratejileri yalnızca bir parçası zaten belirtilen solid tümör zorlukların adres iki boyutlu (2D) sistemleri üzerinde güveniyor. Klasik, 2D vitro sistemleri bu efektör hücreler özgüllük ve işlevlerinin değerlendirmek için monolayers araba T hücreleri ve hedef kanser hücre satırlarını içerir. Bu stratejileri önemli ve hayati parçaları çalışmaların olmakla birlikte, onlar karmaşık Morfoloji ve kanser hücreleri⁶üç boyutlu (3D) yapısını göz önünde değil. 3D sistemleri pulcuklarının anılacaktır, kültürlü kanser hücrelerinin yeni fenotipik özellikleri tanıma yeniden yönlendirilen efektör hücreleri tarafından etkisi gen ifade profil⁷, hangi değişiklikleri yoluyla elde. Birgersdotter ve arkadaşları bir Hodgkin Lenfoma (HL) hücre satırı yalnızca bir 3D kültür modelinde yetiştirilen birincil tümör örnekleri⁸' e benzer bir gen ifade profil tutar gösterdi. Bu nedenle, pulcuklarının veya benzer 3D metodolojileri teklif Standart 2D sistemleri karşı in vitro modellerinde daha alakalı kültür. Bu tür sistemlere de verilen bir araba doğrulama sürecindeki son adım olarak görülen içinde vivo çalışmalar benzer. 2D sistemleri kanser kümeleri morfolojisi taklit etmek başarısız göz önüne alındığında, pulcuklarının araba T hücreleri önce işlevselliğini değerlendirmek için benzer oluşumlar teklif içinde vivo modelleri. Bir çalışmada, Pickl vd. tanımlanan insan epidermal büyüme faktörü reseptörü (HER2) kanser hücrelerinin overexpressing bir küresel model benzer sinyal profilleri içinde vivo modelleri⁹gösterdi. Bunu daha fazla pulcuklarının araba T hücrelerinin daha alakalı ve Kapat ve içinde vivo değerlendirme teklif destekler. Ayrıca, araba T-hücre doğrulama pulcuklarının karşı daha eleştirel onların etkinliğini değerlendirmek ve bazı tasarımlar içinde vivo çalışmalar için erken hareket etmesini önlemek yardımcı olabilir¹⁰; Böylece, etik ilgili araştırma için daha az sayıda hayvan kurban ederek katkıda. Ayrıca, pulcuklarının kullanarak iletişim kuralları klasik 2D sistemleri daha ve çok daha hızlı klasik içinde vivo çalışmalar ile karşılaştırıldığında daha pahalı değildir. Birlikte ele alındığında, tüp bebek ve içinde vivo çalışmalar bağlamak için standart bir uygulama haline yakında küresel çalışmalar dahil kimse tahmin edebilirsiniz.

Burada, kolon kanseri hücre satırından HCT 116 pulcuklarının hazırlanması mevcut. Bu hücre kültürünü insan CD19 molekül CD19 araba T hücreleri hassas işlemek için ve klinik olarak doğrulanmış bir araba inşa kullanarak öldürme net bir değerlendirme sağlamak için hızlı şekilde değiştirilmiştir.

Protokol

1. nesil pulcuklarının kolorektal kanser hücre satırından

1. Yıkama HCT 116 (farklılaşma 19 küme (CD19) ve yeşil floresans Protein (GFP) ifade etmek için stabil transduced) hücre monolayers fosfat ile arabelleğe alınmış serum (PBS; 25 cm² veya bir 75 cm² şişesi için 10 mL 5 mL). Tripsin (0.5 mL 25 cm² veya bir 75 cm² şişesi için 1 mL) ekleyin ve 5 min için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
2. Hücre dekolmanı mikroskop altında kontrol ve hücre ayrılma enzim tam Roswell Park Memorial Enstitüsü 160 Orta (RPMI 1640) ile nötralize (RPMI 1640 + %10 FCS + viomisin; 10 mL 25 cm² veya bir 75 cm² şişesi için 20 mL).
3. Santrifüj hücre süspansiyon 500 x g 5 dakika süreyle de süpernatant pipet bir kullanarak kaldırın ve yukarı ve aşağı birkaç kez 5 mL ile tam RPM1 1640 orta pipetting tarafından resuspend.
4. Uyumlu cep tezgahta Trypan mavi dışlama kullanarak hücreleri saymak.
5. Santrifüj hücre süspansiyon 500 x g 5 dakika süreyle de süpernatant pipet bir kullanarak kaldırın ve 5 x 10³ hücre/mL elde etmek için RPMI ortamda resuspend.
6. Hücre süspansiyon için steril bir rezervuar aktarmak ve bir çok kanallı pipet kullanarak alt tabaklar yuvarlak bir 96 kuyuya 200 µL/iyi dağıtmak.
7. Plaka otomatik görüntüleme cihazları bir kuluçka (37 ° C, % 5 CO₂, % 95 nem) içeri aktarın.
8. Oturum alma yazılımı içine, Zamanlama için alması seçin | Başlat Ekle gemi | Zamanlamaya göre tarama | Gemi oluşturun: yeni.
9. Tarama türü seçin: küresel. Faiz kanalları seçin: faz + (pulcuklarının büyüme takip için) aydınlık alan, (tümör sinyal takip etmek, satın alma zaman 300 ms) yeşil ve kırmızı (apoptosis izleyin, satın alma vakti 400 ms).
   1. İstediğiniz büyütme seçin: 10 x.
   2. Plaka modeli ve çekmeceyi konumunu seçin. Wells görüntü konumunu seçin. Deneme açıklamasını girin: adı, tipi hücre, hücre sayısı.
10. Analiz kurulum için Erteleme analiz kadar daha sonraseçin. Zaman çizelgesi üzerinde sağ tıklatın ve Grup aralığı tarama ayarla seçili seçeneği seçin ve ayarla eklemek inceden inceye gözden geçirmek her 4 h ve için toplam 24 h için ayarlamak istediğiniz başlangıç saatini (en az 1 h otomatik görüntüleme cihazları kuluçka sonra).
11. 2 günde pulcuklarının büyümesi için logging içine görüntüleme yazılımı ile kontrol edin.
    1. Görünüm son tarar seçeneği seçin ve istenen deney üzerinde çift tıklatın. Aydınlık alan görüntü Kanallar panelinde seçin ve ardından pulcuklarının çapını ölçmek için Ölçü resim özellikleri aracını kullanabilirsiniz. İstediğiniz boyuta ulaşmak bir küresel 6 gün sürer: 0,5 mm çapında. Tam RPMI orta iyi başına 50 µL orta buharlaşma etkisi sınırlamak için 4 gün ekleyin.

2. nesil CD19 araba T hücreleri

1. Genişleme CD19 araba T hücreleri
   Not: CD19 araba T hücrelerinin istikrarlı ifade yukarıda açıklanan¹⁶olarak sağlıklı donör PBMCs toplu retroviral iletim tarafından satın alınmıştır. Retroviral yapı CD19 araba için kodlama ikinci nesil bir araba ve fmc63 scFv zincir, CD8 menteşe ve transmembran etki alanı, bir 4-1BB co-stimulatory ve bir CD3ζ etki alanı sonunda oluşur.
   1. Genişletmek için kültür transduced T anti-CD3/28 manyetik boncuklar huzurunda bir hücre boncuk oranı 1:1 ile 10-11 gün boyunca hücreleri. Genişleme sırasında tam ortamda hücrelerdir (X-VIVO 15, %5 Serum değiştirme ve 100 U/mL rekombinant insan IL-2).
      Not: İdeal verimli bir genişleme için 1-2 x 10⁶ hücre/mL yoğunluğudur. Bağlı olarak ilk sayı, hücre hücre kültür kuluçka (37 ° C, % 5 CO₂, % 95 nem) şişeler (25 cm² şişe 20 ml, 75 cm² şişe toplam hacminin 40 ml) genişletilebilir.
   2. Aşağıdaki deneyleri için negatif kontrol grubu, Sigara transduced PBMCs CD19 araba T hücrelere paralel genişletme Protokolü (sahte anılacaktır) içerir.
   3. 3. gün tarih ve ileriye doğru her gün taze orta eklemek ve gerekirse daha fazla kültür şişeler hücreleri bölmek.
   4. Günde 10-11, 500 x g 5 dakika süreyle santrifüj hücreleri süpernatant kaldırmak ve bir 50 mL tüp içine tüm hücreleri birleştirmek ve ~ 30 mL taze tam medya hücrelerde resuspend.
   5. Manyetik boncuklar kültür ortamından ayırmak için manyetik bir stand resuspended hücreleri içeren 50 mL tüp yerleştirin.
   6. 2-3 dk tarafında tüp toplamak boncuk için bekleyin.
   7. Bir pipet ve yeni bir tüp transferi ile kültür orta manyetik boncuk toplama bölgelere dokunmadan kaldırın.
   8. Bir kez daha son kültür ortamı boncuklar sınırlamak için boncuk kaldırma (2.1.5–2.1.7) ile ilgili adımları yineleyin.
   9. Resuspend ve hücreleri saymak, yoğunluğu 2 x 10⁶ hücre/ml tam orta 1'e ayarlayın.
   10. Hücrelerin en az 4 gece kadar s için tuttuğunuz. Sonra doğrudan bunları-80 ° C'de dondurmak ve uzun süreli depolama için ertesi gün bir sıvı azot tankı şişeleri aktarın. Alternatif olarak, bir dinlenme ilâ gecede acil kullanım için uzatmak.
2. CD19 araba ifade denetimde birincil T hücreleri
   1. Sayıları biraz donma/çözülme orta veya gecede kültür sonra farklı olabilir gibi genişletilmiş T hücreleri sayar.
   2. 5 x 10⁵ hücreleri her iki CD19 araba ve akış sitometresi tüpler ayırmak için sahte birincil T hücreleri aktarın.
   3. Hücreler akışı arabelleğe 200 μL ile yıkayın (%2 PBS FBS) ve santrifüj tüpleri 500 x g 5 dakika süreyle de kültür medyum tarafından neden olduğu herhangi bir eserler kurtulmak için çamaşır adımları yineleyin.
   4. Birincil antikor (Biotin keçi Anti-fare IgG, F(ab') ₂ parça belirli) akış arabellek 1: 200 seyreltme gerçekleştirerek hazırlayın.
   5. Antikor Mix tüp başına 100 μL hücrelerde resuspend ve 15 dk. tekrarlamak için iki kez aşırı antikor kaldırmak için önceki çamaşır adım buz üzerinde kuluçkaya.
   6. 1: 400 seyreltme arabelleği akış olarak ikincil antikor (Streptavidin-PE) hazırlayın.
   7. Antikor Mix tüp başına 100 μL hücrelerde resuspend ve 15 dk. tekrarlamak için iki kez aşırı antikor kurtulmak için önceki çamaşır adım buz üzerinde kuluçkaya.
   8. Akış arabellek 200 μL tüp başına hücrelerde resuspend ve bir akış sitometresi çözümleyebilirsiniz.
   9. Negatif ve pozitif geçidi ayarla ve CD19 araba çözümlemek için kullanım alay T hücreleri T hücreleri buna göre transduced.

3. 3D tümör küresel öldürme tahlil

1. 6 gün sonra veya bir kez pulcuklarının istediğiniz boyuta ulaşmak, plaka kuluçka makinesi kaldırın. Bir çok kanallı pipet kullanarak, küresel plakalar 100 µL/iyi tam RMPI 1640 orta yavaşça çıkarın.
   1. Bu adımda, ipuçları içine doğru açı duvar pulcuklarının rahatsızlık en aza indirmek için kuyunun ile temas kaçınarak 96-wells plaka. Birim kalan yaklaşık 100 µL olmalıdır.
2. V kırmızı Annexin 1: 200 çözeltisi 50 µL v kırmızı Annexin tam RPMI 1640 orta 9.95 mL ile karıştırarak hazırlayın.
3. V kırmızı Annexin çözüm 1: 200, 100 µL/iyi ekleyin.
4. Plaka 15dk için bir kuluçka makinesi (37 ° C, % 5 CO₂, % 95 nem) aktarın.
5. 15 mL tüp ve onlara 500 x g 5 dakika süreyle bir pipet kullanarak süpernatant kaldırın ve yukarı ve aşağı birkaç kez 2 mL ile tam RPM1 1640 orta pipetting tarafından resuspend santrifüj transduced araba CD19 T hücrelerinde hasat.
6. Uyumlu cep tezgahta Trypan mavi dışlama kullanarak hücreleri saymak.
7. Santrifüj hücre süspansiyon 500 x g 5 dakika süreyle de süpernatant pipet bir kullanarak kaldırın ve 2 x 10⁵ hücre/mL elde etmek için RPMI ortamda resuspend.
8. Hücre süspansiyon için steril bir rezervuar aktarmak ve bir çok kanallı pipet kullanarak alt küresel plaka yuvarlak bir 96 kuyuya 100 µL/iyi dağıtmak.
9. Plaka geri otomatik görüntüleme cihazları bir kuluçka (37 ° C, % 5 CO₂, % 95 nem) içeri aktarın.
10. Satın alma yazılımı içine oturum, için zamanlama alması seçin.
    1. İnceden inceye gözden geçirmek zaman çizelgesini sağ tıklatıp Zaman çizelgesi düzenlemek. Tarama grubu sağ tıklatın ve silin. Zaman çizelgesi üzerinde sağ tıklatın ve Grup aralığı tarama ayarla seçili seçeneği seçin ve ayarla eklemek inceden inceye gözden geçirmek her 1,5 saat ve Toplam için 24 h için.
    2. İstenen başlangıç saatini (en az 1 h otomatik görüntüleme cihazları kuluçka sonra) ayarlayın. Zamanlama taramalarıseçin.

4. otomatik görüntü analizi

1. Edinme oturum, Görünümü son tarar seçeneği seçin ve Analiz Başlat seçeneğini belirleyin. Yeni analiz tanımı oluşturmak seçin | Analiz türü: küresel. (Faz + aydınlık alan, yeşil ve kırmızı) çözümlemek için resmin kanallarını kene.
2. En az 10 temsili resim seçin: genellikle, koşul ve en az 3 saat puan (başlangıç, orta ve satın alma) başına 1.
3. Önizleme varsayılan yordam tüm görüntü yığını üzerinde analiz.
4. Aydınlık alan maskesi parametrelerini değiştirin. Tipik parametreler şunlardır: duyarlılık 10, delik Dolgu 1000 µm², min alan 1000 µm². Resmin tamamını yığında önizleme ve seçilen parametrelere pulcuklarının doğru algılamak kontrol edin.
5. Yeşil maske (GFP) parametrelerini değiştirin. Tipik parametreler şunlardır: silindir şapkalı bölümleme RADIUS 200 µm ve eşik 3 delik doldurmak 5000 µm², ayar boyutu -2 piksel, alanı en az 3.000 µm², kenar GCU, bölünmüş kapalı. Resmin tamamını yığında önizleme ve seçilen parametrelere pulcuklarının doğru algılamak kontrol edin.
6. Kırmızı maske (Annexin V) parametrelerini değiştirin. Tipik parametreler şunlardır: silindir şapkalı bölümleme RADIUS 150 µm ve eşik 2 delik doldurmak 5000 µm², ayar boyutu 0 piksel, alan dk 1000 µm², kenar GCU, bölünmüş kapalı. Resmin tamamını yığında önizleme ve seçilen parametrelere pulcuklarının doğru algılamak kontrol edin.
7. Analyzer'ı Başlat.
   1. Analizi yapıldıktan sonra faiz ölçümü ayıklayın. Parçalanmış dosya ve sonra Grafik ölçülerini seçeneği seçin. Faiz, tarama ve iyi ölçümleri seçin. Tipik olarak, aydınlık alan sınırları içinde toplam kırmızı ve yeşil yoğunluğu aydınlık alan maskesi (Şekil 3) kullanılarak belirlenen pulcuklarının sınırlarına floresans sinyalinin kısıtlayarak en doğru ölçümler vermek. Birkaç dosya biçiminde seçilen ölçümleri "Veriüzerinde" tıklatarak ayıklayın.
8. Resim ve film ayıklama analiz dosya seçerek devam edin ve görüntüleri dışa aktar ve film seçeneği seçin. İki seçenek kullanılabilir ya da "olarak düşsel bilgisayar yazılımı (genellikle bileşik görüntüler), her iki"olarak üçüncü bölümü yazılım aracılığıyla dış analiz için ham veri almak için depolanan"görülen"al resim ve film için olarak görüntülenir.

Sonuçlar

Şekil 1' de görüldüğü gibi bu akış sitometresi tarafından ifade CD19 arabanın T hücreleri (Şekil 1A) ve CD19 düzeyde HCT116 tümör hücre hatları (Şekil 1B) kontrol etmek önemlidir. Şekil 2 bir tipik küresel denemenin sonucu örneğidir. Otomatik görüntüleme cihazları dört farklı kanalları fotoğraf çeker: parlak alan, faz, yeşil ve kırmızı...

Tartışmalar

Gelecekteki kanser tedavisi doğrulamak için yenilikçi bir araç olarak pulcuklarının kullanımı son yıllarda giderek artan ilgi alanı haline gelmiştir. Pulcuklarının klasik 2D tüp bebek analiz ve içinde vivo değerlendirme arasında bir ara adım temsil eder. Yöntemi daha fazla söz⁷profil oluşturma gen yanı sıra mikro-çevre tümörü taklit eden açısından onların potens ile ilgili bir çok tutar. Bu yayında sunulan Protokolü Saheen adapte vd.¹¹

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Lot Number: RNBG7037
75 cm² growth area flasks	VWR	430639	Lot Number: 2218002
75 cm² growth area flasks	VWR	734-2705	Lot Number: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Lot Number: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL	Life Technology (Gibco)	21875-091	Lot Number: 1926384
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064	Lot Number: 08Q3066K
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Lot Number: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	Lot Number: 1886513
96 well plate, round bottom	VWR	734-1797	Lot Number: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fischer	11132D	-
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Lot Number: 8MB036
CTS Immune Cell Serum Replacement	Thermo Fischer	A2596102	Lot Number: 1939319
IL-2 Proleukin	Novartis		Lot Number: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent	Essen Bioscience	4641	Lot Number: 17A1025-122117
Reagent Reservoir	VWR	89094-672	Lot Number: 89094-672
15 mL tubes	VWR	734-1867	Lot Number: 19317044
anti-human CD19-PE	BD Biosciences	555413	Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-066-072	Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583
Streptavidin-PE	BD Biosciences	554061	Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line	ATCC	CCL-247	-
Incucyte S3	Essen Bioscience