Orta-den geçerek deneyleri Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için eleme-sinyal ve insan Sperm Acrosome reaksiyon

Özet

Burada, iki orta-den geçerek deneyleri Ca^{2 +}etkileri değerlendirilmesi için-sinyalizasyon ve acrosome tepki insan sperm olarak açıklanmıştır. Bu deneyleri bileşikler üzerinde Ca^{2 +}etkileri için büyük miktarda hızlı ve kolay bir ekran için kullanılabilir-insan sperm sinyal ve acrosome reaksiyon.

Özet

CA^{2 +}-sinyal normal sperm hücre işlevi ve erkek üreme için gerekli. Benzer şekilde, acrosome tepki zona pelusida nüfuz ve yumurtayı döllemek için insan bir sperm hücresi yetenek için çok önemlidir. Bu nedenle büyük ilgi için onların etkisi Ca^{2 +}bileşikleri (örneğin, çevresel kimyasal madde veya ilaç adaylarının) test etmek için-insan sperm sinyal ve acrosome reaksiyon ya insan sperm hücre işlevi üzerinde olası olumsuz etkileri incelemek için veya bir gebelik önleyici olarak olası bir rol araştırmak için. Burada, iki orta-den geçerek deneyleri açıklanmıştır: 1) bir floresan tabanlı tahlil Ca^{2 +}etkileri değerlendirilmesi için-insan sperm ve 2) bir görüntü sitometrik tahlil acrosome tepki insan sperm olarak değerlendirilmesi için sinyal. Bu deneyleri bileşikler üzerinde Ca^{2 +}etkileri için çok sayıda ekran için kullanılabilir-insan sperm sinyal ve acrosome reaksiyon. Ayrıca, deneyleri çok özel doz-yanıt eğrileri bireysel bileşiklerin oluşturmak, iki veya daha fazla bileşikler için potansiyel additivity/synergism belirlemek için ve eylem yoluyla rekabetçi inhibisyon farmakolojik modu çalışmaya kullanılabilir CatSper inhibitörleri ile deneyler.

Giriş

Burada açıklanan iki deneyleri amacı Ca^{2 +}etkileri incelemektir-sinyalizasyon ve acrosome tepki insan sperm için gösterildiği gibi çeşitli yayınlar bunlar istihdam içinde birden çok bileşikleri deneyleri^{1,2, 3,4,5,6,7}. CA^{2 +}-sinyalizasyon ve acrosome tepki hayati normal insan sperm hücre işlevi ve erkek üreme vardır.

Bir insan sperm hücre genel yumurtayı döllemek için hedeftir. Başarıyla ve doğal olarak yumurtayı döllemek için sperm hücre fonksiyonları sıkıca sperm hücresi ile kadın üreme sistemi^8,9yolculuk sırasında düzenlenmiş olması gerekir. Sperm hücresi işlevlerin çoğunu düzenlenmektedir intrasellüler Ca^{2 +}-konsantrasyon [Ca^{2 +}]¹⁰_ben (örneğin, sperm hareketliliği, kemotaksis ve acrosome reaksiyon). Ayrıca, sperm hücresi yumurtayı dölleme yeteneğine işler, capacitation denilen bir olgunlaşma sürecini kısmen düzenlenmiş tarafından [Ca^{2 +}]_ben¹⁰' dur. CA^{2 +}-ekstrüzyon Ca^{2 +}-ATPaz pompalar¹¹ korumak bir yaklaşık 20.000 kat Ca^{2 +}-bir dinlenme [Ca^{2 +}]_ben 50-100 nm ile insan sperm hücre zarı üzerinde gradyan. CA^{2 +} hücre zarı geçmeye izin verilip verilmediğini (örneğin, Ca^{2 +}delikten-kanalları), Ca^{2 +} bir büyükçe akını oluşur, sebebiyet veren [Ca^{2 +}]_benbir ayrıcalık. Ancak, sperm hücresi de intrasellüler Ca^{2 +}taşır-Ca^{2 +} serbest bırakabilirsiniz mağazaları ve bu nedenle, da vermek bir ayrıcalık yükselmesi [Ca^{2 +}]_ben¹²artış. İlginçtir, tüm kanal-aracılı Ca^{2 +}-akın insan sperm hücrelerinde CatSper (kediiyonik kanal SpeRM), sadece sperm hücresi¹¹' de gösterilen üzerinden gerçekleşmesi için defa bulunmuştur. İnsan sperm hücrelerinde CatSper endojen ligandlar progesteron ve prostaglandin ayrı ligand siteleri^13,14,15, bağlama aracılığıyla bir hızlı Ca^{2 +}için önde gelen harekete-akını içine sperm hücresi. İki ana kaynağı yumurta yakınındaki bu endojen ligandlar yüksek düzeyde sağlar. Progesteron¹⁶yüksek düzeyde içeren foliküler sıvı biridir. Foliküler sıvı olgun foliküller yumurta yumurtlama ve karışımları oviducts¹⁷içinde sıvı ile birlikte yayımlanır. Diğer ana yumurta surround ve progesteron ve prostaglandin yüksek düzeyde yayın kümülüs hücreleri kaynağıdır. Progesteron kaynaklı Ca^{2 +}-akın sperm hücresi içinde yumurta^9,18doğru kemotaksisi aracılık, sperm hareketliliği^19,20 kontrol ve acrosome teşvik gösterilen reaksiyon²¹. Bu bireysel [Ca^{2 +}]_benuyarının harekete geçirilmesine karşılık-düzenlenmiş sperm fonksiyonları doğru sırada ve doğru zamanda⁸yumurta döllenme için önemlidir. Bu, bir suboptimal progesteron kaynaklı Ca^{2 +}doğrultusunda-akın bulundu ilişkili olmak azaltılmış erkek üreme^{22,23,24,25,26 ,27,28,29} ve fonksiyonel CatSper erkek üreme^26,30,31,32için^{, temel 33,34,35,36}.

Sperm hücresi yumurtayı ulaştığı fertilizasyon oluştuğu için olaylar dizisi gerçekleşmesi gerekir: 1) sperm hücreleri çevreleyen kümülüs hücre katmanı nüfuz gerekir, 2) bağlamak için zona pelusida, 3) exocytose acrosomal içerik, sözde acrosome tepki ³⁷, 4) zona pelusida ve 5 nüfuz) sigorta fertilizasyon³⁸tamamlamak için yumurta membran ile. Bu adım adım gitmek ve yumurtayı döllemek muktedir, sperm hücresi ilk olarak sperm hücresi "decapacitating" faktörler³⁹ içeren meni bırakın ve dişi sıvı yüzmek başlar capacitation¹¹, geçmeleri gerekir üreme yolu düzeyi yüksek olan bikarbonat ve albümin³⁷. Capacitation hyperactivation, hareketliliği ile kamçı ve acrosome tepki³⁷dinç dayak şeklinde geçmesi mümkün sperm hücreleri oluşturur. Hyperactivated motilite zona pelusida⁴⁰penetrasyon için gereklidir ve acrosome bu penetrasyon süreci⁴¹yardım çeşitli hydrolytic enzimler içerir. Ayrıca, acrosome reaksiyonu sperm hücresi yumurta ile sperm yumurta füzyon⁴²için gerekli sperm yüzeyinde belirli zar proteinleri açarak eritme yeteneğine işler. Sonuç olarak, hyperactivation ve acrosome reaksiyon geçmesi yeteneği vardır ikisi de yumurta^40,42başarılı gübreleme için gereklidir. Ne için fare sperm hücresi^43,44,45görülmüştür aksine, acrosome olduğu gibi sadece insan sperm hücreleri zona pelusida⁴⁶için bağlayabilirsiniz. İnsan sperm hücreleri zona pelusida bağlı acrosome tepki zona pelusida⁴¹ nüfuz ve yumurta³⁸ile fusion için gerekli olan belirli zar proteinleri ortaya çıkarmak için geçmesi gerekmektedir. Zamanlaması acrosome tepki olarak insan sperm böylece fertilizasyon oluştuğu önemlidir.

CA^{2 +}yukarıda açıklandığı gibi-sinyal hayati için normal sperm hücre işlevi⁸ve bu nedenle, bileşenleri, Ca^{2 +}etkileri için çok sayıda ekran için büyük ilgi olduğunu-insan sperm hücreleri sinyal. Doğru zaman ve yerde acrosome tepki tabi sadece insan sperm hücreleri zona pelusida nüfuz ve yumurta^46,47döllemek benzer şekilde, aynı zamanda bileşiklerin onların yetenek-e doğru için test edebilmek için büyük ilgi olduğu insan sperm acrosome tepki etkiler. Bu amaçla, iki orta-den geçerek tarama deneyleri açıklanmıştır: etkileri üzerinde Ca^{2 +}1) bir tahlil-insan sperm hücreleri ve 2) bir tahlil acrosome tepki insan sperm hücrelerinde ikna yeteneği için sinyal.

Tahlil 1 olduğunu orta-den geçerek Ca^{2 +}-tahlil sinyal. Bu floresan plaka okuyucu tabanlı teknik Floresans zaman aynı anda birden fazla wells bir işlev olarak yapılan değişiklikleri izler. Ca^{2 +}-hassas floresan boya, Fluo-4 K_d Ca^{2 +}≈ 335 için vardır nM ve hücre-AM (acetoxymethyl) ester formunda permeant. Fluo-4 kullanarak, zamanla ve bileşikleri sperm hücresi ilgilendiren yanı sıra sonra [Ca^{2 +}]_i değişiklikleri ölçmek mümkündür. Tahlil Timo Strünker laboratuarda 2011¹³ tarafından geliştirilen ve beri ekran bileşikler için çeşitli çalışmalarda etkisi Ca^{2 +}için kullanılmıştır-insan sperm^1,2,3' te^{, sinyal 4,5}. Ayrıca benzer bir yöntem birden çok uyuşturucu adaylar⁴⁸ekran kullanılmaya başlanmıştır. Buna ek olarak, bu tahlil de farmakolojik modu eylem^1,2,3,4,5, doz-yanıt eğrileri^{1değerlendirmek için yararlı olduğunu, 2,3,4,5}, rekabetçi inhibisyon^1,2, additivity^1,2ve synergism³ bileşikler ilgi.

Tahlil 2 Orta-den geçerek acrosome tepki tahlil olduğunu. Bu görüntü sitometresi tabanlı teknik uygun miktarını ölçer acrosome tepki sperm hücresi üç floresan boyalar kullanarak bir örnek: propidium iyodür (PI), FITC birleştiğinde lektin Pisum sativum (FITC-PSA) ve Höchst-33342. Tahlil bir benzer Akış Sitometresi tabanlı yönteminden Zoppino vd.⁴⁹ tarafından değiştirildi ve kullanılmış içinde çeşitli çalışmalar^6,7. Gelince Ca^{2 +}-sinyal tahlil, bu acrosome tepki tahlil doz-yanıt eğrileri, inhibisyon, additivity ve synergism ilgi bileşiklerin değerlendirmek için de kullanılabilir.

Protokol

Toplama ve analiz protokolleri insan meni örnekleri Danimarka başkenti bölge araştırma Etik Komitesi kuralları takip eder. Tüm sperm örneği Onam sonra gönüllü bağış elde edilmiştir. Doğumdan sonra örnekleri tam anonimleştirilir. Onların rahatsızlık için her donör 500 DKK (yaklaşık $75 dolar) örnek başına bir ücret aldı. Örnekleri teslim günü analiz ve laboratuvar deneyleri hemen sonra yok etti.

Not: Orta verimi Ca^{2 +}-tahlil adım 4-5 ve 6 ile 7 orta üretilen iş acrosome tepki tahlil açıklanan sinyal. Protokol insan tubal sıvı (HTF⁺) orta hazırlamak için 1. adımda anlatılan ve arıtma sperm hücre deneyleri için 2-3 adımda anlatılan.

1. insan Tubal sıvı (HTF⁺) orta hazırlanması

Not: Kullanım hacimsel şişeler uygun ölçüde, bir 1 L ölçme silindir, bir manyetik karıştırıcı, Tablo 1 ' de listelenen gibi tuzları ve Tablo 2, arıtılmış su, 0.2 µm filtre ve 50 mL plastik tüpler gözenek.

1. Tuzları saf su (tablo 1) hisse senedi çözümleri hazırlayın.
   1. Tablo 1 ' de listelenen uygun büyüklükte volumetric flask için tuz miktarı eklenir, biraz aşağıda istenen birimin arıtılmış su ekleyin ve iyi bir manyetik karıştırıcı kullanarak karıştırın.
   2. Tuz tamamen çözüldüğünde, mıknatıs ve istenen son hacim için saf su ile doldurun kaldırın.
2. Hisse senedi çözüm için bir şişe aktarın ve kadar kullanmak depolayın.
   Not: Hisse senedi çözümleri devam etti ve daha uzun süreler için yeniden: glikoz ve HEPES-20 ° C'de ve oda sıcaklığında (RT) hisse senedi diğer çözümleri.
3. 1 L HTF⁺ orta hisse senedi Çözümleri (Tablo 2) hazırlayın.
   1. Tüm hisse senedi çözümler tamamen çözülmüş ve iyi karışık kullanmadan önce emin olun.
   2. Hisse senedi çözüm ve Tablo 2 ' ye 1 silindir ölçme L listelenen tuz miktarı eklenir ve 900 mL saf su ekleyin.
   3. İyi bir manyetik karıştırıcı kullanarak mix ve pH 7,35 NaOH çözüm için ayarlayın.
   4. Mıknatıs kaldırın ve 1000 mL saf su ekleyin.
4. Steril filtrate HTF⁺ orta bir 0.2 µm gözenek filtre, 50 mL plastik tüpler ve mağaza kullanımı kadar 4 ° C'de aliquot HTF⁺ orta aracılığıyla.
5. Sadece bir deney çalıştırmadan önce Na-pyruvate 165 µL 0,33 mM son Na pyruvate konsantrasyon almak için 50 mL aliquot ekleyin.
   Not: İnsan tubal sıvı orta de çeşitli ticari sağlayıcılarından edinilebilir. 4 mM HCO₃^- orta kullanırken, örnekleri ilave CO₂ pH büyük sürüklenir olmadan hava içinde olmadan bir kuluçka kapalı kapakları ile inkübe. CO₂ kuluçka kullanılabilir durumdaysa, Henderson-Hasselbalch denklemi kullanarak ve kullanılan CO₂ karşılık gelen tutarı hesaplanabilir. 25 mM HCO₃^- orta kullanıyorsanız, örnekleri CO₂ kuluçka açık kapakları ile CO₂ (genellikle % 5-10 arasında atmosferik basınç bağlıdır) karşılık gelen bir miktar içeren hava ile inkübe pH bir drift önlemek için. CO₂ tam miktarı Henderson-Hasselbalch denklemi kullanılarak hesaplanabilir.

2. hareketli Sperm hücresi Swim-up (Şekil 1) yolu ile saflaştırılması

Not: Temiz-geniş ağızlı plastik konteyner kullanmak için semen örneği, kuluçka, 50 mL plastik tüpler, 50 mL plastik tüpler 45 ° açı, HTF⁺ orta (hazırlanan adım 1 ya da elde edilen ticari sağlayıcısından), santrifüj ve insan serumu yerleştirmek için bir raf Albümin (HSA).

1. Mastürbasyon üretilen ve geniş ağızlı bir temiz plastik konteyner içine boşalmış bir taze bağışlanan insan meni örneği elde etmek. Sadece WHO laboratuvar kılavuzun muayene ve işleme, insan meni tarafından kurulan parametreleri yerine getirmek sperm örneği kullanın.
2. Örnek 37 ° C'de eritmek için 15-30 dakika izin vermek için kuluçkaya.
3. HCO₃^- 37 ° c ısı yukarıya HTF⁺ orta ile 4 mM 50 mL
4. Yer (sıvı arasında yüzey alanı artırmak için) 45 ° açıyla bir raf temiz 50 mL plastik tüplerde. Ham meni mL başına 1 tüp kullanın.
5. Önceden ısıtılmış HTF⁺ orta 4 mL her tüpler için ekleyin.
6. Dikkatli bir şekilde Önceden ısıtılmış HTF⁺4 mL içeren her tüpün dibine sıvılaştırılmış meni örneğinin 1 mL pipet. Serbest bırakmak-in hava kabarcıkları kaçının.
7. Kapakları kapatın ve tüpler için 1 h 37 ° C'de kuluçkaya.
8. Yavaşça Aspire edin ve üst kesir (HTF⁺ hareketli sperm hücreleri ile) daha fazla mümkün olduğunca bir yeni 15 mL plastik tüp için alt kesir (immotile ve ölü hücreleri ile meni) sıfırdan bulunur dikkat ederken aktarın. Genellikle, alt kesir bozmadan üst fraksiyonunun 3,5 mL aktarmak güvenlidir. Emme türbülans önlemek için daha büyük bir açıklık elde etmek için bir 45 ° açıyla en dıştaki 1-2 mm pipet ucu kesilmiş.
9. 15 mL plastik tüp hücreleri yıkamak ve tüp vasıl 700 x g RT., 10 dk santrifüj kapasitesi HTF⁺ ile doldurmak
10. Yavaşça Aspire edin ve süpernatant kaldırmak ve sperm hücresi Pelet HTF⁺2 mL resuspend.
11. İki küçük plastik tüpler sperm konsantrasyonu değerlendirilmesi için sperm süspansiyon 20 µL aktarmak (bkz. Adım 3).
12. 15 mL plastik tüp hücreleri yıkamak ve tüp vasıl 700 x g RT., 10 dk santrifüj kapasitesi HTF⁺ ile doldurmak
13. Yavaşça Aspire edin ve süpernatant kaldırmak ve sperm hücresi Pelet 10 x 10⁶ hücre/ml (2,11 adımda değerlendirilen hücre konsantrasyonu bağlı olarak) resuspend.
    1. Un capacitated sperm hücreleri kullanarak deneyler için (rutin Ca^{2 +}-tahlil sinyal)
       1. HTF⁺ hücrelerde 4 mM HCO₃ile^-resuspend.
       2. İnsan serum albumin (HSA) (100 mg/mL) 30 µL mL HTF⁺ 3 mg/mL nihai bir konsantrasyon almak için ekleyin.
       3. Kapakları kapatın ve 37 ° C'de s ≥1 için kuluçkaya
    2. Sperm hücresi (acrosome tepki tahlil) kullanarak deneyler için capacitated
       1. HTF⁺ hücrelerde 25 mM HCO₃ile^-resuspend.
       2. HSA (100 mg/mL) 30 µL mL HTF⁺ 3 mg/mL nihai bir konsantrasyon almak için ekleyin.
       3. Kapakları gevşek iliştirin ve CO₂ karşılık gelen miktarda 37 ° C'de ≥3 saatlerce kuluçkaya (bkz. Adım 1, genellikle % 5-10 CO₂arasında).

3. Sperm hücrelerinin sayma

Not: Sperm hücresi de el ile⁵⁰ veya kullanarak bir görüntü sitometresi⁵¹, burada açıklandığı şekilde sayılabilir. S100 arabellek, SP1 kasetli swim-up sperm hücresi (2. adımda hazırlanan) saf, bir görüntü sitometresi, bir vortexer kullanın.

1. 20 µL 10, 20, 30, 50 veya 90 (Pelet adım 2.10 el ile muayene tarafından değerlendirilen) beklenen konsantrasyon göre yuvarlak alt 2 mL tüp kullanarak S100 arabellekte bir faktör aliquot oranında seyreltin. (Yani, sonra yüzmek-up bekleniyor mL başına 15 x 10⁶ sperm hücreleri bir konsantrasyon sonra 20 µL sperm örneği ile 380 µL S100 arabelleği [seyreltme faktörü 20] seyreltik) kullanım için konsantrasyon en yakın seyreltme beklenen.
2. Mix 10 için iyi s maksimal 700 rpm bir girdap Mikser ile SP1-kaset örnek sokmak ve tamamen aspiratı örnek bir aliquot aşağı beyaz dalgıç kaset tuşuna basın.
3. Görüntü sitometresi açın, kaset tepsisine yerleştirin ve uygulamalı seyreltme faktörü (3.1. adımda seçilen) göre tahlil Sayısı, PI lekeli insan Sperm hücresi tahlil çalıştırın.
4. 3.1-3.3 ile ilk 20 µL örnekten elde edilen ölçülen konsantrasyonu en yakın bir seyreltme faktörü kullanarak, başka bir 20 µL örnek arasındaki adımları yineleyin.
5. İki ölçüm üzerinden ortalama sperm hücre konsantrasyonu hesaplayın.
6. Sperm hücre konsantrasyon toplam sperm hücre sayısı elde etmek için özgün birimi ile çarpın anlamına gelecektir (2. adımda bu özgün birim 2 mL'dir).

4. değişmek içinde ücretsiz intrasellüler Ca^{2 +}ölçümü-konsantrasyon ([Ca^{2 +}]_Ben) kullanarak Ca^{2 +}- fluorimetry (Şekil 2)

Not: Bir floresan plaka okuyucu, 384 çok iyi Kaplamalar, Fluo-4 kullanmak AM, yüzmek-up arıtılmış sperm hücresi (hazırlanan adım 2), faiz bileşikler de olumlu ve olumsuz olarak denetimleri, bir otomatik Tekrarlayıcı pipet ve 12 kanallı pipet.

1. 2 mM Fluo-4 hazırlamak AM hisse senedi 50 µg Fluo-4 şişe için Dimetil sülfoksit (DMSO) 22,7 µL ekleyerek AM ve tüp iyice karıştırın.
2. Bir aliquot 700 µL swim-up kurtarılan sperm süspansiyon (capacitated veya un capacitated olarak anahat içinde adım 2), yeni bir test tüpünde ekleyin. 700 µL sperm örneği bir satır (3 denetimleri ve 9 bileşikler birini içinde test etmek için kullanılır) 384-microwell plaka 24 Wells çözümlemek için gereken tutardır.
3. 3.5 µL Fluo-4 eklemek AM AM hisse senedi eriyik için 10 µM son bir konsantrasyon elde etmek için sperm süspansiyon 700 µL Fluo-4.
4. Örnek ışıktan korunan 37 ° C'de 45 dk için kuluçkaya.
5. Örnek vasıl 700 x g 10 dk santrifüj kapasitesi, Aspire edin ve aşırı Fluo-4 kaldırmak için süpernatant atın.
6. 5 x 10⁶ hücre/ml (yani, kullanım 2 adım 4.2 hücre süspansiyon hacmi x) lekeli Pelet HTF⁺ resuspend
7. Dilutions bileşikleri ve denetimlerin (Adım 4.4 ve 4.5, kuluçka ve Santrifüjü dönemlerde sırasıyla yapılabilir) hazırlayın.
   1. Bileşikleri, hem de negatif kontrol (araç ile tampon) ve HTF⁺olumlu bir denetimde (progesteron) oranında seyreltin. Adım 4.16 sperm hücreleri eklendiğinde seyreltilmiş 1:3 oldukları gibi bileşikler ve istenen son konsantrasyonu x 3 denetimlere oranında seyreltin.
   2. Dilutions tüplerini 4.16 adımda kullanılan 12 kanallı pipet pipet uçları arasındaki mesafe karşılık gelen borular arasında bir mesafe ile bir raf yerleştirin.
8. Bir otomatik Tekrarlayıcı pipet (24 adımlardan 50 µL) kullanın.
   1. Mix Fluo-4 sperm örneği yavaşça yukarı ve aşağı bir kez tüm tutarını pipetting tarafından lekeli.
   2. 50 µL aliquots 384-microwell plaka üst üste 24 kuyu ekleyin.
9. Bir floresan plaka okuyucu 30 ° C'de microwell tabak yerleştirin ve çekmeceyi kapat.
10. Uygun iletişim kuralını Fluo-4 için seçin. 480 nm, floresan ve kayıt emisyon 520, heyecanlandırmak nm. Mümkün olan en hızlı döngüsü saat ayarı ile kullanın.
    Not: İyi ve alt optik, başına en az 10 yanıp söner Mümkünse kullanın.
11. Bir de satır seçin ve kazanç % 20 hedef değerine ayarlayın.
12. Ölçüm başlatın.
13. Satır taban çizgisi ilk 5 döngüsü sırasında kontrol.
    1. Floresan okuma artıyor veya azalıyor zamanla, denemeyi durdurmak, kazanç yeniden düzenlemek ve deneme yeniden başlatın.
    2. Satır taban çizgisi çok üst üste bireysel kuyular arasında farklıysa, 4,8 adımda pipetting unprecise oldu ya örnek yeterince iyi pipetting önce karışık oldu değil. Deneme atın.
    3. Floresan okuma wells satır arasında karşılaştırılabilir ve sabit 5 ilk döngüsü sırasında ise, sonraki adıma geçin.
14. (Temel için kullanılan) 10 döngüsünden sonra deneme duraklatın.
15. Microwell plaka ile çekmece çıkarma.
16. 12 kanallı pipet (25 µL 2 adım), hızlı bir şekilde kullanarak bileşikler ve denetimlerden (Adım 4.7) bir satır 12 iyi çiftleri (24 kuyu) için hazırlanmış çözümler 25 µL ekleyin. Kuyuları zaten 50 µL lekeli sperm örneği içeren çözümler seyreltilmiş 1:3, olacaktır.
17. Ölçüm mümkün (eklenen bileşikler tarafından indüklenen herhangi bir floresan sinyallerini eksik önlemek için çekmece kapanacak otomatik olarak) ve denetimleri olarak hızlı bir şekilde devam edin. Değişiklikler floresan (ek bileşenleri ve denetimleri şimdi çekilecek sonra ΔF).
18. Floresan sinyallerini olumlu denetim ve faiz bileşikler kaydetmiş olduğunuz kadar deneme çalıştırın.
19. Denemeyi durdurup adım 5 olduğu gibi analiz etmek için ham Floresans veri verin.
    Not: Genellikle Fluo-4 AM kullanılan Ca^{2 +}-hassas fluorophore tahlil, ama diğer Ca^{2 +}-hassas fluorophores Ayrıca uyarma ve emisyon spectra ile floresan plaka okuyucu filtrelerde sığıyorsa kullanılabilir. Fluorophore seçime bağlı olarak, kazanç düzeyinde indüklenen floresan doruklarına alet ölçüm aralığı içinde nerede bir "güvenli" düzeyinde ayarlanmış olduğundan emin olun. Bu ionomycin belirli kazanç ayarı tek bir kuyuda ekleyerek test edilebilir. Bu eşiğin floresan bir sinyal indüklenen, kazanç alt ve yeniden deneyin. Bazı Pluronic F-127 Fluo-4^1,13yüklenmesini yardım etmek için kullanın, ancak bu gerekli²değil bulundu. Aynı anda Ölçülen satır maksimal sayısı iki faktöre bağlıdır. 1) araç döngü süresi: döngü süresi çok uzun ise, indüklenen Peaks'e [Ca^{2 +}]_ben kaçırmış. Aynı anda döngü süresi düşük tutmak için iki satır en fazla ölçün; 2) 4.16. adımda pipetting hızı: 12 kanallı pipet kullanarak, hızlı bir şekilde (örneğin, bir satır ile araç önceden inkübe ve önceden bir inhibitörü ile inkübe bir satır) 1 veya 2 satır 12 yinelenen wells (24 kuyu) 12 farklı çözümler eklemek mümkündür , indüklenen Ca^{2 +} peaks eksik olmadan. Ancak, pipetting ipuçları sayede indüklenen Ca^{2 +} peaks cevapsız iki sıralı pipetting adımları arasında değiştirilmesi gerekecektir 24 farklı çözümler eşzamanlı ölçmek, iki satır eklemek denemek için tavsiye edilmez.

5. Ca^{2 +}fluorimetry - gelen veri analizi

1. Elde edilen ve adım 4'te verilen ham Floresans veri açın.
2. Yinelenen kuyulardan ortalamasını hesapla. Yinelemeler arasında büyük farklılıklar varsa, verileri belirli kuyulardan atmak.
3. Temel 10 ilk devir tanımlayın.
4. ΔF/F₀ (%) hesaplamak yüzde olarak değişim floresan (ΔF) ek bileşenleri ve denetimleri ile ilgili 10 ilk döngüleri (temel) sırasında ortalama Bazal floresan (F₀) sonra zaman içinde.
5. Verileri doz-yanıt eğriler oluşturmak için kullanıyorsanız, kuyulardan pipetting eserler kaldırmak için diğer, negatif kontrol okuma çıkarma.

6. ölçüm Acrosome tepki

Not: Kullanmak bir görüntü sitometresi, kuluçka, floresan boyalar: PI, FITC-PSA ve Höchst-33342, pozitif ve negatif denetimlerin, 0,6 M NaHCO₃ ve distile suda %0,37 (v/v) formaldehit içeren bir immobilizing çözüm yanı sıra, faiz bileşikler bir A2 slayt ve capacitated yüzmek-up sperm hücresi (2. adımda hazırlanan) saf.

1. PI içeren bir boyama çözüm hazırlamak (5 µg/mL), FITC-PSA (50 µg/mL) ve Höchst-33342 (100 µg/mL) HTF⁺, iyi bir girdap Mikser kullanarak karıştırın ve ışıktan kadar kullanmak korumak.
2. Seyreltilmiş 1:10 adımda 6.5 oldukları gibi bileşikler ve denetimlerin çözümleri istenen son konsantrasyonu x 10 hazır olun. Her zaman bir negatif (araç) ve iki pozitif denetimi içerir: progesteron 10 µM son konsantrasyon ve ionomycin 2 µM son konsantrasyon.
3. Aliquots (2. adımda hazırlanan) capacitated sperm hücrelerinin 240 µL plastik tüpler aktarın.
4. Eriyik-e doğru her tüp boyama 30 µL ekleyin. Lekeleri son konsantrasyonu olacak: 0,5 µg/mL PI, 5 µg/mL FITC-PSA ve 10 µg/mL Höchst-33342.
5. Her tüpün 30 µL çözümleri denetimleri veya bileşikler ile eklemek (1:10 seyreltme).
6. Örnekleri karışımı yavaşça yukarı ve aşağı birkaç kez veya hafif vortexing pipetting. Mekanik stres nedeniyle aşırı karıştırma önlemek.
7. 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
8. Yeni plastik tüpler immobilizing çözümünün 0,6 M NaHCO₃ ve distile su, bir tüp başına %0,37 (v/v) formaldehit içeren 100 µL ile hazırlayın.
9. Kuluçka sonra örnekleri de pipetting tarafından mix ve bir tüp 100 µL immobilizing çözüm ile 50 µL test örneği ekleyin.
10. Bir A2 slayt odaları yüklemeden önce örnek de pipetting tarafından karıştırın. Odalar dikkatle hava kabarcıkları oluşturmadan yaklaşık 30 µL ile doldurun.
    Not: Kuluçka sırasında hareketli sperm hücresi eğilimindedir toplamak. (Onlar hariç olsa bile) hücre kümeleri ölçümleri rahatsız edemez. Bu nedenle, bir ayrıntılı karıştırma kuluçka sonra pipetting tarafından çok önemlidir. Aynı şekilde, hava kabarcıkları odalarında ölçümleri rahatsız edemez. Bu nedenle, Oda yavaş yavaş doldurun ve sıvı kenarlarını yaklaşık karşılamak ve bir hava kabarcığı oluşturmak istiyorsak pipet açısını değiştirmek.
11. Yüklenen slayt görüntü sitometresi tepsiye yerleştirin ve kapatmak belgili tanımlık tepsi.
12. FlexiCyte protokol ve basın Çalıştır seçin.
    1. FlexiCyte iletişim kuralı için aşağıdaki ayarları seçin: analitik kanal sayısı: 2; Kanal maskeleme: UV (LED365), bu görüntü segmentasyonu için; kullanılan kanal Kanal 1: Mavi (LED475), pozlama süresi 3.000 ms, emisyon filtre 560/35; Kanal 2: Yeşil (LED530), pozlama zaman 500 ms, emisyon filtre 675/75; En az analiz hücre sayısı: 5000; Birleştirilmiş hücreleri hariç: Evet.
13. Tüm örneklerini ölçülen kadar 6,9-6.12 tekrarlayın.

7. veri--dan imge Sitometresi Analizi

1. 6. adımda alınan açık verileri.
2. Ölçümler değerlendirmek için iki aşağıdaki araziler oluşturun.
   1. Bir dağılım çizim Höchst-33342 yoğunluk Höchst-33342 alan vs biexponential ölçekler üzerinde oluşturun. Bu kapı dışarı ya da çok küçük olan Höchst-33342 olumlu nesneler için kullanılan veya insan sperm hücreleri olmak çok büyük olabilir.
   2. Bir dağılım çizim FITC-PSA yoğunluğu ve PI yoğunluk biexponential ölçekler üzerinde oluşturun. Bu arsa kullanılabilir kıçlarını acrosome miktarda sperm hücresi tarafından Arsa (şekil 3) üzerinde dört gruba ayıran bir çeyreği kapı kullanımı tepki gösterdi: 1) bir PI pozitif ve olumlu FITC-PSA grubu: Acrosome tepki nonviable sperm hücresi; 2) bir PI negatif ve pozitif FITC-PSA grubu: Acrosome tepki sperm hücrelerin; 3) bir PI pozitif ve FITC-PSA grubu negatif: Acrosome sağlam nonviable sperm hücresi; ve 4) bir PI negatif ve FITC-PSA grubu negatif: Acrosome olduğu gibi canlı sperm hücresi.

Sonuçlar

Temsilcisi sonuçları pozitif (progesteron) ve negatif (arabellek) denetimi [Ca^{2 +}]_i ile birlikte 4 bileşikler (A, B, C ve D) etkisini orta-den geçerek Ca^{2 +}kullanarak insan sperm testi bir deneme-sinyal tahlil şekil 4agörülebilir. Şekil 4b', progesteron bir doz yanıt eğrisi, en yüksek ΔF/F₀ ile (%) elde gösterilir progesteron, seri olarak seyreltilmiş konsantrasyonları ta...

Tartışmalar

Tahlil Floresans tek microwells üzerinden tedavinin temel sinyal orta üretilen iş Ca^{2 +} yaklaşık 250.000 sperm hücreleri içeren. Yakalanan sinyal iyi tüm bireysel sperm hücrelerinden ortalama. Tahlil böylece sperm hücre [Ca^{2 +}]_ben özellikle neresinde hakkında bilgi kayma yok değişti, [Ca^{2 +}]_i bir değişiklik yer, ya da ne kadar türdeş olmayan yanıttır alır sperm hücrelerinin bir kısmı ne büyüklükte sağlar tek tek hücreleri arasında. Bu t...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm pore filter	Thermo Fisher Scientific, USA	296-4545
1 L measuring cylinder	Thermo Fisher Scientific, USA	3662-1000
1, 4, and 2 mL plastic tubes	Eppendorf, Germany	30120086 and 0030120094
12-channel pipette	Eppendorf, Germany	4861000813
384 multi-well plates	Greiner Bio-One, Germany	781096
15 and 50 mL platic tubes	Eppendorf, Germany	0030122151 and 30122178
A2-slide	ChemoMetec, Denmark	942-0001
Automatic repeater pipette	Eppendorf, Germany	4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)	Sigma-Aldrich, Germany	L0770
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific, USA	F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader	BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342	ChemoMetec, Denmark	910-3015
Human serum albumin (HSA)	Irvine Scientific	9988	For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer	ChemoMetec, Denmark	970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI)	ChemoMetec, Denmark	910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer	ChemoMetec, Denmark	910-0101
SP1-cassette	ChemoMetec, Denmark	941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer